關(guān)鍵詞蛇床子素；超音刺猬信號(hào)通路；創(chuàng)面愈合；皮膚；血管生成

皮膚創(chuàng)面愈合是由多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及多種細(xì)胞參與的一種病理生理進(jìn)程，需要經(jīng)過(guò)止血、血管生成、炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成、纖維增殖或基質(zhì)形成、再上皮化等過(guò)程[1]。皮膚創(chuàng)面愈合能夠使皮膚保持完整性，然而在感染、過(guò)度炎癥、嚴(yán)重缺血甚至部分疾病的影響下，創(chuàng)面愈合的過(guò)程受到干擾，使得愈合時(shí)間明顯延長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了患者的身心健康[2]。研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)傷口的血管生成是加速皮膚創(chuàng)面愈合的有效策略之一[3]。常見(jiàn)的促進(jìn)傷口血管生成的藥物有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類藥物（如貝伐珠單抗、阿柏西普等）、血管生成素類藥物（如馬西替坦、利奧西呱）、前列環(huán)素類藥物（如前列地爾、依前列醇）等，但這些藥物會(huì)導(dǎo)致高血壓、出血、血栓等副作用。因此，開(kāi)發(fā)新的安全有效的藥物以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合和血管生成，已成為臨床研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

蛇床子素（osthole，OST）是提取自中藥蛇床子的一種天然化合物，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)骨關(guān)節(jié)、改善骨質(zhì)、改善免疫功能等作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，OST能減輕皮膚炎癥、修復(fù)皮膚屏障，在組胺誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞炎癥過(guò)程中，改善了細(xì)胞遷移和細(xì)胞屏障功能[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，OST可促進(jìn)血管生成，且其衍生物能夠加快皮膚傷口愈合[6―7]。超音刺猬（sonichedgehog，SHH）信號(hào)通路與胚胎發(fā)育、細(xì)胞自我更新和干細(xì)胞群維持密切相關(guān)，其被激活能夠促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合和血管形成[8]?；诖?，本研究擬建立全層皮膚缺損傷口模型大鼠，從SHH信號(hào)通路角度出發(fā)，研究OST對(duì)模型大鼠皮膚血管生成和創(chuàng)面愈合的影響及機(jī)制，以期為OST的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括RX50型光學(xué)顯微鏡[舜宇光學(xué)科技（集團(tuán)）有限公司]，AMR-100型酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司），CFXDuet型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）儀（美國(guó)Bio-Rad公司），500-151-30型游標(biāo)卡尺（蘇州天音騰達(dá)機(jī)電工程有限公司），Tanon5200型凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

OST對(duì)照品（批號(hào)S2337，純度99.99%）購(gòu)自美國(guó)SelleckChemical公司；SHH抑制劑環(huán)巴胺對(duì)照品（批號(hào)C4116，純度≥98%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒（批號(hào)分別為D006-1-4、D026-1-1）均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)SEKR-0055）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）ELISA試劑盒（批號(hào)D731030-0096）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、Trizol試劑（批號(hào)分別為FD2001、FD8872）均購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司；兔源血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascularendothelialgrowthfactorA，VEGFA）、SHH、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2，VEGFR-2）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1（glioma-associatedoncogenehomolog-1，GLI1）、GAPDH一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)分別為ab214424、ab308225、ab11939、ab273018、ab181602、ab6721）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，共72只，體重200～250g，雄性，7～8周齡，由湖北貝恩特生物科技有限公司提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（鄂）2021-0027]。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠在溫度23～25℃、相對(duì)濕度40%～60%的動(dòng)物房中分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后用于實(shí)驗(yàn)。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)的審核（倫理號(hào)為HLK-20220719）。

2 方法

2.1 大鼠全層皮膚缺損傷口模型的構(gòu)建

參考文獻(xiàn)方法，構(gòu)建大鼠全層皮膚缺損傷口模型[9―10]。將60只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉，背部脫毛、消毒，備皮面積為2cm2。大鼠固定后在背部脊柱一側(cè)標(biāo)記一個(gè)圓形切口，切口平行于脊柱，沿標(biāo)記線切除全層皮膚，深至筋膜層，形成創(chuàng)面。次日，肉眼可見(jiàn)創(chuàng)面少許滲血，且無(wú)感染，則表明造模成功。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

本研究共造模成功60只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組（即Model組），低、中、高劑量OST組（即OST-L、OST-M、OST-H組，20、30、40mg/kgOST[11]）和高劑量OST+SHH抑制劑環(huán)巴胺組（即OST-H+環(huán)巴胺組，40mg/kgOST+10mg/kg環(huán)巴胺[12]），每組12只；另選取12只大鼠為對(duì)照組（僅剃除皮膚毛發(fā)，不造模）。OST-L組、OST-M組、OST-H組大鼠分別腹腔注射20、30、40mg/kgOST；OST-H+環(huán)巴胺組在腹腔注射40mg/kgOST前30min，腹腔注射10mg/kg環(huán)巴胺；每天給藥1次，給藥體積均為10mL/kg，連續(xù)14d。Model組和對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

2.3 大鼠創(chuàng)面愈合率的計(jì)算

在給藥第1、7、14天時(shí)觀察大鼠創(chuàng)面愈合情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量創(chuàng)面直徑，并進(jìn)行拍照；采用ImageJ軟件計(jì)算大鼠的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率＝（用藥前創(chuàng)面面積－用藥后創(chuàng)面面積）/用藥前創(chuàng)面面積×100%。

2.4 大鼠創(chuàng)面組織的病理學(xué)形態(tài)觀察

采用HE染色法觀察。末次給藥后，所有大鼠脫頸處死，每組隨機(jī)選取6只大鼠，切除創(chuàng)面組織，固定于多聚甲醛中，組織脫水后制成石蠟切片，一部分切片行HE染色，另一部分備用。取HE染色的切片，于光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織的病理學(xué)變化。

2.5 大鼠創(chuàng)面組織膠原蛋白沉積情況觀察

采用Masson染色法觀察。取“2.4”項(xiàng)下剩余的創(chuàng)面組織切片，根據(jù)Masson染色試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織形態(tài)并拍照。采用ImageJ軟件計(jì)算膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量，膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量＝（藍(lán)染的膠原纖維面積/視野總面積）×100%。

2.6 大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)。將每組剩余6只大鼠處死，剖取創(chuàng)面組織，一部分置于冰上加入裂解液進(jìn)行裂解，另一部分凍存于－80℃條件下，待用。將制備的創(chuàng)面組織勻漿，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書方法操作，檢測(cè)大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平。

2.7 大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

采用RT-qPCR法檢測(cè)。取“2.6”項(xiàng)下凍存的創(chuàng)面組織適量，用Trizol試劑提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：4μLcDNA，25μLSYBRGreenPCRMasterMix，正反向引物對(duì)各1μL，ddH2O19μL，總體積為50μL。擴(kuò)增條件為：聚合酶活化10min，94℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，45次循環(huán)。本研究所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，序列信息如表1所示。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算VEGFA、VEGFR-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Westernblot法檢測(cè)。取“2.6”項(xiàng)下凍存的創(chuàng)面組織適量，用RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行變性處理。取變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%牛血清蛋白溶液封閉2h，加入VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1、GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1000）于4℃過(guò)夜孵育；加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶5000）于室溫孵育2h，采用ECL試劑顯色，經(jīng)凝膠成像后，采用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行歸一化。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPadPrism7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 OST對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合率的影響

與Model組比較，OST-M組、OST-H組大鼠給藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組比較，OST-M組、OST-H組大鼠給藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組比較，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠給藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

3.2 OST對(duì)大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化的影響

對(duì)照組大鼠皮膚組織表皮完整。Model組大鼠創(chuàng)面組織再上皮化不明顯，新生血管數(shù)較少，肉芽組織出現(xiàn)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重。與Model組相比，OST-L組、OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織再上皮化明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肉芽組織水腫減輕，新生血管數(shù)增多，其中OST-H組大鼠的創(chuàng)面組織損傷明顯減輕。與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織再上皮化不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加重，新生血管數(shù)減少。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.3 OST對(duì)大鼠創(chuàng)面組織膠原蛋白沉積的影響

對(duì)照組大鼠皮膚組織膠原纖維和膠原蛋白含量豐富，排列緊密，膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量為（45.76±2.15）%。與對(duì)照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積減少，膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量[（5.35±0.80）%]顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，OST-L組、OST-M組和OST-H組大鼠創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積增多，膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量[（12.06±1.14）%、（20.87±1.59）%、（34.52±2.06）%]均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）。與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積減少，膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量[（8.21±1.05）%]顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.4 OST對(duì)大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平的影響

與對(duì)照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖5。

3.5 OST對(duì)大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

與對(duì)照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖6。

3.6 OST對(duì)大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖7。

4 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，皮膚創(chuàng)面愈合需要經(jīng)過(guò)凝血期、炎癥期、增殖期和重塑期：在創(chuàng)面形成初期，毛細(xì)血管內(nèi)血液流入創(chuàng)面，形成凝血塊覆蓋在創(chuàng)面表層；在炎癥期，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞在創(chuàng)面聚集并吞噬病原體，同時(shí)伴隨大量肉芽組織形成，成纖維細(xì)胞逐漸遷移，膠原蛋白沉積增多[13]。血管網(wǎng)形成和血管再生在創(chuàng)面愈合中非常關(guān)鍵，新生血管為創(chuàng)面組織細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)；Ang-1、VEGFA是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，其中VEGFA可參與芽生血管形成[14]。bFGF是從腦組織與垂體抽提物中發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，同時(shí)還可增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)血管新生和修復(fù)[15]。VEGFR-2是生長(zhǎng)因子受體，具有促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的作用[16]。

OST是蛇床子的活性成分，Kordulewska等[5]研究發(fā)現(xiàn)其在皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程中具有潛在作用：在組胺誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞炎癥過(guò)程中，OST降低了白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α水平，改善了細(xì)胞遷移和細(xì)胞屏障功能。本研究結(jié)果顯示，Model組大鼠創(chuàng)面新生血管數(shù)較少，肉芽組織出現(xiàn)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重；創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積減少；創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平和VEGFA、VEGFR-2mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高，與李學(xué)鋒[17]的研究一致，說(shuō)明大鼠皮膚遭受創(chuàng)傷后自體修復(fù)機(jī)制被激活。經(jīng)OST干預(yù)后，大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率和創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平以及VEGFA、VEGFR-2mRNA和蛋白表達(dá)水平均進(jìn)一步升高。這說(shuō)明OST可通過(guò)上調(diào)血管生成相關(guān)因子水平，促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合和血管生成，從而加快機(jī)體對(duì)創(chuàng)面損傷的修復(fù)作用。有報(bào)道顯示，OST具有抑制原發(fā)性肝癌、鼻咽癌等腫瘤血管生成的作用[6，18]；此外，OST雖然不能直接促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，但具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨-血管生成耦合的能力[19]。這與本研究中OST促進(jìn)創(chuàng)面血管生成的結(jié)果不相符，推測(cè)導(dǎo)致其發(fā)揮不同作用的原因可能與藥物的作用效果受到其所處的生理或病理環(huán)境的影響有關(guān)[6，18―19]。

SHH信號(hào)通路在血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其通過(guò)調(diào)控下游分子GLI1影響血管生成[8]。朱美霖等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在急性腦缺血大鼠中，SHH信號(hào)通路激活劑Purmorphamine可以激活缺血半暗帶中SHH信號(hào)通路并促進(jìn)血管新生，而環(huán)巴胺可以通過(guò)抑制SHH信號(hào)通路來(lái)抑制血管新生。孫浩等[21]研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室自制的毛囊再生乳膏能夠通過(guò)調(diào)控毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的Wnt信號(hào)通路和SHH信號(hào)通路促進(jìn)創(chuàng)面愈合時(shí)的毛囊再生。既往研究顯示，正常小鼠皮膚損傷后，SHH蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明皮膚受損會(huì)刺激SHH信號(hào)通路活化[22]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)OST干預(yù)后，大鼠創(chuàng)面組織中SHH、GLI1蛋白表達(dá)水平相比對(duì)照組升高。進(jìn)一步使用SHH抑制劑環(huán)巴胺干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，大鼠創(chuàng)面組織中SHH、GLI1蛋白表達(dá)水平降低，這說(shuō)明環(huán)巴胺減弱了OST的作用效果，提示OST可能通過(guò)激活SHH信號(hào)通路促進(jìn)大鼠皮膚血管生成和創(chuàng)面愈合。

綜上所述，OST可促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面愈合和血管生成，其機(jī)制可能與激活SHH信號(hào)通路有關(guān)。但本研究仍有一些不足，如未設(shè)置單獨(dú)的SHH信號(hào)通路激活劑組、缺少相關(guān)體外細(xì)胞水平的研究、機(jī)制不夠全面等，還需進(jìn)一步探究。此外，OST促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合的最佳給藥劑量和給藥途徑（全身給藥或局部皮膚給藥）仍需深入分析。