關鍵詞：胰腺導管癌；KRAS；免疫療法；腺病毒；基因治療

胰腺癌（PancreaticCancer，PC）是一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，胰腺導管癌（PancreaticDuctalAdenocaromas，PDAC）是胰腺癌最主要的亞型，約90%的胰腺惡性腫瘤源于胰腺導管上皮病變形成的胰腺導管癌[1]。胰腺癌5年總生存率僅為12%左右[2]，早期發(fā)現(xiàn)率低、進展快、易產(chǎn)生耐藥性是胰腺癌的主要特點，也是導致其預后不良的主要因素[1]。據(jù)研究結果顯示，到2023年胰腺癌已成為繼肺癌和結直腸癌之后的第三大癌癥死亡原因[2-3]。用手術切除的方法進行治療目前被認為是胰腺癌唯一的治療方法[4]，治療標準為先手術后輔助化療，但由于大多數(shù)病例在早期沒有癥狀，這導致目前可用的診斷測試往往無法檢測到早期疾病患者，確診時只有15%～20%的患者有手術機會，大部分患者被診斷時就處于疾病晚期或因局部進展而失去手術機會[1，5-6]。對于不可進行手術切除的處于疾病轉移或疾病晚期患者，化療是唯一的治療選擇[7]。但PDAC是一種對于化療耐藥性很強的癌癥。在能夠耐受5-氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑三重化療的患者中，生存期也只能延長到11個月[8]，且這種姑息性化療可能具有顯著的毒性。

Ras基因是人類癌癥中最經(jīng)常出現(xiàn)突變的腫瘤基因組。而在Ras突變型癌癥中又有84%的突變?yōu)镵RAS異構體發(fā)生突變[9]。據(jù)Connor等[10]的研究顯示，大約90%的PDAC中存在KRAS突變，KRAS高頻率的突變以及其在癌癥發(fā)展早期被激活，都意味著KRAS突變導致的致癌信號傳導可能是PDAC的一個重要驅動因素[10]。在KRAS中，與癌癥相關的錯義突變主要聚集在Gly12（G12）、Gly13（G13）和Gln61（Q61）密碼子上，共占99%[11]，而在KRASQ61突變中Q61的主要突變?yōu)镼61H，約占57%[12]。突變的KRAS不僅可以促進腫瘤細胞的增殖，還可以促進調節(jié)T細胞（Treg）等免疫抑制細胞的浸潤，減少腫瘤組織中CD8+T淋巴細胞比例[13-17]。KRAS突變等遺傳畸變是癌癥特有，而在正常組織中不存在[18]。因此，靶向KRAS的典型熱點突變是治療有KRAS突變位點癌癥的一種非常有吸引力的方法。

在免疫學上，與黑色素瘤[19]、肺癌和膀胱癌[20]等其他腫瘤相比，PDAC具有低免疫原性和低腫瘤突變負荷（TMB）[19]，對于大多數(shù)患者來說，腫瘤內很少有效應T細胞浸潤[21]。大量體細胞突變釋放新抗原能使得腫瘤組織中炎癥細胞因子和效應T細胞增加[22-24]，說明高TMB能夠激起免疫治療的療效[19，25]。理論上，只要KRAS突變在腫瘤細胞上表現(xiàn)出來，通過免疫療法直接靶向KRAS突變就可以實現(xiàn)體內抗腫瘤作用[26]。已有研究表明突變的KRAS肽裝載在抗原呈遞細胞上可以誘導KRAS突變特異性T細胞反應[27-30]。KRAS突變特異性T細胞被激活后可以殺死KRAS突變腫瘤細胞，并抑制KRAS突變腫瘤的生長。

本文通過增加KRASQ61H突變形成新抗原負荷來激起機體強烈的免疫反應，增強抗腫瘤免疫細胞活性[31]。將表達KRASQ61H抗原融合蛋白的質粒表達載體包裝為Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4病毒注射液，將其注射到小鼠腫瘤組織內，定期測量腫瘤體積變化，在給藥后檢測小鼠體內效應T細胞的變化情況。在終點處取腫瘤組織，分別在RNA層面和蛋白層面檢測腫瘤組織處T細胞的浸潤情況。結果表明，Ad-SNP1通過激起荷瘤小鼠體內強烈的免疫反應，從而達到抑制腫瘤生長的效果，這證明了通過基因治療的方式增加抗原負荷來達到抑制腫瘤生長是可行的，同時篩選出了效果較好的表達載體，為后續(xù)進一步的研究奠定了基礎。

1實驗部分

1.1主要原料與試劑

本文所用的骨架質粒由本實驗室保存。SNP1、SNP2、SNP3、SNP4序列由北京六合華大基因科技有限公司進行全基因合成。限制性核酸內切酶購自NEB公司；T4連接酶購自ThermoFisherScientific公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；HumanGM-CSFDuoSetELISA試劑盒購自美國Ramp;D公司；抗HSP70（Mycobacteriumtuberculosis）抗體購自GeneTex公司；APC-Cy?7HamsterAnti-MouseCD3e、FITCRatAnti-MouseCD4、PerCP-Cy?5.5RatAnti-MouseCD8a購自美國BD公司；C57BL/6J小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司；人胚腎細胞（HEK293）購自中科院上海細胞庫；鼠源胰腺癌細胞（Pan02）購自上海酶研生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；QPCRSYBRMix購自南京諾唯贊生物科技公司。人源KRASQ61H基因過表達慢病毒由山東維真生物公司包裝。

1.2主要儀器

凈化工作臺（上海上凈凈化設備有限公司，CA-1390-1型）、二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific，BB150型）、熒光倒置顯微鏡（德國徠卡Leica公司，DMIL型）、多功能酶標儀（美國BioTek公司，SynergyH1型）、定量基因擴增儀（AnalytikJenaAG公司，OTOWER3.0型）、高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，KZ-II型）。

1.3實驗方法

1.3.1質粒構建及病毒包裝 根據(jù)人源KRAS序列及其熱點突變位點，設計并優(yōu)化得到SNP1、SNP2、SNP3、SNP4序列，將基因序列提交北京六合華大基因科技有限公司進行全基因合成。將合成好的SNP1、SNP2、SNP3、SNP4序列和實驗室已有pAd載體骨架用限制性內切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收所需的載體骨架片段及目的基因片段，將其用T4連接酶進行連接即得到本文所需的4個質粒表達載體。質粒轉化感受態(tài)細胞，并涂布平板培養(yǎng)，將平板上的單克隆菌落挑出培養(yǎng)，菌液送測確認序列無誤后抽提質粒用于病毒包裝。本文中所用的Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4病毒的包裝、擴增和純化由上海泰兒圖生物科技公司完成。

1.3.2細胞培養(yǎng)及病毒感染 培養(yǎng)基為添加體積分數(shù)10%FBS和青霉素和鏈霉素（總體積分數(shù)1%）的高糖DMEM培養(yǎng)基，細胞置于37℃的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HEK293細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板，待每個孔內細胞匯合率達到70%～80%時，每孔感染1×107pfu的4種病毒，培養(yǎng)48h后收上清用于Elisa實驗，收細胞提取RNA用于實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）實驗。

1.3.3組織、細胞的RNA提取及Real-TimeqPCR 感染病毒后的細胞加Trizol提取RNA；對于小鼠的腫瘤組織，加Trizol及研磨珠勻漿處理后提取RNA，將提取得到的RNA樣本進行定量，后用PrimeScriptMix酶反轉錄得到cDNA。根據(jù)后續(xù)實驗所需體積配置擴增體系，擴增體系為cDNA、雙蒸水和預混液SYBRMix，用RT-qPCR檢測在RNA水平上各項指標的表達情況，檢測時每個樣品均設3個復孔。

1.3.4小鼠血常規(guī) 對小鼠進行眼眶取血，取血時須在EP（Eppendorf）管中提前加入EDTA-K2抗凝劑，抗凝劑質量濃度為1.5mg/mL，血樣送由賽維爾生物科技有限公司進行血常規(guī)檢測。

1.3.5流式細胞術檢測小鼠外周血淋巴細胞 對小鼠進行眼眶取血（在EP管中提前加入肝素鋰抗凝劑），每管血樣中加入2μLAPC-Cy7CD3e、1μLPerCP-Cy5.5CD8a、1μLFITCCD4，設置好對照組，避光孵育30min后用紅細胞裂解液進行2次紅細胞破除，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次后用0.5mLPBS重懸，最后細胞濾網(wǎng)過濾后流式上機。

1.3.6Pan02-Q61H細胞系構建 首先鼠源胰腺癌細胞（Pan02）提取RNA并測序，證實Pan02細胞系中不含KRASQ61H突變。用含有KRASQ61H突變的慢病毒以感染復數(shù)50、用1/2小體積感染法感染Pan02，并用含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)液培養(yǎng)幾代，篩選穩(wěn)定轉導的細胞株（慢病毒中設計攜帶有Puromycin抗性基因），用顯微鏡觀察GFP信號，確認感染情況。收取篩選后的細胞用流式細胞儀檢測GFP信號，再次驗證熒光細胞的比例。同時收細胞并提取mRNA進行RT-qPCR檢測Pan02-Q61H細胞在mRNA水平上KRASQ61H突變表達。將RT-qPCR產(chǎn)物再次進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物送樣測序，驗證構建情況。

1.3.7Pan02-Q61H小鼠移植瘤實驗 構建并驗證好的Pan02-Q61H細胞，第1天（D1）以皮下注射的方式將8×105個細胞量接種在C57BL/6小鼠的右側背部，每只注射100μL，構建移植瘤小鼠模型。將荷瘤小鼠隨機分為5組（n=7），分別為SNP1組、SNP2組、SNP3組、SNP4組以及Control組，在移植后第8、14、20d，每只小鼠瘤內注射5×108pfu相應的Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4這4種病毒，注射體積為100μL，對照組小鼠則在對應時間點注射相同體積病毒稀釋液，根據(jù)腫瘤生長情況，每3d監(jiān)測一次腫瘤的大小，并使用游標卡尺記錄二維測量值，計算腫瘤大小（0.5×長×寬2）。在第34d處死小鼠，收集腫瘤組織并稱重。

1.3.8小鼠組織切片及免疫熒光染色 采用多聚甲醛固定腫瘤組織后用梯度乙醇進行組織脫水，然后用二甲苯進行組織透明，最后進行浸蠟和包埋，得到組織樣品石蠟塊，將蠟塊修整后，用石蠟切片機將其切成厚度均為5μm切片，切片貼于載玻片上進行烤片、脫蠟及復水得到組織樣品切片。組織切片先用抗原修復液進行修復，后用體積分數(shù)為3%的過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶活性，再用封閉液封閉非特異性位點，封閉結束后孵育對應的CD4、CD8和CD11B抗體，最后用DAPI（4'，6-二脒基-2苯基吲哚）對細胞核進行染色后封片，用熒光顯微鏡進行觀察并拍攝熒光圖。

1.3.9統(tǒng)計分析 所有的實驗數(shù)據(jù)均使用GraphpadPrism9.0進行統(tǒng)計分析，并采用組件Student'st-tests及單因素One-WayANOVA進行分析，所有結果均采用平均值±標準差（SD）進行表示。Plt;0.05表示數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上具有顯著性差異，*表示Plt;0.05；**表示Plt;0.01，***表示Plt;0.001，****表示Plt;0.0001。WesternBlot圖片以及免疫熒光圖片使用ImageJ統(tǒng)計處理，并用GraphpadPrism9.0進行數(shù)據(jù)分析。

2結果與討論

2.14種載體構建及表達水平檢測

設計并構建好4種質粒表達載體，結果如圖1所示。由圖1（a）可見，4種表達載體均由兩個表達盒構成，第1個表達盒由人巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）啟動子、含多種KRAS突變位點的肽段融合熱激蛋白70（HeatShockProtein70，HSP70）分子佐劑構成；第2個表達盒由TK啟動子以及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-MacrophageColonyStimulatingFactor，GM-CSF）構成。各表達載體SNP1、SNP2、SNP3、SNP4中的KRAS突變序列排序、連接方式以及種類數(shù)量不同，但均含有Q61H突變肽段，將構建并驗證無誤的質粒包裝腺病毒衣殼得到Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4這4種病毒。

用Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4感染人腎上皮細胞系（HEK293）后檢測GM-CSF和HSP70的表達，結果如圖1（b）和1（c）所示。由圖可見，4種病毒在HEK293中GM-CSF蛋白都有表達，其中Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3組中GM-CSF蛋白表達較未感染組分別提高了131.142、105.031、112.932倍（Plt;0.01），Ad-SNP4組中GM-CSF蛋白表達較未感染組提高了51.2654倍（Plt;0.05），Ad-SNP1組中GMCSF蛋白表達較其他3組更高；同時在感染48h后收細胞提取mRNA，通過實時定量PCR檢測mRNA水平上HSP70的表達，Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4組HSP70表達較未感染組分別提高了25864.5、753.396、8411.12、2940.8倍（Plt;0.01），Ad-SNP1組HSP70表達顯著高于其他3組。上述結果表明4種病毒在細胞層面都能表達，但表達水平不同，Ad-SNP1表達最高，其次是Ad-SNP2、Ad-SNP3，Ad-SNP4表達最低。為了進一步確定表達情況并篩選表達較好的載體，在體內進行進一步的藥效研究。

2.24種載體在小鼠體內免疫評價

已有研究證實了包含突變位點的KRAS衍生肽疫苗在癌癥患者中能夠誘導或增強免疫原性[27]。本研究將Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP44種病毒（n=5）通過皮下注射進入C57小鼠體內，劑量為1×108pfu，評價其體內激活免疫反應的能力。本研究采取與其他研究類似的多次給藥模型，以激活并將免疫反應性維持在一定水平[28]。研究結果表明，皮下注射4種病毒后，在第1次給藥后的第2d（D2）取血，在第1次給藥后兩周以相同的劑量再次給藥（D14），第2次給藥后第6d（D20）取血，檢測血液中白細胞（WhiteBloodCell，WBC）、單核細胞（Monocytes，Mon）、淋巴細胞（Lymphocyte，Lymph）、中性粒細胞（NeutralGranularCell，Gran）的變化情況，來判斷4種病毒激起機體免疫反應的能力。

第1次給藥后2d（D2）血常規(guī)結果如圖2（b）～（e）所示，分析血常規(guī)結果可以發(fā)現(xiàn)，在給藥后2dAd-SNP1、Ad-SNP4組小鼠體內白細胞、單核細胞、淋巴細胞3種免疫相關細胞與對照組相比有顯著提升（Plt;0.05）；中性粒細胞在Ad-SNP1組小鼠體內升高（Plt;0.05），Ad-SNP4組無明顯升高（Pgt;0.05）；Ad-SNP2、Ad-SNP3組與未給藥組相比上述4種免疫相關細胞均未引起顯著變化；總體來看，Ad-SNP1組和Ad-SNP4組在病毒注射第2d激起小鼠體內的免疫反應。

在第2次給藥后的第6d（D20）血常規(guī)結果如圖2（f）～（i）所示，Ad-SNP1、Ad-SNP2和Ad-SNP3組小鼠體內上述4種免疫相關細胞與未給藥組相比都有顯著升高（Plt;0.05）；但是Ad-SNP4組在第2次給藥后第6d（D20）時小鼠體內4種免疫相關細胞均降低到與對照組相同水平（Pgt;0.05），總體來看，Ad-SNP1組、Ad-SNP2組和Ad-SNP3組在第2次病毒注射后第6d（D20）依然能一定程度激起小鼠體內的免疫反應，而Ad-SNP4組激起小鼠體內免疫反應的能力較差，與未給藥組相比沒有顯著性差異。

除了通過小鼠血常規(guī)檢測來評價4種病毒藥物激起機體免疫能力外，本文還通過小鼠外周血流式細胞術檢測CD3+、CD4+以及CD8+T淋巴細胞的變化情況來多角度評價4種病毒藥物激起小鼠體內免疫反應的能力。

在第1次給藥后兩周（D14）取血，通過流式細胞術檢測外周血CD3+、CD4+以及CD8+T淋巴細胞的變化情況，結果如圖3所示，Ad-SNP1組小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量（外周血中104個細胞中陽性細胞數(shù)量）與未給藥組相比有顯著升高（Plt;0.001），Ad-SNP2組小鼠外周血中CD3+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量同樣也有升高（Plt;0.05），但Ad-SNP2組小鼠CD4+T淋巴細胞的數(shù)量無顯著增加（Pgt;0.05），而Ad-SNP3和Ad-SNP4組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量均與未給藥組無顯著差別（Pgt;0.05）。從外周血流式結果來看，Ad-SNP1、Ad-SNP2能夠顯著激起小鼠免疫反應，但Ad-SNP2激起小鼠免疫反應的能力較Ad-SNP1差，而Ad-SNP3和Ad-SNP4不能激起小鼠體內免疫反應。

綜合分析小鼠血常規(guī)結果及外周血流式細胞術結果，判斷4種病毒在小鼠體內都能激起免疫反應；Ad-SNP1組激起小鼠體內免疫反應的能力最強；其次是Ad-SNP2、Ad-SNP3組，也有一定激起小鼠免疫反應的能力；由于Ad-SNP4組僅在第1次給藥后2d（D2）血常規(guī)結果顯示體內免疫升高，說明Ad-SNP4激起小鼠體內免疫反應的能力最弱。

2.3Pan02-Q61H細胞構建及藥效評價

2.3.1Pan02-Q61H細胞構建及驗證 本研究采用Pan02細胞進行比較分析4種病毒對于移植瘤模型的免疫殺傷作用。本研究首先檢測了Pan02細胞是否含有Ad-SNP1、Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4中的KRASQ61H突變位點。測序結果顯示，Pan02不含有KRASQ61H突變位點（圖4（a））。進一步，本研究使用含有Q61H突變的KRAS基因的慢病毒進行感染，獲得Pan02-Q61H細胞系。結果顯示，慢病毒感染Pan02細胞并用嘌呤霉素篩選后，在熒光顯微鏡下可以觀察到明顯的綠色熒光（圖4（b））。流式細胞檢測表明89.32%的Pan02細胞成功被慢病毒感染（圖4（c）、（d））。

進一步，本研究對構建好的細胞系進行了鑒定。分別提取未感染Pan02細胞（Pan02-NC）與Pan02-Q61H細胞的mRNA，并進行RT-qPCR擴增，結果如圖5所示。KRASQ61H能夠在Pan02-Q61H細胞中表達，其表達量是未感染Pan02細胞的378703倍（圖5（a），Plt;0.001）。測序結果顯示，KRASQ61H突變成功插入Pan02-Q61H細胞（圖5（b））。蛋白水平分析顯示，KRASQ61H在Pan02細胞中顯著上調表達（圖5（c）、（d），Plt;0.01）。

綜上所述，從多角度證明了慢病毒感染Pan02細胞系成功構建含有KRASQ61H突變位點的Pan02-Q61H多克隆細胞系。

2.3.24種病毒在Pan02-Q61H誘導的胰腺癌模型中的藥效評價 為了進一步確認4種病毒在體內對于Pan02-Q61H細胞的免疫殺傷作用，將Pan02-Q61H細胞以8×105個細胞量皮下注射，接種于C57BL/6小鼠的背部（n=7），誘導胰腺癌移植瘤模型（圖6（a））。在細胞注射第8d進行藥物治療。

本研究中，Ad-SNP1處理組可見皮下腫瘤大小始終處于較低水平，與未給藥組相比能顯著抑制腫瘤的生長速度（圖6（b），Plt;0.05），而從D11開始Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4及對照組腫瘤均開始顯著增長。Ad-SNP3、Ad-SNP4組與對照組相比能抑制腫瘤生長速度（圖6（b）），但不存在顯著性差異（圖6（c），Pgt;0.05），而Ad-SNP2組抑制腫瘤生長效果較差（圖6（c），Pgt;0.05）。研究終點處死小鼠，取腫瘤組織記錄終點處腫瘤質量及體積并拍攝腫瘤終點圖片（圖6（e）），結果顯示終點處Ad-SNP1組每只小鼠體內的腫瘤質量及體積均顯著小于對照組（圖6（c）、（d），Plt;0.05），Ad-SNP3、SNP4組腫瘤終點質量及體積也小于對照組，但不存在顯著差異（圖6（c）、（d），Pgt;0.05），而Ad-SNP2組腫瘤終點質量及體積均大于對照組（圖6（c）、（d），Pgt;0.05），顯示Ad-SNP2沒有發(fā)揮腫瘤抑制作用。綜合腫瘤生長情況表明，Ad-SNP1有顯著的腫瘤抑制作用，Ad-SNP3和Ad-SNP4的對腫瘤的抑制作用較差，而Ad-SNP2沒有腫瘤抑制作用。一項臨床研究同樣表明，通過聯(lián)合注射合成突變RAS肽和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子對胰腺癌患者進行免疫誘導治療，能夠延長對肽疫苗有免疫應答癌癥患者的生存期[28]。

本研究通過檢測小鼠腫瘤組織中CD3+、CD8+、CD28+T細胞表達情況判斷藥物激起小鼠體內免疫情況，取小鼠終點腫瘤組織提RNA，并反轉錄為cDNA，進行RT-qPCR檢測CD3+、CD8+、CD28+T細胞表達情況（圖6（f）～（h）），結果表明Ad-SNP1組腫瘤組織中免疫相關的CD3+、CD8+T細胞表達顯著上調（Plt;0.05），同時與T細胞活化、增殖相關的CD28+T細胞的表達也顯著上調（Plt;0.05），而Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4組腫瘤組織中CD3+、CD8+、CD28+T細胞的表達與對照組相比無顯著差異（Pgt;0.05）。這證明給藥后藥物通過激起了小鼠體內強烈的免疫反應從而抑制腫瘤生長。Gjertsen等[28]的研究也表明，對接種了含有突變Ras肽疫苗后的患者進行腫瘤活檢中，腫瘤組織中存在針對Ras突變的特異性T細胞，同時研究表明生存時間與疫苗免疫應答之間存在顯著關聯(lián)。

進一步，本研究將腫瘤組織切片后進行免疫熒光染色，從蛋白層面分析腫瘤組織中CD4+T以及CD8+T細胞免疫浸潤情況。免疫熒光結果（圖7（a）、圖7（c）～（d））顯示Ad-SNP1組CD4+、CD8+T細胞的陽性熒光信號明顯高于對照組（Plt;0.001）；而Ad-SNP2、Ad-SNP3、Ad-SNP4組與對照組相比CD4+、CD8+T細胞的陽性熒光信號無顯著性差異（Pgt;0.05），免疫熒光的結果跟RT-qPCR的趨勢一致。CD11B是整合素CR3（也叫補體受體3）的α鏈，主要表達在巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、NK細胞上，研究表明浸潤的中性粒細胞上CD11B表達水平升高，抗腫瘤活性增強[32]。于是本研究又將Ad-SNP1組的腫瘤組織切片進行了CD11B免疫熒光染色（圖7（b）、（e）），發(fā)現(xiàn)Ad-SNP1組腫瘤組織中與腫瘤細胞殺傷相關的CD11B+細胞浸潤也有顯著提升（Plt;0.05），進一步證明了Ad-SNP1通過激起強烈免疫從而抑制腫瘤生長。

3結論

通過基因治療的方式增加抗原負荷從而激起機體強烈的免疫反應達到抑制腫瘤生長可行，同時本文從4種表達載體中篩選出了效果最好的Ad-SNP1表達載體，Ad-SNP1載體在免疫實驗中激起小鼠免疫反應的能力是最強的，同時在移植瘤模型中顯示出較好的腫瘤抑制作用，且Ad-SNP1載體在小鼠腫瘤組織的相關免疫細胞浸潤也明顯高于對照組及其他3組，因此從4種病毒中篩選出藥效最好的Ad-SNP1載體藥物用于后續(xù)進一步的研究，為胰腺癌治療藥物的開發(fā)提供新的可能。

本文構建的Ad-SNP1載體藥物是針對KRASQ61H突變型癌癥的一種主動免疫治療方法，可以克服小分子藥物難以與KRAS的疏水口袋結合的問題和腫瘤浸潤淋巴細胞的分離和制備困難的問題。主動免疫治療相較于其他幾種療法有相對較少的副作用，對靶腫瘤細胞具有特異性，以及對腫瘤特異性抗原產(chǎn)生持久的記憶反應等幾種主要優(yōu)勢。同時KRASQ61H突變還常見于肺癌及結腸癌中，故Ad-SNP1還可用于其他多種含有KRASQ61H突變的癌癥治療，為更多含有KRASQ61H突變的癌癥患者帶來新的希望。