趙 新 王 永 蘭青闊 朱 珠 程 奕

摘要:為建立一種利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)和鑒定沙門氏菌(Salmonellla spp)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的方法,根據(jù)沙門氏菌侵襲力蛋白A基因(invA gene)、單核細(xì)胞增生李斯特菌蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因(prfA gene)、金黃色葡萄球菌自溶素基因(alt gene)、蠟樣芽孢桿菌的促旋酶B亞單位基因(gyrB gene)設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,并對(duì)多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上建立了4種致病菌的多重PCR檢測(cè)體系,同時(shí)以國(guó)標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。結(jié)果表明,本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高,具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:食源性致病菌;多重PCR;檢測(cè)

中圖分類號(hào):TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.06.002

Study and Application on Detection of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria by Multiplex PCR

ZHAO Xin, WANG Yong, LAN Qing-kuo, ZHU Zhu,CHENG Yi

(Central Lab,Tianjin Academy of Agricultural Sciences,Tianjin 300381,China)

Abstract:In order to establish a rapid, sensitive and specific detection method for identification of four kinds of food-borne pathogenic bacteria including Salmonellla spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus by using multiplex PCR, according to invasion protein A gene(invA gene)of Salmonellla spp, transcriptional regulatory protein gene (prfA gene) of Listeria monocytogenes, autolysin gene (alt gene) ofStaphylococcus aureus and gyrase B subunit gene (gyrB gene) of Bacillus cereus, four pairs of specific primers were designed for multiplex PCR amplification. The multiplex PCR system and conditions of the amplification were optimized to make four kinds of food-borne pathogens have better amplification results. The results showed that the multiplex PCR method was rapid, specific and sensitive compared with national standard method. The multiplex PCR method developed in this study could provide an informative supplement to conventional microbiological methods for routine monitoring of food.

Key words:food-borne pathogenic bacteria; multiplex PCR; detection

農(nóng)產(chǎn)品在采集、加工、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)容易受到微生物的污染,因此,微生物檢測(cè)是農(nóng)產(chǎn)品及其加工品衛(wèi)生檢測(cè)中的一項(xiàng)重要內(nèi)容,而食源性致病菌檢驗(yàn)是微生物檢驗(yàn)的重中之重,關(guān)系到消費(fèi)者的生命財(cái)產(chǎn)安全[1]。

致病菌是能夠引起人類及動(dòng)物發(fā)生疾病、造成生命和財(cái)產(chǎn)巨大損失的一群微生物(主要是細(xì)菌),其中最為典型的致病菌是沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、空?qǐng)鰪澢鷹U菌和蠟樣芽胞桿菌[2,3],而包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家對(duì)這些致病菌的檢驗(yàn)大多沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定方法,檢驗(yàn)步驟繁瑣,檢驗(yàn)周期長(zhǎng),同時(shí)對(duì)于有些細(xì)菌仍無(wú)法給出正確的鑒定,不符合農(nóng)產(chǎn)品及加工品現(xiàn)代檢測(cè)要求[4]。

本研究旨在利用多重PCR技術(shù)建立同步檢測(cè)和鑒定沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌等主要食源性致病菌的快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的方法,以期克服傳統(tǒng)致病微生物檢測(cè)方法的諸多缺點(diǎn),得到與國(guó)標(biāo)方法一致的檢測(cè)結(jié)果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株的選擇與培養(yǎng)乙型副傷寒沙門氏菌CMCC(B)50094、單核增生李斯特氏菌CMCC(B)54003、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、蠟樣芽胞桿菌CMCC(B)63301均為本室保存。菌株復(fù)蘇后接種于相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑和儀器PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶、dNTP、Mg2+等購(gòu)自Promega公司,高速冷凍離心機(jī)為Backman公司產(chǎn)品,凝膠電泳設(shè)備為BIO-RAD Power200及Power1000,PCR擴(kuò)增儀為Thermo PX2,凝膠成像系統(tǒng)為SYNGENE公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)沙門氏菌invA靶基因、單核增生李斯特菌prfA靶基因、金黃色葡萄球菌alt基因、蠟樣芽胞桿菌gyrB的基因序列,設(shè)計(jì)出擴(kuò)增這4種致病菌特異性核酸片段的PCR引物,引物設(shè)計(jì)情況見(jiàn)表1。

1.2.2細(xì)菌DNA的提取取過(guò)夜菌液2 mL,13 200 r/min離心5 min,棄上清。沉淀中加入567 μL TE緩沖液,30 μL 10%SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K,混勻后37 ℃溫育1 h。加入80 μL CTAB/NaCl和100 μL 5 moL/L NaCl,65 ℃,10 min。加入等體積氯仿異戊醇混勻,13 200 r/min離心10 min,取上清液加等體積酚/氯仿,13 200 r/min離心5 min,取上清液加0.6倍異丙醇,離心70%乙醇洗沉淀,待沉淀自然風(fēng)干加50 μL去離子水溶解,備用。

1.2.3多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化分別以4種菌的DNA為模板,對(duì)PCR反應(yīng)條件優(yōu)化。循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性7 min,94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)退火溫度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶濃度、dNTPs濃度對(duì)PCR結(jié)果影響較大,因此,對(duì)反應(yīng)體系中這些重要參數(shù)需進(jìn)行多重PCR優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4靈敏性試驗(yàn)將4種菌的DNA做10倍遞增稀釋,并采用上述PCR方法擴(kuò)增,觀察靈敏度。

1.2.5添加靈敏度實(shí)驗(yàn)取經(jīng)高溫滅菌的牛奶樣品各6 mL,分別同時(shí)接種1,10,100 CFU/mL的4種菌懸液各1 mL,同時(shí)以不接種病原菌的牛奶作陰性對(duì)照,加入90 mL優(yōu)化培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)14 h。取2 mL增菌液提取DNA進(jìn)行多重PCR檢驗(yàn)。

1.2.6多重PCR方法和國(guó)標(biāo)方法對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的比較對(duì)30份生鮮牛乳、30份奶牛場(chǎng)土壤樣品及22份市售散裝茶葉樣品同時(shí)應(yīng)用多重PCR和國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單核增生李斯特氏菌的DNA為模板對(duì)PCR退火溫度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶濃度、dNTPs濃度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)條件為:10×PCR緩沖液2.5 μL,Mg2+濃度2.4 mmol/L, Taq酶濃度6 U,600 μmol/L dNTPs。引物濃度為:沙門氏菌80 nmol/L、單核增生李斯特氏菌80 nmol/L、金黃色葡萄球菌80 nmol/L、蠟樣芽胞桿菌160 nmol/L。循環(huán)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性7 min,94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min,優(yōu)化后電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2靈敏性試驗(yàn)

將供試菌株DNA經(jīng)10倍梯度稀釋后,在上述優(yōu)化的多重PCR條件下,檢測(cè)沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌DNA的敏感性分別為3.13,2.88,9.98,24.2 ng,見(jiàn)圖2。

M:DL2 000;1～7:沙門氏菌DNA質(zhì)量依次為313 ng,31.3 ng,3.13 ng,313 pg,31.3 pg,3.13 pg,313 fg;李斯特菌DNA質(zhì)量依次為288 ng,28.8 ng,2.88 ng,288 pg,28.8 pg,2.88 pg,288 fg;金葡DNA質(zhì)量依次為99.8 ng,9.98 ng,998 pg,99.8 pg,9.98 pg,998 fg,99.8 fg;蠟樣DNA質(zhì)量依次為242 ng,24.2 ng,2.42 ng,242 pg,24.2 pg,2.42 pg,242 fg

圖2 多重PCR檢測(cè)靈敏度

2.3添加靈敏度實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可以看出,多重PCR檢測(cè)人為接種沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌的牛奶樣品敏感性可達(dá)到0.1 CFU/mL,金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌的牛奶樣品敏感性可達(dá)到1 CFU/ mL,見(jiàn)圖3。

1:空白對(duì)照;2:陰性對(duì)照;3:陽(yáng)性對(duì)照;4～6:牛奶同時(shí)含沙門菌、金葡菌、李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌菌量依次為0.1,1,10 CFU/mL:M:DL2 000

圖3 人為接種病原菌牛奶樣品的多重PCR檢測(cè)敏感性

2.4多重PCR法和國(guó)標(biāo)方法對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果比較

如表2所示,在所檢測(cè)的82份樣品中,國(guó)標(biāo)方法和本研究所建立的方法均檢出41份沙門菌陽(yáng)性、63份金黃色葡萄球菌陽(yáng)性、12份李斯特氏菌陽(yáng)性、12份蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性,結(jié)果完全一致。

3結(jié)論

多重PCR引物設(shè)計(jì)過(guò)程中不僅要考慮其特異性,而且要盡量使多對(duì)引物的退火溫度一致,并且避免同對(duì)引物或多對(duì)引物之間形成引物二聚體。本試驗(yàn)在引物設(shè)計(jì)時(shí)使各引物的退火溫度保持在53 ℃左右,4對(duì)引物之間不存在3′端配對(duì),并盡可能地減少引物之間多個(gè)連續(xù)堿基的同源性,相對(duì)減少了引物二聚體的出現(xiàn)機(jī)率[5]。在多重PCR反應(yīng)中,由于金黃色葡萄球菌擴(kuò)增片段較大,相對(duì)不易擴(kuò)增,采用降低退火溫度、增加循環(huán)參數(shù)的方法,可有利于大片段引物的擴(kuò)增[6]。

本研究建立的多重PCR方法將傳統(tǒng)方法中大量的生化試驗(yàn)轉(zhuǎn)化為一次性擴(kuò)增,具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等特點(diǎn),便于批量檢測(cè),而常規(guī)培養(yǎng)方法需要7 d或更長(zhǎng)的時(shí)間,不宜大批量操作,因此,使用本方法做樣品初篩,結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可大大縮短檢測(cè)周期,降低檢驗(yàn)成本,更加適應(yīng)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速反應(yīng)的需要,更加符合農(nóng)產(chǎn)品及加工品現(xiàn)代檢測(cè)的要求。

參考文獻(xiàn):

[1] 劉家發(fā),朱建如.食品安全存在的問(wèn)題及對(duì)策[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué),2005,16(6):35-38.

[2] 趙志晶,劉秀梅.食品樣品中大腸桿菌O157:H7復(fù)合PCR檢測(cè)方法的研究[J].衛(wèi)生研究,2004,33(6):716-719.

[3] Barbara M L, Tony C B, Grahame W G. The microbiological safety and quality of food[M]. Gaithersburg, Maryland, USA: Aspen publishers, 2000:374-886.

[4] 王永,趙新,蘭青闊,等.四種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測(cè)技術(shù)研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,15(1):13-15.

[5] Henegariu O, Heerema N A, Diouhy S R, el al. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol[J].BioTechniques, 1997, 23:504-511.

[6] 夏穎哲,張春光,陳宜瑜,等. 福爾馬林保存魚(yú)類標(biāo)本中大片段DNA的提取[J].水生生物學(xué)報(bào),2007,31(4):485-491.