白玉紅　陳小帆　于海威　韓　慧

[摘要] 目的:建立痔特佳片微生物限度檢查方法,并對方法進行驗證。方法:采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法。結果:痔特佳片用培養(yǎng)基稀釋法進行微生物限度的細菌檢查。結論:確立了微生物限度檢查方法,保證微生物限度檢查方法的有效性。

[關鍵詞] 痔特佳片;微生物限度檢查;方法驗證

[中圖分類號]R286[文獻標識碼]B [文章編號]1674-4721(2009)07(b)-136-02

痔特佳片是由槐角(炒),地榆炭、黃芩、當歸、枳殼、防風、鞣質(zhì)等8種成分組成的中藥復方制劑。其質(zhì)量標準中未列微生物限度的檢查方法。本文按照《中國藥典》2005年版[1]和中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[2]及有關文獻[3-5],建立了痔特佳片微生物限度檢查方法,方法經(jīng)驗證有效可行。

1 材料

1.1培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基,營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,改良馬丁培養(yǎng)基(中國藥品生物制品檢定所提供)。稀釋劑為0.9%滅菌氯化鈉溶液,pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液(本所配置)。

1.2 藥品

痔特佳片(營口宏生藥業(yè)有限公司,批號:20060117)。

1.3菌種

大腸埃希菌[CMCC(B)44102],金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501],白色念球菌[CMCC(F)98001],黑曲霉菌[CMCC(F)98003],由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 試驗部分

2.1菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,35～37℃培養(yǎng)18～24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,23～28℃培養(yǎng)24～48 h。再分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每毫升含50～100 cfu的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,23～28℃培養(yǎng)5～7 d,使大量的孢子產(chǎn)生,加入3～5 ml的0.9%無菌氯化鈉溶液,孢子洗脫,吸出孢子菌液至滅菌試管內(nèi),稀釋至每毫升含50～100 cfu的菌懸液。

2.2 供試液的制備

取供試品10 g,加稀釋劑100 ml,制成1∶10供試液備用。

2.3試驗方法

2.3.1常規(guī)法:采用1 ml/皿的供試液。

2.3.2培養(yǎng)基稀釋法:采用0.2 ml/皿的供試液。

2.4回收率測定(驗證試驗分4組,至少應進行3次獨立的平行試驗,并分別計算各次試驗的菌回收率)

2.4.1試驗組:取1∶10的供試液和試驗菌液各1 ml,分別注入兩個平皿,立即注入45℃的融化的相應的培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml,搖勻,凝固后,將平板倒置于規(guī)定的溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間,做菌落計數(shù)。

2.4.2菌液組:取上述試驗菌液,測定其加入的試驗菌菌數(shù)。

2.4.3供試液對照組:測定供試品本底菌數(shù)。

2.4.4稀釋劑對照組:用相應的稀釋劑代替供試品,加入試驗菌液,使最終菌濃度為1 ml含50~100 cfu,按試驗組的供試液制備方法和菌數(shù)計數(shù)方法測定其菌數(shù)。

2.4.5結果判斷:實驗組和稀釋劑對照組的菌回收率均應不低于70%。

3 試驗結果

4 討論

根據(jù)結果判斷,從表1可見,稀釋劑的菌回收率均在70%以上。從表2可見,痔特佳片用常規(guī)法,金黃色葡萄球菌的回收率低于70%,說明該樣品對金黃色葡萄球菌有抑菌作用,但用培養(yǎng)基稀釋法,五種菌的回收率均高于70%。因此,可用培養(yǎng)基稀釋法進行痔特佳片的微生物限度檢查。

操作過程的各環(huán)節(jié)對回收率有影響。應注意培養(yǎng)基溫度,建議用水浴保溫效果好。菌落計數(shù)誤差對驗證方法的影響:當細菌生長小而密集時,極易產(chǎn)生計數(shù)誤差,故菌落計數(shù)時應仔細觀察,必要時借助放大鏡或低倍顯微鏡,如難區(qū)別,可適當延長培養(yǎng)時間。

[參考文獻]

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:化學工業(yè)出版社.2005:一部附錄71-78,二部附錄93-101.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:二部325-331.

[3]馬越,特玉香.16種中成藥微生物限度檢查法方法驗證[J].中國藥品標準,2005,6(6):356-359.

[4]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京:科學出版社,2000:61-65.

[5]王知堅,邵惠琴,杜蕓,等.藥品微生物限度檢查法有效性驗證實驗研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學雜志,2004,21(3):211-213.

(收稿日期:2009-04-22)