劉慶新　陳金波　朱玉紅　張合亮

【摘要】目的研究高血壓腦出血患者血腫周圍腦組織缺氧誘導(dǎo)因子-la(Hypoxia inducihlefactor 1，HIF-la)的表達(dá)與腦水腫形成的關(guān)系。方法選擇行高血壓性腦內(nèi)血腫清除術(shù)治療的腦出血患者32例，選取手術(shù)過程中獲得的血腫周圍腦組織，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)測定缺氧誘導(dǎo)因子一la及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)。根據(jù)頭顱cT測量血腫周圍腦水腫帶的大小，用雙盲法對染色結(jié)果及腦水腫的體積進(jìn)行分析。結(jié)果出血4 h后，血腫周圍腦組織即可見散在HIF-la表達(dá)的神經(jīng)元[(2.8±0.8)個／高倍視野]，24～48 h時達(dá)到高峰[(12.5±3.9)個／高倍視野]，48～72 h高表達(dá)持續(xù)存在[(12.2±1.8)個／高倍視野]；HIF-la的表達(dá)與VEGF(r=0.76，t=6.37，P＜0.01)、腦水腫體積(r=0.64，t=4．56，P＜0.01)成正相關(guān)性。結(jié)論高血壓腦出血血腫周圍組織HIF-la的表達(dá)與腦水腫的形成有關(guān)，HIF-la可能通過誘導(dǎo)、調(diào)控VEGF的表達(dá)促進(jìn)腦水腫的形成。

【關(guān)鍵詞】腦出血；腦水腫；缺氧誘導(dǎo)因子-1a；血管內(nèi)皮生長因子

研究表明，多種因素參與了腦出血后血腫周圍腦水腫的形成，其中血腦屏障結(jié)構(gòu)功能的變化是腦水腫病理變化的重要環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的維持、腦水腫的形成關(guān)系密切，而缺氧誘導(dǎo)因子-la(HIF-la)是氧調(diào)控信息傳遞通路中的重要因子，可誘導(dǎo)、調(diào)控VEGF的表達(dá)。為了探討高血壓腦出血患者血腫周圍腦組織HIF-la的表達(dá)與腦水腫形成的關(guān)系，筆者利用免疫組織化學(xué)技術(shù)測定血腫周圍組織HIF-la及VEGF的表達(dá)，并對其與腦水腫體積進(jìn)行相關(guān)分析。

1資料與方法

1．1病例與組織標(biāo)本

選自2002年9月至2005年3月住院行高血壓性腦內(nèi)血腫清除術(shù)治療的腦出血患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合1995年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的高血壓腦出血診斷要點(diǎn)，均經(jīng)腦cr或Mill證實(shí)。一側(cè)腦基底節(jié)區(qū)出血，出血量45～85 ml，年齡35～75歲，發(fā)病72 h內(nèi)住院治療。根據(jù)以上原則，共收集腦出血患者32例(其中男2l例，女11例)，年齡(55.6±10.2)歲，出血量45～85(60.0±9.3)ml，出血時間4～60(27.8±15.2)h。手術(shù)均采用非功能區(qū)入顱方式，選取手術(shù)過程中切除的少許血腫周圍腦組織作為研究標(biāo)本。根據(jù)發(fā)病到手術(shù)時間分為三組：第一組為出血后24 h以內(nèi)，第二組為腦出血后25～48 h，第三組為腦出血后49～72 h。手術(shù)步驟：取外側(cè)裂下方直切口，長約5cm，成骨窗直徑為2.5～3.0 cm。星形剪開硬膜，顯露顳中回及部分顳上、下回。雙極電凝點(diǎn)灼顳中回皮層血管妥善止血，切除部分顳中回皮層，向血腫方向繼續(xù)吸除部分腦組織至血腫腔，緩慢吸出積血、凝血塊。出血量較大，腦組織腫脹明顯，中線結(jié)構(gòu)明顯移位，患者已腦疝的，將Labbe氏靜脈以前顳葉腦組織全部切除，行內(nèi)減壓術(shù)。選取手術(shù)過程中切除的少量顳中回腦組織，距血腫多為3～4cm左右，不違反倫理道德，所取標(biāo)本立即浸入4％的多聚甲醛中固定，5 μm厚連續(xù)石蠟切片。

1．2免疫組織化學(xué)染色

采用兔抗人血管內(nèi)皮生長因子多克隆抗體和鼠抗人缺氧誘導(dǎo)因子-la多克隆抗體(購自武漢博士德生物有限公司)，分別進(jìn)行免疫組化染色。陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色。

1．3腦水腫大小的測量

所有患者手術(shù)前均經(jīng)腦CT檢查，有2名醫(yī)生根據(jù)多田式[體積(ml)=π／6×長(cm)×寬(cm)×層面(cm)]計算病灶體積(包括血腫和周圍水腫)及血腫量。血腫周圍腦水腫體積(ml)=病灶體積一血腫體積。

1．4統(tǒng)計學(xué)方法

采用HPIAS圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析處理，在目鏡10倍、物鏡20倍下計數(shù)5個測試窗陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。HIF-la表達(dá)量與腦水腫體積及VEGF的相關(guān)性分析采用直線相關(guān)回歸分析。應(yīng)用四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室的PEMS 3．1 forWindows軟件包進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1 HE染色示神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化

出血4～12 h，血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，小血管內(nèi)可見到中性粒細(xì)胞靠邊和貼壁現(xiàn)象，出血24～72 h可見神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)嗜酸變性，胞核固縮，血管周圍腦組織白細(xì)胞浸潤明顯，見圖1。

2．2血腫周圍腦組織HIF-1a的表達(dá)與腦水腫的關(guān)系

腦出血后4 h血腫周圍腦組織即可見散在的HIF-la表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)為(2.8±0.8)個／高倍視野，見圖2。HIF-la表達(dá)陽性的神經(jīng)元在腦出血后24～48 h時達(dá)到高峰，(12.5±3.9)個／高倍視野，48～72 h高表達(dá)持續(xù)存在，(12.2±1.8)個／高倍視野。與對應(yīng)的腦水腫體積進(jìn)行相關(guān)性分析，HIF-la的表達(dá)量與腦水腫體積成正相關(guān)性(r=0.64，t=4.56，P<0.01)。見表1。

2．3血腫周圍組織HIF-la表達(dá)與VEGF表達(dá)的關(guān)系

腦出血后4 h，可見血腫周圍已出現(xiàn)散在VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞(圖3)，以神經(jīng)元為主，也可見中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。隨著出血時間延長，表達(dá)VEGF的血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯增多。將血腫周圍組織HIF-la的表達(dá)與VEGF的表達(dá)兩項指標(biāo)進(jìn)行比較，HIF-la表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.76，t=6.37，P＜0.01)。見表1。

3討論

腦出血后一段時間內(nèi)血腫周圍進(jìn)行性腦水腫，是導(dǎo)致神經(jīng)功能惡化的一個重要原因。腦出血后腦水腫的機(jī)制尚未完全闡明。許多實(shí)驗研究顯示腦出血后早期在血腫周圍、相鄰部位甚至遠(yuǎn)隔區(qū)域會出現(xiàn)廣泛的腦血流下降，但關(guān)于血腫周圍腦血流量的改變在腦出血后水腫產(chǎn)生中所起的作用，目前臨床上尚有爭議。

HIF-la是氧調(diào)控信息傳遞通路中的重要因子，對缺氧特別敏感。HIF-la在正常腦組織不表達(dá)，低氧狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)氧濃度對HIF-la的表達(dá)進(jìn)行著精細(xì)的調(diào)節(jié)。隨著氧濃度的降低，表達(dá)量呈指數(shù)增長，并決定著HIF-la的活性水平，HIF-la在恢復(fù)供氧的細(xì)胞內(nèi)，其半衰期小于5 min。因此，測定腦出血血腫周圍腦組織HIF-la的表達(dá)情況，可以在一定程度上反映血腫周圍腦組織缺血缺氧性損害的程度。筆者對腦出血患者血腫周圍腦組織研究結(jié)果顯示，腦出血后血腫周圍腦組織出現(xiàn)HIF-la的表達(dá)，且HIF-la的表達(dá)量與腦水腫的體積成正相關(guān)性，提示HIF-la參與了血腫周圍腦水腫的形成。這一結(jié)果為腦出血早期血腫周圍存在缺血缺氧性損害且參與了腦水腫的形成，提供了新的理論依據(jù)。

在正常情況下，腦內(nèi)無VEGF表達(dá)，但各種應(yīng)激反應(yīng)條件都可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，其中缺血缺氧強(qiáng)烈誘導(dǎo)VEGF在各類細(xì)胞中的表達(dá)。筆者的研究結(jié)果顯示在出血灶周圍區(qū)內(nèi)，早期表達(dá)VEGF的細(xì)胞主要為神經(jīng)元，也可見中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；后期以血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞增多明顯。研究已表明，HIF-la表達(dá)可誘導(dǎo)、調(diào)控VEGF的表達(dá)。筆者的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HIF-la表達(dá)與VEGF表達(dá)兩者之間呈正相關(guān)性。提示腦出血后血腫周圍區(qū)因缺血缺氧刺激神經(jīng)元、炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等共同表達(dá)VEGF。VEGF能顯著增加血管通透性，破壞正常腦組織血腦屏障；另一方面，VEGF能特意性作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管形成，而新生血管缺乏完善的血腦屏障，導(dǎo)致血漿滲漏引起腦水腫。因此，筆者認(rèn)為HIF-la可能是通過誘導(dǎo)、調(diào)控VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腦水腫的形成。

有動物實(shí)驗研究表明，應(yīng)用VEGF治療腦梗死及脊髓損傷，能促進(jìn)缺血區(qū)血管形成、減輕水腫，具有神經(jīng)保護(hù)作用。筆者的研究結(jié)果與動物實(shí)驗結(jié)果不符。筆者推測，VEGF發(fā)揮的作用可能與VEGF的表達(dá)量有關(guān)；另外，VEGF在腦出血后的不同階段可能發(fā)揮不同的作用，腦出血早期主要是增加血管通透性，破壞血腦屏障，促進(jìn)腦水腫，加重腦損傷，急性期后則主要是保護(hù)作用，促進(jìn)腦損傷的愈合，但其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。