關(guān)鍵詞龍眼核；標(biāo)準(zhǔn)湯劑；抗氧化活性；正交實(shí)驗(yàn)；提取工藝

龍眼核為無患子科Sapindaceae植物龍眼DimocarpuslonganLour.的干燥成熟種子，性平，味微苦、澀，具有止血定痛、理氣化濕的功效，可用于創(chuàng)傷出血、癭疾、瘰疬、疝氣等疾病的治療[1]。由于龍眼核未被《中國藥典》收錄，且暫無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，造成其質(zhì)量控制難度增加、藥效難以保證、臨床應(yīng)用受限以及廣大患者權(quán)益難以保障等問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國每年作為加工副產(chǎn)品而被丟棄的龍眼核超過2萬噸[2]，給環(huán)境造成了巨大壓力。研究表明，龍眼核中含有豐富的多酚類、黃酮類等抗氧化活性成分[3]，這些抗氧化活性成分不僅可通過活化凝血因子激活凝血系統(tǒng)從而改善出血癥狀[4]，還可通過清除體內(nèi)自由基，減少細(xì)胞氧化損傷，起到減輕炎癥反應(yīng)和緩解炎癥反應(yīng)引起的疼痛的作用[5]。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣機(jī)不暢、濕邪阻滯會引起自由基代謝紊亂，導(dǎo)致機(jī)體過氧化和抗氧化失衡，具體表現(xiàn)為氧自由基增加、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）減少、丙二醛（malondialdehyde，MDA）增加[6]。龍眼核中的抗氧化成分有較強(qiáng)的自由基清除能力，有助于保持機(jī)體氣機(jī)的通暢和促進(jìn)濕氣的運(yùn)化，這也提示龍眼核藥用價值較大。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑是一種以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代制藥技術(shù)而形成的標(biāo)準(zhǔn)化提取制劑，具有無輔料干擾、質(zhì)量穩(wěn)定、療效可控等優(yōu)點(diǎn)，可以保障用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[7]，是配方顆粒以及其他劑型的基礎(chǔ)。在中藥提取工藝研究中，加水量、提取時間、提取次數(shù)對中藥有效成分的溶出均具有一定的影響[8]。為全面考察龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝合理性，本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)，以出膏率、沒食子酸含量、柯里拉京含量、鞣花酸含量及自由基清除能力為評價指標(biāo)，結(jié)合層次分析法（analytichierarchyprocess，AHP）法和基于指標(biāo)相關(guān)性的權(quán)重賦權(quán)系數(shù)（criteriaimportancethoughinter-criteriacorrelation，CRITIC）法進(jìn)行提取工藝研究，旨在為龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-2030Plus型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司）、SQP型萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、XSR205DU/A型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、KQ-800DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、InfiniteM200pro型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、UPH-Ⅳ-20TN型優(yōu)普系列超純水機(jī)（四川優(yōu)譜超純科技有限公司）、SCIENTZ-12N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用龍眼核藥材于2023年8月采集于福建莆田，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院田慧教授鑒定為無患子科Sapindaceae植物龍眼D.longanLour.的干燥成熟種子。

對照品沒食子酸（批號MUST-22112411，純度99.96%）、柯里拉京（批號MUST-23060211，純度99.99%）、鞣花酸（批號MUST-23033114，純度99.89%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）ammoniumsalt，ABTS]試劑（批號B2308190，純度98%）購自上海阿拉丁生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazylradical，DPPH）試劑（批號S041S224966，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 出膏率的測定

將龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑濃縮至500mL，精密吸取濃縮液10mL到已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，再于105℃下干燥3h，轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻30min，迅速稱質(zhì)量，按下片質(zhì)量，m1為空皿恒重，m2為含濃縮液蒸發(fā)皿恒重后質(zhì)量）。

2.2 指標(biāo)成分含量測定

2.2.1 色譜條件

采用島津ShimNexCSC18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～10min，5%A；10～20min，5%A→13%A；20～50min，13%A→17%A；50～60min，17%A→20%A；60～80min，20%A→50%A；80～90min，50%A→5%A）；流速為1.0mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為270nm；進(jìn)樣體積為10μL。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸對照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度依次為413.43、409.56、531.81μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 凍干粉供試品溶液的制備

取龍眼核100g，加8倍水浸泡30min后提取30min，收集濾液；藥渣加6倍水提取20min，合并濾液并濃縮至500mL。將濃縮液于－80℃冰箱中預(yù)凍12h，真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。取凍干粉0.2g，精密稱定，置于50mL具塞錐形瓶中，加甲醇25mL，精密稱定，超聲15min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得凍干粉供試品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察

參照2020年版《中國藥典》（四部）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)考察。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，凍干粉供試品溶液與混合對照品溶液在相同保留時間處有相同色譜峰出現(xiàn)（圖略），各待測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不少于5000，且空白溶液（甲醇）對測定無干擾，表明本方法系統(tǒng)適用性較好。以各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸的線性回歸方程分別為Y＝32191.00X+36752.00（r＝0.9999）、Y＝19671.00X+5411.20（r＝1.0000）、Y＝50255.00X－1512.90（r＝0.9997），線性范圍分別為10.33～413.43、10.24～409.56、13.30～531.81μg/mL。上述3種成分精密度試驗(yàn)的RSD分別為0.81%、0.62%、0.68%（n＝6）；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為1.36%、1.01%、0.90%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為1.44%、1.67%、1.73%（n＝6）；平均加樣回收率分別為97.04%、94.73%、101.04%，RSD分別為2.21%、2.24%、2.09%（n＝6）。

2.3 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

2.3.1 溶液的配制

精密稱取龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1mg/mL的供試品溶液。取DPPH適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.3mg/mL的DPPH甲醇溶液。上述溶液均避光保存，備用。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測定

參考文獻(xiàn)[9]方法，取“2.3.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的供試品溶液與DPPH甲醇溶液各100μL于同一孔中，作為實(shí)驗(yàn)組。以甲醇溶液代替DPPH甲醇溶液，其余操作同實(shí)驗(yàn)組，作為對照組；以甲醇溶液代替供試品溶液，其余操作同實(shí)驗(yàn)組，作為標(biāo)準(zhǔn)組。將各組樣品置于暗處反應(yīng)30min，使用酶標(biāo)儀于517nm波長處測定各組吸光度（A），按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率＝1－（A2－A1）/A（0式中，A2為實(shí)驗(yàn)組A，A1為對照組A，A0為標(biāo)準(zhǔn)組A）。運(yùn)用GraphPadPrism8.3.0軟件計(jì)算樣品對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度（halfclearanceconcentration，IC50），記為DPPH自由基IC50。

2.4 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

2.4.1 溶液的配制

精密稱取龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1mg/mL的供試品溶液。將3.84mg/mL的ABTS溶液與1.34mg/mL的過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，于室溫、暗處靜置16h后得ABTS自由基儲備液。使用前，以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）稀釋約20倍，得ABTS自由基工作液。

2.4.2 ABTS自由基清除率的測定

參考文獻(xiàn)[10]方法并適當(dāng)修改后進(jìn)行測定。取“2.4.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的供試品溶液20μL和ABTS自由基工作液180μL于同一96孔板中，作為實(shí)驗(yàn)組。以PBS代替ABTS工作液，其余操作同實(shí)驗(yàn)組，作為對照組。以PBS代替供試品溶液，其余操作同實(shí)驗(yàn)組，作為標(biāo)準(zhǔn)組。將各組樣品置于暗處反應(yīng)30min，使用酶標(biāo)儀于734nm波長處測定各組吸光度（A），按下式計(jì)算ABTS自由基清除率：ABTS自由基清除率＝1－（A2－A1）/A0（式中，A2為實(shí)驗(yàn)組A，A1為對照組A，A0為標(biāo)準(zhǔn)組A）。運(yùn)用GraphPadPrism8.3.0軟件計(jì)算樣品對ABTS自由基的IC50，記為ABTS自由基IC50。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)篩選提取工藝條件

稱取龍眼核藥材，每份100g，搗碎表皮及種仁，浸泡30min，按表1水平分別對加水量、提取時間、提取次數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)考察。將龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑濃縮至500mL，分別按“2.1”～“2.4”項(xiàng)下方法測定出膏率、指標(biāo)成分含量、DPPH自由基IC50和ABTS自由基IC50。結(jié)果（表1）顯示，在加水量為10～14倍時，出膏率變化不大，沒食子酸含量、柯里拉京含量、鞣花酸含量增加較為明顯，DPPH、ABTS自由基IC50較低，故選擇加水量為10～14倍進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。在提取時間為50min時出膏率最高，沒食子酸含量在提取90min時最高，提取時間為30min時柯里拉京含量、鞣花酸含量最高并且DPPH、ABTS自由基IC50最低，結(jié)合時間成本，選擇提取時間為15～50min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。出膏率隨提取次數(shù)的增加而升高，沒食子酸含量在提取4次時最高；柯里拉京含量、鞣花酸含量均在提取5次時最高，但與提取2～4次含量相差不大；ABTS自由基IC50變化趨勢亦如此，但在提取2次時DPPH自由基IC50最低。綜合時間、耗能等因素選擇提取2～4次進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.6 AHP-CRITIC法結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.6.1 AHP法計(jì)算權(quán)重

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，龍眼核具有良好的抗氧化活性[11―12]，為確保龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑的抗氧化效果，故將龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑對DPPH、ABTS自由基的清除能力作為第一重要指標(biāo)。多酚類成分為龍眼核抗氧化作用主要化學(xué)成分[3]，故將龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑中3種多酚類成分（沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸）含量作為第二重要指標(biāo)。出膏率雖然是判斷提取工藝穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，但未直接反映龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑抗氧化效果和化學(xué)信息[13]，故將其作為第三重要指標(biāo)。按DPPH自由基IC50＝ABTS自由基IC50＞沒食子酸含量＝柯里拉京含量＝鞣花酸含量＞出膏率的順序，采用SPSSPRO在線系統(tǒng)（https：//www.spsspro.com/）對評價指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，構(gòu)建判斷矩陣并進(jìn)行一致性評價。一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，最大特征根為6，一致性指標(biāo)為0，平均隨機(jī)一致性指標(biāo)為1.25，一致性比例＝0＜0.1，表明該判斷矩陣一致性良好[14]。根據(jù)該比較矩陣，得到出膏率、沒食子酸含量、柯里拉京含量、鞣花酸含量、DPPH自由基IC50、ABTS自由基IC50的權(quán)重分別為7.692%、15.385%、15.385%、15.385%、23.077%、23.077%。故AHP法的綜合得分＝出膏率實(shí)測值/最大值×7.692%+沒食子酸含量實(shí)測值/最大值×15.385%+柯里拉京含量實(shí)測值/最大值×15.385%+鞣花酸含量實(shí)測值/最大值×15.385%+DPPH自由基IC50最小值/實(shí)測值×23.077%+ABTS自由基IC50最小值/實(shí)測值×23.077%。

2.6.2 CRITIC法計(jì)算權(quán)重

根據(jù)文獻(xiàn)[15]方法，先對數(shù)據(jù)予以標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后采用SPSSPRO在線系統(tǒng)（https：//www.spsspro.com/）計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重，得到出膏率、沒食子酸含量、柯里拉京含量、鞣花酸含量、DPPH自由基IC50、ABTS自由基IC50的權(quán)重分別為19.823%、12.663%、20.759%、12.040%、14.754%、19.963%。故CRITIC法的綜合得分＝出膏率實(shí)測值/最大值×19.823%+沒食子酸含量實(shí)測值/最大值×12.663%+柯里拉京含量實(shí)測值/最大值×20.759%+鞣花酸含量實(shí)測值/最大值×12.040%+DPPH自由基IC50最小值/實(shí)測值×14.754%+ABTS自由基IC50最小值/實(shí)測值×19.963%。

2.6.3 AHP-CRITIC法計(jì)算綜合權(quán)重

根據(jù)AHP法、CRITIC法所得權(quán)重計(jì)算綜合權(quán)重（G綜合）∶G綜合ij＝（WAHPij×WCRITICij）/Σ（WAHPij×WCRITICij）；式中，WAHPij表示用AHP法計(jì)算得到的權(quán)重，WCRITICij表示用CRITIC法計(jì)算得到的權(quán)重，i、j分別表示指標(biāo)i和指標(biāo)j。經(jīng)計(jì)算，出膏率、沒食子酸含量、柯里拉京含量、鞣花酸含量、DPPH自由基IC50、ABTS自由基IC50的G綜合分別為9.224%、11.784%、19.320%、11.206%、20.597%、27.869%。

2.6.4 3種權(quán)重方法比較

分別按AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC法計(jì)算綜合得分，并采用SPSS27.0.1軟件對3種方法計(jì)算所得的綜合得分進(jìn)行相關(guān)性分析。經(jīng)計(jì)算，AHP法與CRITIC法、AHP法與AHP-CRITIC法、CRITIC法與AHP-CRITIC法的相關(guān)系數(shù)分別為0.983、0.999、0.986，三者兩兩比較均具有顯著相關(guān)性（P＜0.01），說明3種評分方法具有良好的一致性。同法對3種方法的權(quán)重進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，AHP法與CRITIC法權(quán)重的相關(guān)系數(shù)為－0.119，且不具有顯著性（P＝0.823＞0.05），表明二者所呈現(xiàn)的信息不存在重疊。由于AHP-CRITIC法同時兼顧主觀判斷與客觀數(shù)據(jù)，因此本研究最終采用AHP-CRITIC法計(jì)算綜合得分，即綜合得分＝出膏率實(shí)測值/最大值×9.224%+沒食子酸含量實(shí)測值/最大值×11.784%+柯里拉京含量實(shí)測值/最大值×19.320%+鞣花酸含量實(shí)測值/最大值×11.206%+DPPH自由基IC50最小值/實(shí)測值×20.597%+ABTS自由基IC50最小值/實(shí)測值×27.869%。

2.6.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期單因素結(jié)果，以加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為影響因素，以出膏率、沒食子酸含量、柯里拉京含量、鞣花酸含量、DPPH自由基IC50、ABTS自由基IC50為評價指標(biāo)，以AHP-CRITIC法計(jì)算各評價指標(biāo)綜合得分，采用L（934）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑提取工藝。因素與水平見表2，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3可知，各因素對提取工藝的影響順序?yàn)镃＞B＞A，且A3＞A2＞A1、B2＞B3＞B1、C2＞C3＞C1。由表4可知，因素C對提取工藝的影響顯著（P＜0.05），而因素A和B的影響不顯著（P＞0.05）。故確定最佳提取工藝為A3B2C2，即第1次提取加14倍水，提取30min，第2、3次提取均加12倍水，提取20min。

2.6.6 提取工藝驗(yàn)證

按“2.6.5”項(xiàng)下工藝制備3批樣品，進(jìn)行工藝驗(yàn)證，并按“2.1”～“2.4”項(xiàng)下方法測定各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果見表5。由表5可知，3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致性較高，證明所選的提取工藝穩(wěn)定可靠，具備良好的可重復(fù)性。

3 討論

3.1 色譜條件

本研究前期分別對凍干粉的提取條件（提取方式、提取溶劑種類、提取溶劑用量）以及液相色譜條件進(jìn)行了系統(tǒng)考察。最終確定凍干粉最佳提取條件為25mL甲醇超聲提取15min。色譜條件考察結(jié)果顯示，在270nm波長處各指標(biāo)成分吸收好，在流動相體系為乙腈-0.1%磷酸溶液時基線平穩(wěn)、各峰峰形尖銳且對稱，當(dāng)柱溫為30℃、流速為1.0mL/min時各色譜峰分離度較好。

3.2 龍眼核破碎程度

傳統(tǒng)煎煮認(rèn)為“逢殼必?fù)v，逢子必破”。龍眼核為龍眼干燥成熟種子，呈類球形，表皮呈紅褐色，剖開后有2片子葉，質(zhì)堅(jiān)硬。本研究前期對龍眼核破碎程度進(jìn)行了考察，在僅搗碎龍眼核表皮、不搗碎子葉的情況下，龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為6.54%，沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸含量分別為5.26、2.89、5.50mg/g，DPPH、ABTS自由基的IC50分別為0.2844、0.3700mg/mL，該情況下多酚類成分含量少，抗氧化效果較差，也不易凍干。結(jié)合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和文獻(xiàn)[16]分析，可能原因是此時提取液中化學(xué)成分多為龍眼核多糖，使得提取液較為黏稠，從而導(dǎo)致樣品在凍干和升華過程中擴(kuò)散困難，影響凍干效率；當(dāng)龍眼核表皮及子葉均被搗碎時，溶劑更易進(jìn)入藥材內(nèi)部，促使多酚類有效成分溶出，增強(qiáng)了抗氧化效果，也更易凍干，此時出膏率為18.44%，沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸含量分別為6.42、6.65、11.38mg/g，DPPH、ABTS自由基的IC50分別為0.2466、0.2433mg/mL。故本研究在進(jìn)行提取之前，將龍眼核表皮及子葉搗碎，并浸泡30min，以便有效成分溶出。

3.3 評價指標(biāo)及方法選擇原因

以往提取工藝研究多以出膏率、指標(biāo)成分含量作為評價指標(biāo)[17―18]，但中藥成分復(fù)雜，僅通過控制出膏率及有效成分含量無法確保得到的是最佳提取工藝。因此，為了更全面、深入地進(jìn)行評價，本研究在以關(guān)鍵指標(biāo)含量和出膏率為評價指標(biāo)的基礎(chǔ)上，將2個抗氧化藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為主要評價指標(biāo)。AHP法是一種主觀的評價方法，主要由研究者根據(jù)評價指標(biāo)的重要性進(jìn)行打分確定權(quán)重，CRITIC法則基于數(shù)據(jù)自身的變異性和指標(biāo)間的沖突性來確定權(quán)重[19]。本研究將AHP法與CRITIC法相結(jié)合，相較于單一的評分方法，既體現(xiàn)了研究者的主觀判斷，也反映了數(shù)據(jù)的客觀特征，可以減少單一評分方法所帶來的偏差和局限性，使評價結(jié)果更為科學(xué)、合理。再通過對加水量、提取時間、提取次數(shù)3個因素的綜合考察，優(yōu)化出龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑最佳提取工藝為第1次提取加14倍水，提取30min；第2、3次提取均加12倍水，提取20min。用此條件進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平均綜合得分為97.96分，RSD為0.97%，表明該工藝穩(wěn)定、可行。

綜上，本研究基于抗氧化活性，采用AHP-CRITIC法結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑提取工藝穩(wěn)定可行。本研究結(jié)果可為龍眼核標(biāo)準(zhǔn)湯劑的深入開發(fā)利用提供依據(jù)。