張選奮　魯開化等

張選奮魯開化李薈元郭樹忠李向東

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科中心西安710032)

張選奮 男，1965年生。蘭州醫(yī)學(xué)院副主任醫(yī)師，副教授?，F(xiàn)在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科中心從師魯開化教授和李薈元教授攻讀博士學(xué)位，已發(fā)表論文15篇。

［摘要］目的：探討蛋白激酶A在轉(zhuǎn)化生長因子-β₁(TGF-β₁)刺激增生性瘢痕和正常人皮膚成纖維細胞(HS-FB和NS-FB)增殖中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。方法：利用³²P摻入底物法測定HS-FB和NS-FB的PKA活性；使用直接計數(shù)法和MTT法測定TGF-β₁和cAMP、H₇等刺激兩種細胞后增殖能力的變化。結(jié)果：NS-FB被TGF-β₁刺激后PKA的活性短暫升高后很快恢復(fù)(30min內(nèi)，但P＞0.05)，HS-FB則在30～60min降低(P＜0.05)，1h后恢復(fù)；HS-FB的PKA活性比NS-FB低(但P＞0.05)。TGF-β₁能強烈刺激兩種細胞增殖(30min后P＜0.05)，對HS-FB的刺激作用更強(刺激60min后P＜0.05)。cAMP可抑制兩種細胞增殖(60min后P＜0.05)，H₇有擬TGF-β₁作用(30min后P＜0.05)，H₇還可增強TGF-β₁的刺激作用(30～60min后P＜0.05)。結(jié)論：TGF-β₁刺激后PKA的活性在兩種細胞有不同的變化，提示兩種細胞的cAMP/PKA信號通道存在一定的差異；TGF-β₁刺激作用部分經(jīng)PKA活性變化介導(dǎo)，但活化PKA通道可以逆轉(zhuǎn)TGF-β₁的作用。

［關(guān)鍵詞］信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶A轉(zhuǎn)化生長因子-β₁成纖維細胞增殖

［中圖分類號］R619+.6［文獻標(biāo)識碼］A［文章編號］1008-6455(2000)06-0413-04

THE EFFECTS OF ACTIVITY OF PROTEIN KINASE A IN TGF-β₁ STIMULATING

PROLIFERATION OF NORMAL SKIN AND HYPERTROPHIC SCAR FIBROBLAST

ZHANG Xuan-fenLU Kai-huaLI Hui-yuan et al.

Center of Plastic Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University(Xian 710032)

[Abstract]Objective:To investigate the effects of protein kinase A(PKA)in TGF-β₁ stimulating proliferation of normal skin and hypertrophic scar fibroblast(NS-FB and HS-FB).Methods:The activity of PKA of HS-FB and NS-FB was detected by ³²P incorporation assay.Cell proliferation was measured by methyltetrazolium assay and cell count after TGF-β₁,cAMP and H₇ stimulating.Results:The activity of PKA of NS-FB was risen temporarily insignificantly and recovered soon while the one of HS-FB was decreased and recovered at lh the stimulation of TGF-β₁ (P<0.05).TGF-β₁ could stimulate proliferation of FB(P<0.05 at stimulating 30 minutes later) but the effects were stronger in HS-FB(P<0.05 at stimulating 60 minutes later).cAMP could inhibit the changes (P<0.05 at stimulating 60 minutes later) while H₇ could improve roles of TGF-β₁(P<0.05 at 30～60 minutes of stimulation).Concusion:The changes of the PKA activity of the two types of cell after the stimulation of TGF-β₁ might implicate that there was difference in the PKA signal pathway. The effects of TGF-β₁ stimulating cell proliferation might have partly relation to cAMP/PKA pathway but the activation of cAMP/PKA signal pathway could abrogate the effects of TGF-β₁.

[Key words]Signal transductionPKATGF-β₁FibroblastProliferation

環(huán)磷酸腺甙(cyclic Adenosine Monophosphate簡稱cAMP)--蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)信息途徑活化對許多細胞如血管內(nèi)皮細胞(Endothelial Cell,EC)^〔1〕、血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)^〔2,3〕和成纖維細胞(Fibroblast,FB)^〔4〕等瘢痕形成相關(guān)細胞有促進分化和凋亡、抑制增殖作用。轉(zhuǎn)化生長因子β₁(transforming growth factor β₁ 簡稱TGF-β₁)刺激能強烈加速FB、EC和VSMC等細胞增殖。尚不清楚TGF-β₁對增生性瘢痕和正常人皮膚成纖維細胞(Hypertrophic Scar Fibroblast,HS-FB 和Normal Skin Fibroblast,NS-FB)的cAMP/PKA通道的影響以及cAMP/PKA 通道在FB增殖中的作用。我們做了研究，報道如下。

1材料和方法

1.1材料

標(biāo)本：原代培養(yǎng)HS和正常人皮膚組織(各4例，均系我院手術(shù)病例)。二者在年齡、性別和部位等方面匹配。細胞成片后傳代。實驗用4～10代細胞。

試劑：leupeptin、aprotanin、H₇、MTT和PMSF購自sigma公司。PKA檢測kit、cAMP和TGF-β₁購自Promega 公司。蛋白質(zhì)定量kit購自Bio-RAD公司。ATP(3000ci/m mol)購自北京亞輝生物公司。DMEM購自Hyclone公司。其它試劑均為分析純或更純。

儀器：Beckman GS-15R冷凍高速離心機；Polytron 超聲勻漿儀；Beckman LS6500液閃儀；Perkin Elmer Lambda14紫外可見光分光光度計和Labsystems Dragon 公司W(wǎng)ellscan MK2型酶標(biāo)儀等。

1.2方法

1.2.1PKA活性測定

酶樣準(zhǔn)備：細胞置25cm培養(yǎng)瓶用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的 DMEM常規(guī)培養(yǎng)48h，0.5%FBS的DMEM饑餓24h，TGF-β₁5ng/ml、H₇ 250μM、cAMP0.025mM和TGF-β₁5ng/ml加H₇ 250μM刺激10、30、60和120min,冰浴上用細胞刮刀收集細胞，立即置液氮中凍存。

冰浴上融化細胞，加入預(yù)冷的樣品緩沖液(25mM Tris-HCl pH7.4，0.5mM EDTA,0.5mM EGTA，10mM β-巰基已醇，1μg/ml leupeptin,lμg/ml aprotanin, 5mM PMSF)500μl，預(yù)冷的渦旋混合儀和超聲勻漿儀混勻和勻漿，14000g離心5min，留上清液作為酶樣。操作均在0～4℃進行。

PKA活性測定：按試劑盒說明進行。按0.5mM ATP 5μl和［-³²p］ATP(3000ci/m mol)10ci/μl 0.05μl準(zhǔn)備ATP混合物并混勻。反應(yīng)總體積為25μl。PKA測定緩沖液5×(200mM Tris-HCl pH7.4，100mM MgCl2，0.5mg/ml BSA)、PKA多肽底物、［-³²32p］ATP混合物和去離子水各5μl，混勻?？瞻追磻?yīng)用去離子水代替PKA底物。30℃溫育5min，加酶樣5μl啟動反應(yīng)，準(zhǔn)確30℃溫育5min(溫育時間、酶樣要否稀釋由預(yù)實驗確定)。加12.5μl終止緩沖液終止反應(yīng)。每樣品均為雙復(fù)管。點反應(yīng)混合液10μl到SAM^2M膜，依次洗膜：2M NaCl 200ml 30sec1次，2M NaCl 200ml 2min2次，含1%磷酸的2M NaCl 200ml 2min3次，100ml去離水30sec 2次，共約12～15min。另外，任取兩個反應(yīng)液各5μl點到SAM^2M膜但不洗。所有膜均在室溫干燥。置膜于液閃瓶，加閃爍液2ml后液閃計數(shù)。

蛋白質(zhì)含量測定和結(jié)果計算按試劑盒說明進行。

1.2.2增殖能力測定

MTT實驗：接種細胞2.5×10⁷/ml(10% FBS 的DMEM制備細胞懸液)于96孔板，每孔100μl，常規(guī)培養(yǎng)48h。0.5% FBS的DMEM饑餓細胞24h。刺激與PKA測定相同。0.5% FBS的DMEM為陰性對照。刺激后，換用0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)20h，每孔加MTT(5mg/ml)溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)3h，小心吸棄上清液，每孔加二甲基亞砜150μl，振蕩10min顯色，在490nm測吸光值。

細胞計數(shù)：細胞培養(yǎng)和刺激與MTT比色實驗相同，僅在刺激后再培養(yǎng)20h，胰酶消化，準(zhǔn)確定量的DMEM稀釋成細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)，取三復(fù)孔計數(shù)兩次的平均值。

此外，為了研究長時間刺激的效應(yīng)，我們還做了刺激12h和24h的反應(yīng)。

2結(jié)果

2.1PKA活性變化

TGF-β₁刺激后PKA的變化見。與對照相比，TGF-β₁刺激NS-FB后PKA的活性有短暫的升高(10min后升高，30min內(nèi)恢復(fù)，但P＞0.05)；而HS-FB被刺激后酶活性降低(30～60min時P＜0.05)，1h內(nèi)恢復(fù)到對照水平；對照組HS-FB的酶活性均高于NS-FB，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2增殖能力變化

2.2.1細胞數(shù)量TGF-β₁可增強兩種細胞的增殖能力(30min后P＜0.05)，TGF-β₁刺激后HS-FB的增殖能力高于NS-FB(60min后P＜0.05)，cAMP能抑制兩種細胞增殖(60min后P＜0.05，)H₇則有擬TGF-β₁作用(與TGF-β₁比較時P＞0.05，與對照比較時30min后＜0.05)，而H₇部分增強TGF-β₁的刺激作用(30～60min時P＜0.05)。cAMP、H₇和TGF-β₁+H₇三種刺激在HS-FB和NS-FB間差異不明顯(P＞0.05)。(見表1)

3討論

PKA為依賴cAMP的蛋白激酶，有轉(zhuǎn)遞胞外的刺激信號、影響膜蛋白的磷酸化而改變細胞膜的通透性、調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等作用。一般認為，cAMP/PKA通道活化可以促進細胞分化和凋亡，抑制增殖。PKA主要被cAMP活化。毛喉素(Forsklin)活化腺苷酸環(huán)化酶和IBMX(3-islbutyl-l-methyl-xanthene)、茶鹼等抑制磷酸二酯酶可提高cAMP濃度而活化PKA，cAMP的類似物如8-溴-cAMP、dbcAMP(dibutyryl cAMP)等有擬cAMP作用而另一些則有抗cAMP作用。PKA可被H₇、H-89或假底物肽m-phi 等抑制，但生理性的失活是被磷酸酶脫磷酸化。Berman^〔5〕等發(fā)現(xiàn)己酮可可堿(Pentoxifylline,PTX)能全面抑制皮膚FB的增殖，還增加膠原酶活性而發(fā)揮抗纖維化的作用。近來，Chen^〔3〕等也證實PTX呈cAMP依賴性抑制bFGF和PDGF-AB誘導(dǎo)的VSMC的增殖，8-溴cAMP和毛喉素能模仿PTX的作用而H-89和m-phi PKA能阻斷PTX的作用；顯然，PTX的作用經(jīng)由cAMP/PKA通道介導(dǎo)。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β₁刺激NS-FB后PKA的活性短暫升高(10min后升高，30min內(nèi)恢復(fù))；而HS-FB則先降低，1h內(nèi)恢復(fù)到對照水平；提示cAMP/PKA通道可能參與TGF-β₁短期刺激FB增殖，但不是TGF-β₁信號主要介導(dǎo)者。TGF-β₁能刺激兩種細胞增殖，支持先前的研究^〔6〕。而cAMP能抑制兩種細胞增殖，H₇有擬TGF-β₁作用，而H₇可增強TGF-β₁刺激的作用，這提示PKA活化可能抑制FB的增殖。TGF-β₁刺激HS-FB和NS-FB后PKA活性相反變化的機理尚待進一步研究。

cAMP/PKA信號通道活化后抑制FB等細胞增殖的機理可能涉及細胞內(nèi)的多條信號通道。cAMP/PKA通道和生長因子-受體酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Protein Kinase,R-TPK)-Ras…Raf-1…MAPK(絲裂原活化的蛋白激酶 Mitogen-Activated Protein Kinase)通道^〔7〕的"交談(cross-talk)"可能是機制之一。DAnglo^〔1〕等發(fā)現(xiàn)cAMP能阻止VEGF和bFGF誘導(dǎo)的Raf-1活化，而H-89能逆轉(zhuǎn)cAMP/PKA活化對MAKP活化和絲裂原誘導(dǎo)的細胞增殖的抑制作用。Graves^〔2〕等發(fā)現(xiàn)PDGF-BB呈劑量依賴性升高cAMP和PKA活性，并可被磷酸二酯酶抑制劑增強，可見生長因子活化Raf的同時也活化cAMP/PKA，而cAMP/PKA活化可抑制Raf-1，從而不能活化MAPK而抑制絲裂原和/或生長因子刺激的細胞增殖，形成負反饋抑制^〔8〕。此外，近年來發(fā)現(xiàn)PKA還能阻止佛波酯-蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)活化介導(dǎo)的細胞增殖并證實主要經(jīng)抑制c-jun、c-fos mRNA表達發(fā)揮作用^〔9〕。cAMP/PKA活化還促進細胞分化和凋亡。還有，PKA可直接使細胞分裂終止在G₁-G₂期和cAMP誘導(dǎo)P^27kipl(周期素依賴性激酶4-Cyclin-Dependent Kinase,CDK4-的抑制劑)產(chǎn)生而阻止CDK4的活化，使細胞停止在G₁期^{〔10，11〕}以及cAMP/PKA的對糖-能量代謝的影響都是可能的機制。TGF-β₁增加HS-FB的細胞數(shù)量可能部分與降低PKA活性而弱化對增殖抑制和減弱凋亡有關(guān)。

然而，近年來發(fā)現(xiàn)，cAMP/PKA可刺激一些細胞增殖。Calleja^〔4〕發(fā)現(xiàn)cAMP/PKA通道的細胞增殖的影響：對FB經(jīng)抑制MAPK而抑制增殖，而對PC12細胞則促進增殖。這可能與不同細胞的信息代謝過程存在差異和細胞內(nèi)PKA亞型等有關(guān)^〔12〕。

綜合上述，TGF-β₁刺激FB使PKA活性變化和cAMP和H₇對FB增殖的影響提示PKA信號通道參與瘢痕形成相關(guān)細胞如FB、EC、VSMC、表皮細胞和炎癥細胞等在創(chuàng)傷愈合和瘢痕增生過程。弄清這些細胞的cAMP/PKA信息代謝通道變化，可能有助于了解瘢痕形成機理；干預(yù)此通道也可能預(yù)防和治療瘢痕；使用升高cAMP或/和PKA活性的藥物如氨茶堿、PTX和β受體阻滯劑等可能有預(yù)防瘢痕增生作用。

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編輯／樊延南