關(guān)鍵詞心腦舒通膠囊；腦缺血再灌注損傷；鐵死亡；Nrf2/HO-1/GPX4信號(hào)通路

缺血性腦卒中是由大腦局部供血障礙所導(dǎo)致的神經(jīng)功能受損、腦組織壞死的一類疾病，其發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率、病死率均較高，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前，缺血性腦卒中的臨床治療以靜脈溶栓和動(dòng)脈內(nèi)血栓切除術(shù)為主，以恢復(fù)缺血腦組織的血液供應(yīng)。然而，缺血腦組織在快速再灌注時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列繼發(fā)性病理?yè)p傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebralischemia-reperfusioninjury，CIRI），進(jìn)而阻礙患者神經(jīng)功能的恢復(fù)；CIRI的病理機(jī)制較為復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等過程[2―3]。因此，深入研究CIRI的病理過程對(duì)于探索有效的防治策略至關(guān)重要。

鐵在腦組織內(nèi)存在著動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)腦缺血再灌注時(shí)，腦組織細(xì)胞損傷，血腦屏障破壞，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的鐵水平急劇升高，從而引發(fā)鐵超載、脂質(zhì)過氧化、鐵代謝紊亂等，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞鐵死亡[4―5]。近年來，相關(guān)研究證實(shí)，鐵死亡是誘發(fā)CIRI的一種新機(jī)制，與腦組織細(xì)胞死亡密切相關(guān)[6―7]?？梢?，抑制鐵死亡逐漸成為減輕CIRI患者神經(jīng)損傷的一種重要方法。

心腦舒通膠囊是由中藥蒺藜干燥的地上全草提取后制成的膠囊劑，其主要成分是蒺藜總皂苷，具有活血化瘀、舒利血脈等藥理作用[8]。藥理實(shí)驗(yàn)研究顯示，心腦舒通膠囊能夠顯著提高CIRI沙鼠的成活率，減輕沙鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[9]；心腦舒通膠囊可促進(jìn)大鼠腦缺血后微血管新生和神經(jīng)功能恢復(fù)[10]。研究顯示，核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2，Nrf2）/血紅素氧合酶1（hemeoxygenase1，HO-1）/谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）是鐵死亡的關(guān)鍵通路，激活Nrf2/HO-1/GPX4信號(hào)通路可抑制CIRI大鼠神經(jīng)元鐵死亡[11]?；诖?，本研究擬采用短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞（transientmiddlecerebralarteryocclusion，tM-CAO）法建立CIRI大鼠模型，并從Nrf2/HO-1/GPX4信號(hào)通路角度出發(fā)，探討心腦舒通膠囊是否可通過調(diào)控鐵死亡途徑改善CIRI，以期為心腦舒通膠囊的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠，共50只，體重180～200g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）20220006。大鼠飼養(yǎng)于河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22～25℃、濕度50%～70%的環(huán)境中，自由進(jìn)食與飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為HNTCMDW-2024050502。

1.2 主要藥品與試劑

心腦舒通膠囊（批號(hào)2108026，規(guī)格為每粒含呋甾皂苷15mg）購(gòu)自吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司；銀杏葉提取物片（批號(hào)7491222，規(guī)格為每片含銀杏葉提取物40mg）購(gòu)自德國(guó)威瑪舒培博士藥廠；組織鐵、脂質(zhì)過氧化物（lipidperoxide，LPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為2309001、2309002、1310003、2310004）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TTC染色試劑盒（批號(hào)20230630）購(gòu)自南京建成科技有限公司；兔源HO-1、GPX4抗體（批號(hào)分別為ab189491、ab125066）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔源Nrf2抗體（批號(hào)16396-1-AP）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)AB-P-R001）購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號(hào)B42Q00103）購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（批號(hào)分別為BL520A、BL699A、BL697A）均購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成。

1.3 主要儀器

本研究所用主要儀器有SynergyNEO型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、FluorChemR型凝膠成像分析儀（美國(guó)ProteinSimple公司）、TG16KK型高速低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、Quanstudio5型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)ThermoFisherScientific公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，心腦舒通低、高劑量組（220、440mg/kg，低、高劑量分別為臨床等效劑量的2、4倍），銀杏葉提取物組（陽性對(duì)照，150mg/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得），每組10只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，均連續(xù)7d。

2.2 造模與取材

采用tM-CAO法構(gòu)建CIRI大鼠模型。術(shù)前禁食不禁水12h，各給藥組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，以仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，沿頸部正中間切口并進(jìn)行鈍性肌肉分離，暴露出頸總動(dòng)脈（commoncarotidartery，CCA），然后小心分離出右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈（internalcarotidartery，ICA）和頸外動(dòng)脈（externalcarotidartery，ECA），結(jié)扎CCA近心端和ECA，將尼龍線栓由CCA的剪口處插入ICA，緩慢向前推進(jìn)約20mm，使尼龍線末端位于大腦前動(dòng)脈進(jìn)而堵塞大腦中動(dòng)脈；缺血2h后，緩慢勻速拔出尼龍線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)操作，但不插入線栓。再灌注24h后，采用Zea-Longa評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：無明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀為0分；提尾時(shí)向左側(cè)前肢屈曲為1分；不能直行，向左側(cè)行走為2分；行走困難，站立或爬行時(shí)向左側(cè)傾倒為3分；無法自主行走伴意識(shí)障礙為4分。1～3分為造模成功；0分為造模失??；評(píng)分為4分的大鼠容易死亡，予以剔除[12]。造模過程中，模型組大鼠死亡3只，銀杏葉提取物組死亡1只，心腦舒通低、高劑量組均死亡2只。評(píng)分完成后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，血樣靜置1h后以3000r/min離心10min，吸取上清液，于－80℃冰箱中保存，備用。采血后，大鼠迅速斷頭取出腦組織，生理鹽水清洗2遍，濾紙拭干后于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠腦梗死面積檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下各組4只大鼠的腦組織，去除腦干、小腦和嗅球后于－20℃冷凍20min；用手術(shù)刀片將腦組織沿冠狀面均勻切成5片（每片厚2mm），然后用2%TTC染液于37℃水浴條件避光染色15min，再以4%多聚甲醛固定后拍照，正常部位為紅色，梗死區(qū)為白色。將TTC染色圖片導(dǎo)入ImageJ軟件計(jì)算梗死面積，并計(jì)算腦梗死率，腦梗死率＝梗死面積/橫切總面積×100%。

2.4 大鼠腦組織病理學(xué)變化觀察

取“2.2”項(xiàng)下各組3只大鼠的腦組織適量，以4%多聚甲醛固定24h后進(jìn)行石蠟包埋切片，將切片脫蠟后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，然后采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化。

2.5 大鼠腦組織中總鐵水平和血清中LPO、MDA、GSH水平檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠血清適量以及各組3只大鼠腦組織適量，根據(jù)ELISA試劑盒方法處理，檢測(cè)大鼠腦組織中總鐵水平和血清中LPO、MDA和GSH水平。

2.6 大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下各組3只大鼠缺血側(cè)腦組織（假手術(shù)組對(duì)應(yīng)側(cè)腦組織）適量，加入RIPA裂解液裂解，冷凍研磨儀中研磨后，以12000r/min離心10min，吸取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性處理后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以封閉液封閉1h，加入Nrf2、HO-1、GPX4、GAPDH一抗（稀釋度分別為1∶2000、1∶2000、1∶3000、1∶1000）于4℃下孵育過夜，再加入二抗（稀釋度為1∶5000）室溫孵育1h；在暗室中加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液顯色成像，采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.7 大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下各組3只大鼠缺血側(cè)腦組織（假手術(shù)組對(duì)應(yīng)側(cè)腦組織）10mg，采用Trizol法提取總RNA，測(cè)定濃度和純度后，參照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系（20μL）為：PCR試劑10μL，正、反向引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ROX試劑0.4μL，ddH2O7.6μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸10s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達(dá)水平。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件和GraphPadPrism軟件分別進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。計(jì)量資料x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 心腦舒通膠囊對(duì)大鼠腦梗死面積的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的腦梗死現(xiàn)象，腦梗死率為（29.10±5.94）%。與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通低、高劑量組大鼠腦梗死率[分別為（20.18±3.54）%、（20.04±3.2）%、（22.01±5.22）%]均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

3.2 心腦舒通膠囊對(duì)大鼠腦組織病理?yè)p傷的影響

由圖2可見，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞核膜清晰完整，排列正常有序。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血核心區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞呈空泡樣改變，出現(xiàn)大片壞死細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少且排列紊亂，間質(zhì)水腫，細(xì)胞核固縮。銀杏葉提取物組和心腦舒通低、高劑量組大鼠的腦組織病理?yè)p傷均有不同程度減輕，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，水腫減輕，核膜平整。

3.3 心腦舒通膠囊對(duì)大鼠腦組織及血清中生化指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組[總鐵水平（2.35±0.13）μg/g]比較，模型組大鼠腦組織中總鐵水平[（3.32±0.36）μg/g]和血清中LPO、MDA水平均顯著升高（P＜0.01），GSH水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通低、高劑量組大鼠腦組織中總鐵水平[（2.64±0.42）、（2.49±0.20）、（2.64±0.26）μg/g]均顯著降低（P＜0.05），血清中GSH水平均顯著升高（P＜0.05）；心腦舒通高劑量組大鼠血清中LPO顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 心腦舒通膠囊對(duì)大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通各劑量組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

3.5 心腦舒通膠囊對(duì)大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏葉提取物組和心腦舒通各劑量組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表3。

4 討論

腦卒中可分為缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中在全部腦卒中所占的比例最大，呈逐步年輕化趨勢(shì)[13]。應(yīng)對(duì)缺血性卒中最主要的方法就是血管重建和限制繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷，臨床上常運(yùn)用溶栓方法恢復(fù)缺血腦組織血流，但是只有很少一部分患者能夠在有效的時(shí)間窗內(nèi)接受治療，且溶栓后患者還會(huì)遭受CIRI，因此深入研究CIRI的發(fā)病機(jī)制，探索有效的防治措施來減輕CIRI尤為重要。研究表明，CIRI發(fā)生機(jī)制主要與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血腦屏障功能障礙有關(guān)，常伴隨著凋亡、焦亡、壞死等多種細(xì)胞死亡形式[14]。鐵死亡是由于細(xì)胞內(nèi)鐵離子過載、脂質(zhì)過氧化物過度積累引起的細(xì)胞破裂性死亡[15]，是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞新型死亡方式，抑制鐵死亡已成為心、腦等器官缺血再灌注損傷的防治策略[16]。

藥理實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，心腦舒通膠囊具有提高耐缺氧能力、增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力、抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、保護(hù)心肌、抗腦缺血等作用[17―19]。臨床上，心腦舒通膠囊對(duì)腦梗死等缺血性腦病有一定的療效，王豪杰等[20]對(duì)58例缺血性腦病患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)心腦舒通膠囊可顯著降低缺血性腦病患者頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度和血清同型半胱氨酸水平，從而降低缺血性腦病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。曾松等[21]對(duì)106例腦梗死患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)心腦舒通膠囊可促進(jìn)腦梗死患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，效果顯著。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄因子，也是鐵死亡過程中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子。在靜息細(xì)胞中，Nrf2與Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-likeECH-associatedprotein1，Keap1）相結(jié)合并存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；當(dāng)機(jī)體受到H2O2、MDA或某些疾病刺激時(shí)，激活的Nrf2與Keap1分離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活下游HO-1和GPX4等抗氧化基因的表達(dá)[22]。GPX4是一種GSH依賴性抗氧化酶，其可通過GSH的作用有效清除有毒的脂質(zhì)過氧化物（如LPO等），從而抑制細(xì)胞氧化損傷[23]。本研究結(jié)果顯示，大鼠CIRI后神經(jīng)功能變差，且腦梗死面積增大，腦組織發(fā)生顯著的病理學(xué)改變；腦組織中總鐵水平增加，血清中LPO、MDA水平升高，GSH水平降低；Nrf2、HO-1、GPX4等鐵死亡關(guān)鍵靶蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低，這提示CIRI大鼠腦組織存在鐵死亡現(xiàn)象。經(jīng)心腦舒通膠囊干預(yù)后，大鼠腦梗死面積減小，神經(jīng)功能和腦組織病理?yè)p傷改善，血清中GSH水平升高，LPO水平降低，腦組織中總鐵水平降低，腦組織中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高，這提示心腦舒通膠囊能夠抑制CIRI后鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，心腦舒通膠囊可抑制鐵死亡，減輕CIRI，其作用機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1/GPX4信號(hào)通路有關(guān)。