李亞玲 趙玉潔 謝鳳行 周 可 張峰峰

摘要:以枯草芽孢桿菌H4為試驗(yàn)材料,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法,對(duì)影響菌體生長(zhǎng)的7個(gè)因素進(jìn)行了篩選,確定影響該菌生長(zhǎng)的主要因素為牛肉膏、轉(zhuǎn)速、蛋白胨和NaCl;采用響應(yīng)面分析法對(duì)其中3個(gè)重要因子的最佳水平進(jìn)行研究。結(jié)果表明,當(dāng)牛肉膏為8.635 g/L,蛋白胨為13.737 g/L,NaCl為5.345 g/L,接種量6.25%,初始pH7,溫度39 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)時(shí),菌體密度顯著提高,菌株H4的OD460值由0.899提高到了1.129。

關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌;Plackett-Burman設(shè)計(jì);響應(yīng)面分析法;優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào):Q939.124文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.04.007

Optimization of Growth Conditions of Bacillus Subtilis H4

LI Ya-ling,ZHAO Yu-jie,XIE Feng-xing,ZHOU Ke,ZHANG Feng-feng

(Tianjin Research Center of Agriculture Biotechnology,Tianjin 300192,China)

Abstract:A strain of Bacillus subtilis H4 was isolated from the mud of pound, and the Plackett-Burman design was used to study the 7 factors influencing the growth of Bacillus subtilis H4. The results showed that beef extract, rotational speed, peptone and NaCl were the main factors. Response surface methodology was also used to research the optimization for the 3 main factors, and the results indicated that the concentration of Bacillus subtilis H4 was significantly increased and the OD460 of the broth increased from 0.899 to 1.129 under the condition of beef extract 8.635 g/L, peptone 13.737 g/L, NaCl 5.345 g/L, inoculation 6.25%, initial pH7, temperature 39 ℃ and rotational speed 150 r/min.

Key words: Bacillus subtilis;Plackett-Burman design;response surface method;optimization

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展和集約化經(jīng)營(yíng)程度的不斷提高,養(yǎng)殖水體污染日趨嚴(yán)重,許多養(yǎng)殖池中有害藻類(lèi)及病菌大量繁殖,水質(zhì)條件不斷惡化,其后果影響到了水產(chǎn)品安全和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。利用常規(guī)藥物防治方法,不但易加重水質(zhì)惡化程度,成本也較高,而利用微生物制劑改善養(yǎng)殖水體環(huán)境受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[2,3]?？莶菅挎邨U菌是一種好氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[4],在自然界廣泛存在,生命力極強(qiáng),代謝旺盛,對(duì)人畜無(wú)害,不污染環(huán)境,具有廣譜的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力[5-7]?？莶菅挎邨U菌能有效的降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽和硫化物[8-10],達(dá)到凈化水質(zhì)的目的。因此,枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖水體的生物修復(fù)方面得到了廣泛的應(yīng)用。

用枯草芽孢桿菌H4發(fā)酵后經(jīng)離心的菌體處理模擬養(yǎng)殖水,結(jié)果表明,H4能有效降解水體中的亞硝酸鹽、氨氮,使水體中溶解氧含量逐漸升高。因此,菌體濃度是影響水體凈化效果的主要因子之一。鑒于培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響,有必要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,以獲得較高的含菌量。本試驗(yàn)采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的相關(guān)影響因素進(jìn)行了研究,以期從眾多影響因素中快速有效地篩選出主要的影響因子,通過(guò)回歸各因素水平及其相互作用與響應(yīng)值之間關(guān)系的二次多項(xiàng)式,對(duì)各因子進(jìn)行優(yōu)化,確定較優(yōu)的發(fā)酵條件,為后續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)和微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材 料

菌株:枯草芽孢桿菌H4為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

培養(yǎng)基:(1)液體培養(yǎng)基蛋白胨、牛肉膏、NaC1質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、0.5%、0.5%,pH7.2～7.4;(2)固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂。培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)高壓1×105 Pa 滅菌20 min后,無(wú)菌分裝備用。

1.2培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載[11]以及本實(shí)驗(yàn)室對(duì)枯草芽孢桿菌的前期研究,本次試驗(yàn)選取牛肉膏、蛋白胨、NaC1等培養(yǎng)基成分和溫度、pH值、接種量、轉(zhuǎn)速7個(gè)因素作為考察對(duì)象,并以枯草芽孢桿菌的菌體濃度為響應(yīng)值,采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選菌體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。通過(guò)響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì),對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究,根據(jù)試驗(yàn)值得到各因素水平及其相互作用與響應(yīng)值之間關(guān)系的二次多項(xiàng)式,通過(guò)回歸此式對(duì)各因子進(jìn)行優(yōu)化,以獲得該菌生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)條件。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定重要因子

用MINITAB軟件創(chuàng)建一個(gè)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素取兩個(gè)水平,其中X3、X6、X9為空項(xiàng)用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)表考察了7個(gè)因素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表2,牛肉膏、轉(zhuǎn)速、蛋白胨和NaCl是主要影響因素,溫度、pH和接種量的重要性相對(duì)較小一些。轉(zhuǎn)速反映的是溶解氧含量的高低,溶氧含量的影響將在以后的發(fā)酵罐中進(jìn)行測(cè)定。因此,搖瓶試驗(yàn)選定牛肉膏、蛋白胨和NaCl 3個(gè)因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。其余各因素的水平在后續(xù)試驗(yàn)中的調(diào)整如下:接種量6.25%,pH7,溫度39 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min。

2.2最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域

Plackett-Burman試驗(yàn)回歸分析確定牛肉膏、蛋白胨和NaCl為重要因素,且這3種組分對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)均是正影響,增加牛肉膏、蛋白胨和NaCl的濃度,考察發(fā)酵液OD值的變化趨勢(shì),逼近最大響應(yīng)區(qū)域。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果列于表3。

對(duì)于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng),溫度、pH值、轉(zhuǎn)速和接種量均固定在中心點(diǎn)的水平上。牛肉膏、蛋白胨和NaCl濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)有積極的影響。表3列出了濃度改變的方向,即牛肉膏以濃度4.5 g/L為起點(diǎn),蛋白胨以9.0 g/L為起點(diǎn),NaCl以4.25 g/L為起點(diǎn),分別依次增加0.5個(gè)單位。從表3中可以清楚地看出,處理6的OD值達(dá)到最大為1.035,隨后開(kāi)始下降。因此,接下來(lái)的優(yōu)化試驗(yàn)應(yīng)該在處理6附近進(jìn)行。

2.3響應(yīng)面分析法(RSA)確定最大響應(yīng)值

最后采用響應(yīng)面分析法對(duì)牛肉膏、蛋白胨和NaCl的濃度進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用中心組合設(shè)計(jì),響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)的因子及水平見(jiàn)表4,試驗(yàn)結(jié)果列于表5。

通過(guò)MINITAB軟件的響應(yīng)面回歸過(guò)程對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,建立二次響應(yīng)面回歸模型,并進(jìn)而求解最優(yōu)響應(yīng)因子水平。經(jīng)過(guò)整理,所得的分析結(jié)果見(jiàn)表6。試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合所得二次多項(xiàng)式方程為:

y=1.033 00+0.036 36X1+0.029 84X2+0.001 18 X3-0.014 17X12-0.009 22X22-0.004 44X32-0.014 38 X1X2-0.004 12X1X3-0.003 62X2X3

此方程二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值,拋物線的開(kāi)口向下,因而有極大值點(diǎn)。模型的完備性可由方差分析及決定系數(shù)兩方面考察,方差分析表明:F回歸=33.14>F9,10,0.01=4.95,表明模型在α=0.01水平上回歸顯著。決定系數(shù)R2=0.968,表明模型能解釋96.8%菌液生長(zhǎng)OD值的變化,回歸擬合程度較好。方程給枯草芽孢桿菌的發(fā)酵提供了一個(gè)合適的模型。利用MINITAB軟件繪出了計(jì)算的三維響應(yīng)面,證實(shí)了擬合面有真實(shí)的最大值,見(jiàn)圖1。

對(duì)方程進(jìn)行求導(dǎo),可以得到模型的極值點(diǎn)為牛肉膏8.635 g/L,蛋白胨13.737 g/L,NaCl 5.345 g/L,此時(shí)模型預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)OD值為1.087。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,以該最佳工藝條件進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表7。由結(jié)果可知,試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差小于5%,證明此模型有效,可用方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)枯草芽孢桿菌H4的培養(yǎng)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

3結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法,用較少的試驗(yàn)得到與實(shí)際擬合程度較高的模型。培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果為:牛肉膏8.635 g/L,蛋白胨13.737 g/L,NaCl 5.345 g/L,接種量6.25%,初始pH7,溫度39 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min。此時(shí)模型預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)OD值為1.087。在此優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),菌株H4的OD值為1.129,比優(yōu)化前的0.899提高了25.6%,菌數(shù)由9.6×108 cfu/mL提高到1.5×109 cfu/mL,芽孢數(shù)由3.8×106 cfu/mL提高到4.5×107 cfu/mL。本試驗(yàn)積累的技術(shù)參數(shù),為以枯草芽孢桿菌為主的微生態(tài)制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

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