摘要：本研究旨在篩選出能夠產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿的苦豆子（Sophora alopecuroides）內(nèi)生真菌菌株，探究其發(fā)酵條件，提高堿產(chǎn)率。以前期從苦豆子健康種子中分離的50株內(nèi)生真菌為材料，采用薄層色譜法、高效液相色譜法和酸性染料比色法進(jìn)行產(chǎn)生物堿菌株的篩選，對獲得的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和多基因序列比對分析，確定分類地位。隨后，通過單因素和響應(yīng)面法探究添加L-哌啶酸、L-賴氨酸和α-酮戊二酸對產(chǎn)生物堿菌株堿產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明，共篩選出3株高活性產(chǎn)槐定堿菌株DSD103，DSD201和DSD308，均屬于互隔鏈格孢（Alternaria alternata），其菌絲中槐定堿的產(chǎn)率分別為0.212，0.544和0.276 mg·g-1。堿產(chǎn)率最高的菌株DSD201在L-哌啶酸濃度為1.079 μmol·L-1、L-賴氨酸濃度為6.251 μmol·L-1和α-酮戊二酸濃度為0.153 μmol·L-1時，菌絲中堿產(chǎn)率達(dá)到最大，為0.949 mg·g-1，比對照提高了74.12%。所篩選的產(chǎn)生物堿菌株為通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞：苦豆子內(nèi)生真菌；產(chǎn)生物堿菌株；篩選；發(fā)酵條件優(yōu)化；喹諾里西啶類生物堿

中圖分類號：TQ920.6 " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A " " " "文章編號：1007-0435（2025）01-0307-10

Screening of Alkaloid-producing Endophytic Fungi from Sophora alopecuroides and Optimization of their Fermentation Conditions

WANG Wen-kai1， JU Ming-xiu1， JIN Jing2， LIU Guan-lan1， GU Pei-wen1*

（1.Agricultral College， Ningxia University， Yinchuan， Ningxia Hui Autonomous Region 750021， China；

2.Yinchuan Jinfeng District Agricultural Rural and Water Affairs Bureau， Yinchuan， Ningxia Hui Autonomous Region 750001， China）

Abstract：The aim of this study was to screen the endophytic fungal strains of Sophora alopecuroides that can produce Quinolizidine alkaloid， to explore the fermentation conditions and improve alkaloid production. Fifty endophytic fungal strains isolated from healthy seeds of S. alopecuroides in the previous period were used as materials. The alkaloid-producing strains were screened by Thin-Layer Chromatography， High-Performance Liquid Chromatography and Acid-dye colorimetry. The alkaloid-producing strains obtained were analyzed by morphology and multi-gene sequence comparison to determine the taxonomic status. Subsequently， the effects of the addition of precursors such as L-pipericolic acid， L-lysine and α-ketoglutaric acid on the alkaloid yields of alkaloid producing strains were explored by one-way and response surface methodology. The results showed that a total of three highly active Sophoridine-producing strains， DSD103， DSD201 and DSD308， all belonging to Alternaria alternata， were screened， and the alkaloid yields of Sophoridine in their mycelia were 0.212， 0.544 and 0.276 mg·g-1. The highest alkaloid yielding strain， DSD201， was obtained with the addition of the precursors L-pipericolic acid at a concentration of 1.079 μmol·L-1， L-lysine at a concentration of 6.251 μmol·L-1， and α-ketoglutaric acid at a concentration of 0.153 μmol·L-1. Under this conditions， the alkaloid yield in mycelium reached the maximum of 0.949 mg·g-1， which was 74.12% higher than that under the control conditions. The screened alkaloid-producing strains provide a new method for the production of Quinolizidine alkaloid by microbial fermentation.

Key words：Endophytic fungi of Sophora alopecuroides；Alkaloid-producing strains；Screening；Optimization of fermentation conditions；Quinolizidine alkaloid

苦豆子（Sophora alopecuroides）為豆科槐屬多年生的草本植物，主要分布在西北干旱地區(qū)的荒漠、半荒漠地區(qū)，具有良好的耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠和防風(fēng)固沙的作用，是荒漠草原重要的先鋒植被之一［1］?？喽棺尤菘扇胨帲饕行С煞质青Z里西啶類生物堿，包括槐定堿（Sophoridine，SR）、氧化苦參堿（Oxymatrine，OMA）、苦參堿（Matrine，MA）、槐果堿（Sophocarpine，SC）和氧化槐果堿（Oxysophocarpine，OSC）［2］，具有抗腫瘤、抗病毒等多種藥理功效［3］。在植物病蟲害生物防治中，苦豆子還具有殺菌抗蟲等活性［4］?，F(xiàn)階段，喹諾里西啶類生物堿的提取主要來源于野生苦豆子植株，但苦豆子野生資源有限，過度采收將導(dǎo)致大量天然草場退化，嚴(yán)重威脅著草地的生態(tài)平衡。人工栽培苦豆子不經(jīng)濟(jì)，存在發(fā)芽率低、生長緩慢、成本較高，且有效成分活性降低等問題，難以滿足藥用市場對苦豆子的大量需求［5］。

植物中普遍存在內(nèi)生真菌，諸多菌株能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的活性物質(zhì)［6］。目前，國內(nèi)外學(xué)者已從香樟木（Cinnamomum camphora）［7］、千層塔（Polystictus versicolor）［8］、滇重樓（Paris polyphylla）［9］等多種珍稀植物中分離出能夠產(chǎn)生喜樹堿、石杉堿、甾體等活性成分的內(nèi)生真菌，通過對內(nèi)生真菌的人工選育和發(fā)酵培養(yǎng)可源源不斷地合成與宿主植物相同的活性物質(zhì)［10］，從而有效降低人類對珍稀植物資源的過度依賴和破壞。例如，El-Sayed等［11］從紅豆杉（Taxus baccata）中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌株（Epicoccum nigrum），產(chǎn)率為61.35 mg·L-1，采用優(yōu)化栽培條件和營養(yǎng)條件，產(chǎn)量顯著提高88.59%。王維夫等［12］從小花棘豆（Oxytropis glabra）分離出鏈格孢屬（Alternaria）內(nèi)生真菌，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）均測出苦馬豆素，其水平為0.832～573.24 μg·g-1，并確定有鏈格孢屬內(nèi)生真菌的小花棘豆植株含苦馬豆素，無該內(nèi)生真菌的植株不含苦馬豆素。因此，若從苦豆子中篩選出能夠產(chǎn)生喹諾里西啶類生物堿的內(nèi)生真菌，并利用真菌生物合成策略提高有效成分產(chǎn)量，將為野生苦豆子資源的合理利用和西部天然草場生態(tài)保護(hù)提供新的途徑。

近年來的研究表明，苦豆子中蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生真菌。Ju等［13］通過高通量測序和高效液相色譜法（High-performance liquid chromatography，HPLC）發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬內(nèi)生真菌數(shù)量與苦豆子氧化苦參堿、氧化槐果堿和喹諾里西啶類總堿的含量呈正相關(guān)，表明苦豆子種子中的鏈格孢屬內(nèi)生真菌可能具有促進(jìn)宿主體內(nèi)生物活性化合物積累的潛力。余永濤等［14］對寧夏苦豆子健康植株內(nèi)生真菌進(jìn)行篩選，得到了3株能夠產(chǎn)苦參堿的內(nèi)生真菌，均屬于Simplicillium lanosoniveum，其菌絲中苦參堿的含量范圍為17.4～37.6 μg·g-1。近年來，關(guān)于苦豆子喹諾里西啶類生物堿的生物合成途徑逐漸被人們認(rèn)識。研究發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸是喹諾里西啶類生物堿合成的前體物質(zhì)，賴氨酸通過賴氨酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生尸胺，尸胺在銅胺氧化酶的作用下氧化脫氨基形成5-氨基戊醛，其自發(fā)環(huán)化成Δ1-哌啶席夫堿，但后續(xù)的合成機(jī)制尚未完全闡明［15］。據(jù)Bunsupa等［16］報道L-哌啶酸與α-酮戊二酸是一種廣泛存在于生命體內(nèi)的中間體。L-哌啶酸可以通過縮合、水解、甲基化等反應(yīng)產(chǎn)生多種賴氨酸衍生的生物堿［17］。而α-酮戊二酸與L-賴氨酸的縮合反應(yīng)也是許多生物堿合成途徑中的一個重要步驟［18］。因此，推測L-賴氨酸、L-哌啶酸和α-酮戊二酸可能是苦豆子內(nèi)生真菌喹諾里西啶類生物堿合成的前體物質(zhì)或者中間產(chǎn)物。

本研究以從寧夏鹽池縣德勝墩村天然草場采集的苦豆子種子中分離的50株純化內(nèi)生真菌菌株為材料，篩選能夠產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿的內(nèi)生真菌菌株，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)確定其分類地位。隨后通過單因素和響應(yīng)面探究添加L-哌啶酸、L-賴氨酸和α-酮戊二酸對該菌株堿產(chǎn)率的影響，進(jìn)而提高該菌株產(chǎn)生物堿的產(chǎn)率，為苦豆子內(nèi)生真菌資源開發(fā)利用和實(shí)現(xiàn)苦豆子生物堿發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株材料

2020年9月，在寧夏鹽池縣德勝墩村（37°47′42″ N，107°31′2″ E，海拔1336.4 m）選擇健康無病蟲害的野生苦豆子群落。采樣區(qū)按“Z”型方式設(shè)置采樣點(diǎn)，每樣點(diǎn)面積為25 m2，分別隨機(jī)采集20個豆莢，3個樣點(diǎn)共60個豆莢，帶回實(shí)驗室進(jìn)行脫粒。將每份樣品去除病蟲害、干癟和機(jī)械損傷的種子，保留飽滿健康的種子，并以四分法進(jìn)一步取樣，每份樣品約5 g種子，用于內(nèi)生真菌的分離。參照吳可欣等［19］的方法進(jìn)行內(nèi)生真菌分離、純化，并對其進(jìn)行編號（DSD101～DSD317），共得到50株純化真菌菌株，于4℃保存在寧夏大學(xué)植物病理實(shí)驗室菌種保藏箱。

1.2 產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿內(nèi)生真菌的篩選

1.2.1 待測樣品制備 將50株苦豆子內(nèi)生真菌菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA），26℃培養(yǎng)7 d后，打取5個直徑0.8 cm菌餅接種于150 mL馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（Potato dextrose broth，PDB）中，26℃，175 r·min-1于SPX-350型恒溫振蕩培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)7 d后，用4層無菌紗布過濾收集菌絲體，將菌絲體在55℃的DHG型恒溫干燥箱中干燥至恒重后，在研缽中研磨菌絲體至粉末后。稱取1 g菌絲體，置于50 mL離心管中，加入30 mL甲醇，混合均勻，45℃下用CSF-1A型超聲波發(fā)生器超聲處理60 min，9500 r·min-1離心10 min，將上清液過0.45 μm濾膜后，于RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至2 mL，4℃保存待檢。

1.2.2 薄層色譜檢測 參照金婧［20］的薄層色譜法（Thin-layer chromatography，TLC）并修改，分別吸取槐定堿（SR）、苦參堿（MA）、槐果堿（SC）、氧化苦參堿（OMA）、氧化槐果堿（OSC）標(biāo)準(zhǔn)品與供試菌株菌絲提取溶液樣品各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以乙酸乙酯∶乙醇∶濃氨水（5∶1∶0.5）為展開劑進(jìn)行展開。展開后，取出并晾干，噴以碘化鉍鉀溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，日光下檢視。觀察待測樣品與生物堿標(biāo)準(zhǔn)品在薄層板上的位移和染色顏色。如果待測樣品的斑點(diǎn)與生物堿標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)一致，則可初步判斷其相應(yīng)的內(nèi)生真菌菌絲體中含有相應(yīng)的生物堿。

1.2.3 高效液相色譜檢測 以1.2.1中制得的內(nèi)生真菌菌絲待測液，用于高效液相色譜檢測。參照J(rèn)u等［13］的方法研究并修改，色譜條件為UltimateAQ-C18液相色譜柱（4.6 μm×250 mm×5 mm）；流動相為甲醇-磷酸緩沖液（45∶55）；紫外檢測波長為216 mm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL·min-1。將內(nèi)生真菌待檢樣品與生物堿標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖進(jìn)行比較，當(dāng)樣品出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時間相同或相似的色譜峰時，即可確定待測樣品中含有相應(yīng)的生物堿。

1.2.4 酸性染料比色法測定苦豆子內(nèi)生真菌中的槐定堿 參照顧沛雯等［21］方法分別配置濃度為0.0098，0.0195，0.0391，0.0781，0.1562，0.3125和0.6250 mg·mL-1的槐定堿標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，水浴揮去甲醇，加水至2 mL，再加0.8783 mg·mL-1的溴甲酚綠2 mL搖勻，加入二氯甲烷5 mL進(jìn)行萃取，漩渦混合5 min，3000 r·min-1離心10 min，精密吸取二氯甲烷層2 mL，60℃水浴揮去二氯甲烷溶劑，加pH值為6的磷酸緩沖溶液10 mL，充分混勻。在615 nm波長，進(jìn)行光度測量，以pH值為6的磷酸緩沖溶液為空白對照進(jìn)行基線校準(zhǔn)。以槐定堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。

按照上述方法處理樣品，將內(nèi)生真菌磷酸緩沖液樣品置于L5S型紫外可見光分光光度計光譜分析儀中，在波長300～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品在615 nm處出現(xiàn)吸收峰。若內(nèi)生真菌樣品液在615 nm處也出現(xiàn)吸收峰，這表明樣品溶液中含有槐定堿。然后在615 nm波長處測量每個樣品的吸光度值，代入線性回歸方程，計算樣品溶液中槐定堿的濃度和內(nèi)生菌株堿產(chǎn)率。

堿產(chǎn)率的計算公式如下：

堿產(chǎn)率（mg·g-1）=

（堿質(zhì)量濃度×體積）/菌絲干重

1.3 產(chǎn)堿菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將苦豆子內(nèi)生真菌置于PDA平板上培養(yǎng)5 d后，觀察菌落形態(tài)特征并在顯微鏡下觀察菌株孢子和孢子梗的形態(tài)特征，初步確定苦豆子內(nèi)生真菌的分類地位。

1.3.2 產(chǎn)堿菌株分子生物學(xué)鑒定 用Biospin?真菌DNA提取試劑盒提取真菌DNA。分別選用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和轉(zhuǎn)錄延伸因子（Translation elongation factors 1-alpha，TEF-1α）基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息如表1所示。PCR反應(yīng)體系為：2×Eco Taq?PCR Super Mix12.5 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。最終的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。所得PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

將測序結(jié)果提交到NCBI采用BLAST進(jìn)行同源性比較，下載同源性較高的菌株序列為代表菌株。按照ITS-TEF1α-GAPDH的順序進(jìn)行基因序列的首尾相連，運(yùn)用MEGA 11軟件中的鄰接法（Neighbor joining，NJ）按1000次重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 產(chǎn)堿菌株產(chǎn)生物堿穩(wěn)定性測定

篩選出生物堿產(chǎn)率最高的苦豆子內(nèi)生菌株DSD201作為后續(xù)研究用的菌株。將該菌株在PDB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次，每一代培養(yǎng)結(jié)束后，測定其菌絲干重和槐定堿產(chǎn)率，評價其產(chǎn)槐定堿的穩(wěn)定性，生物堿提取方法同1.2.1，堿產(chǎn)率計算方法同1.2.4。

1.5 產(chǎn)槐定堿菌株生物學(xué)特性研究

以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別測定不同天數(shù)、pH值、L-哌啶酸濃度、L-賴氨酸濃度、α-酮戊二酸濃度對苦豆子內(nèi)生菌株DSD201產(chǎn)槐定堿的影響。天數(shù)設(shè)置1，3，5，7，9，11和13 d，共7個處理；pH值設(shè)置4，5，6，7，8，9和10共7個處理；L-哌啶酸濃度設(shè)置1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5 mol·L-1和不添加L-哌啶酸的空白對照共5個處理；L-賴氨酸濃度設(shè)置1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4 mol·L-1和不添加L-賴氨酸的空白對照共5個處理；α-酮戊二酸濃度設(shè)置1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5 mol·L-1和不添加α-酮戊二酸的空白對照共5個處理。每一處理3組重復(fù)，培養(yǎng)結(jié)束后，測定其菌絲干重和堿產(chǎn)率。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)槐定堿條件

根據(jù)生物學(xué)特性試驗的結(jié)果，對3種不同的前體物質(zhì)L-哌啶酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸進(jìn)行復(fù)配添加優(yōu)化。為消除模型的異方差性，將濃度進(jìn)行負(fù)對數(shù)處理，響應(yīng)值為堿產(chǎn)率，響應(yīng)面設(shè)計因子及水平如表2所示。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 21.0軟件鄧肯氏多重比較進(jìn)行顯著性分析，并結(jié)合Excel軟件做t檢驗。使用Design Expert 12.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)生物堿菌株的篩選結(jié)果

經(jīng)TLC分析后，發(fā)現(xiàn)50株苦豆子內(nèi)生真菌中，僅有菌株DSD103，DSD201和DSD308的菌絲提取液出現(xiàn)與槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品顏色與比移值相似的斑點(diǎn)，但未出現(xiàn)與苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿相似的斑點(diǎn)（圖1A），因此初步確定菌株DSD103，DSD201和DSD308的菌絲中含有槐定堿。

經(jīng)酸性染料比色分析后，3株真菌樣品與槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品均在615 nm處出現(xiàn)吸收峰（圖1B），這也表明了這3株苦豆子內(nèi)生真菌菌絲中含有槐定堿。

經(jīng)過HPLC分析，3株菌DSD103，DSD201和DSD308的菌絲提取液樣品分別在9.542，9.533和9.764 min出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰，其色譜保留時間與槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留時間9.600 min相近，且與周圍其他雜質(zhì)峰分離性良好（圖1 C）。進(jìn)一步證實(shí)了菌株DSD103，DSD201和DSD308菌絲存在槐定堿。

以槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在615 nm處吸光度值（y）與槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（x）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.2761x-0.0146（R2=0.9990），線性范圍為0.0098～0.6250 mg·mL-1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到菌株DSD103，DSD201和DSD308菌絲中槐定堿的含量分別為0.106，0.272和0.138 mg·mL-1，槐定堿產(chǎn)率分別為0.212，0.544和0.276 mg·g-1。

2.2 產(chǎn)槐定堿內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，菌株DSD308和菌株DSD201菌落呈灰褐色、形狀扁平，菌落中心及外邊緣呈白色絮狀（圖2A-B）；DSD103菌株菌落呈灰白色絨毛狀，菌落中心淺灰色微隆起，邊緣乳白色（圖2C）。這3株內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生分生孢子且3株真菌的分生孢子的形態(tài)相近。3株菌分生孢子梗大小各異，單支，深色，具有較少的頂生孢子鏈；分生孢子都有暗色膈膜，呈橢圓形、卵形，少數(shù)孢子單生（圖2D-F）。根據(jù)菌落的外觀以及分生孢子形態(tài)，初步鑒定3株菌DSD103，DSD201和DSD308為鏈格孢屬真菌（Alternaria sp.）。

基于ITS-TEF1α-GAPDH的NJ法構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株DSD103，DSD201和DSD308與A. alternata聚在同一分支，自展值為100%（圖2G）。結(jié)合形態(tài)特征與多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，最終將DSD103，DSD201和DSD308這3株產(chǎn)槐定堿內(nèi)生真菌鑒定為互隔鏈格孢（A.alternata）。

2.3 DSD201菌株產(chǎn)生物堿穩(wěn)定性測定

由酸性染料比色法可知，菌株DSD201槐定堿堿產(chǎn)率最高，因此對菌株DSD201進(jìn)行產(chǎn)生物堿穩(wěn)定性測定。由圖3所示，菌株DSD201經(jīng)過連續(xù)5次傳代，其菌絲干重與堿產(chǎn)率無顯著性變化，確定菌株DSD201生長和堿產(chǎn)率穩(wěn)定。

2.4 菌株DSD201生長與產(chǎn)生物堿特性分析

菌株DSD201生長迅速，在1 d時僅有少量菌絲產(chǎn)生，在2 d到7 d時菌絲迅速增加，9 d時達(dá)到穩(wěn)定后停止生長。堿產(chǎn)率在1 d到7 d時，穩(wěn)步增長，在第7 d時達(dá)到最大值0.561 mg·g-1，之后逐漸衰減。因此選取發(fā)酵培養(yǎng)7 d作為最適的發(fā)酵時間（圖4A）。當(dāng)pH值為6時菌絲干重相比于其他pH值下的菌絲干重顯著增加，為1.033 g。而堿產(chǎn)率則在pH值為6時達(dá)到最大值0.560 mg·g-1，在pH值為6之后，隨著pH的增加，其堿產(chǎn)率呈不斷減少的趨勢（Plt;0.05）。因此選取pH為6作為最適pH值（圖4B）。

通過單一添加L-哌啶酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸3種物質(zhì)，測定菌株DSD201堿產(chǎn)率的變化。在L-哌啶酸1×10-5 mol·L-1濃度下，菌絲干重達(dá)到最大為1.177 g，比對照顯著增加27.38%。在L-哌啶酸1×10-3 mol·L-1濃度下，堿產(chǎn)率達(dá)最大，為0.675 mg·g-1，比對照顯著增加23.85%（圖4C）（Plt;0.05）。隨著L-賴氨酸濃度的增加，菌株DSD201堿產(chǎn)率與菌絲干重呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在L-賴氨酸1×10-3 mol·L-1濃度下，菌絲干重達(dá)到最大，為1.154 g，比對照增加4.24%，在L-賴氨酸1×10-2 mol·L-1濃度下，堿產(chǎn)率達(dá)到最大，為0.649 mg·g-1，比對照顯著增加19.74%（圖4D）（Plt;0.05）。在α-酮戊二酸的濃度為1×10-4 mol·L-1時，菌絲干重達(dá)到最大，為1.297 g，比對照顯著增加30.87%，堿產(chǎn)率達(dá)到最大，為0.772 mg·g-1，比對照顯著增加41.65%（圖4E）（Plt;0.05）。綜合考慮，選擇1×10-3 mol·L-1的L-哌啶酸、1×10-2 mol·L-1的L-賴氨酸、1×10-4 mol·L-1的α-酮戊二酸作為提高菌株DSD201堿產(chǎn)率的較適宜濃度。

2.5 復(fù)配添加前體物質(zhì)對菌株DSD201堿產(chǎn)率的影響

為了進(jìn)一步提高菌株DSD201的堿產(chǎn)率，采用Box-Behnken設(shè)計試驗，對上述L-哌啶酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸篩選出的3個適宜濃度進(jìn)行復(fù)配，優(yōu)化添加條件，試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

各因素進(jìn)行多元線性回歸分析，得到回歸方程：

Y=0.9398-0.0189X_1+0.0830X_2-0.0204X_3+0.0347X_1 X_2+0.0285X_1 X_3-0.0012X_2 X_3-0.2109X_1^2-0.2012X_2^2-0.1744X_3^2

對響應(yīng)面試驗進(jìn)行方差分析及模型的可信度分析，回歸方程模型P值為0.001lt;0.01，達(dá)到極顯著水平。失擬項P值為0.2421gt;0.05，差異不顯著，表明回歸方程模型與試驗結(jié)果擬合較好。模型的決定系數(shù)R2=0.9843，矯正后的R2=0.9641，方程回歸性顯著。預(yù)測R2=0.8364，與矯正后的R2值都較高且接近，這表明回歸模型能充分說明試驗。變異系數(shù)C.V.為5.63%小于10%，表明試驗的可信度和精確度高。信噪比19.1483gt;4視為合理。綜上所述，該回歸模型對響應(yīng)值的擬合程度較高，方程能夠較好地反映響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

由圖5所示，通過試驗優(yōu)化得到堿產(chǎn)率最優(yōu)制備條件為L-哌啶酸濃度為1×10-2.967 mol·L-1、L-賴氨酸濃度為1×10-2.204 mol·L-1、α-酮戊二酸濃度為1×10-3.938 mol·L-1，即L-哌啶酸濃度為1.079 μmol·L-1、L-賴氨酸濃度為6.251 μmol·L-1、α-酮戊二酸濃度為0.153 μmol·L-1時，預(yù)測得到的最高堿產(chǎn)率0.938 mg·g-1。在該條件下進(jìn)行3次平行試驗，得到堿產(chǎn)率為0.949 mg·g-1，比預(yù)測值高1.17%，證明該模型是可靠的。優(yōu)化后復(fù)配添加前體物質(zhì)的堿產(chǎn)率與優(yōu)化前不添加前體物質(zhì)的堿產(chǎn)率相比提高了74.12%，與優(yōu)化前單獨(dú)添加前體物質(zhì)，堿產(chǎn)率的最高值相比提高了22.92%，說明優(yōu)化后的前體物質(zhì)濃度組成更能促進(jìn)菌株DSD201產(chǎn)生物堿。

3 討論

目前許多野生藥用植物資源枯竭，而多種高效的藥用活性成分難以人工合成［25］。普遍存在于藥用植物組織和器官中的內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，部分內(nèi)生真菌在代謝過程中產(chǎn)生的活性成分，將在很大程度上豐富人類的藥物寶庫，也有助于解決藥用植物生長緩慢、資源緊缺等因素帶來的藥源緊張和生態(tài)破壞的問題［26］。本研究通過TLC，HPLC和酸性染料比色法分析，確定50株苦豆子內(nèi)生真菌中DSD103，DSD201和DSD308這3株真菌菌絲中含有槐定堿，并將其鑒定為互隔鏈格孢，鏈格孢屬真菌廣泛分布于空氣、土壤等自然環(huán)境中，也是常見的植物內(nèi)生真菌。該屬已被證明是次生代謝物的富集源，據(jù)報道至少有268種代謝物來自鏈格孢菌，主要包括生物堿、類固醇（Steroid）、萜類化合物（Terpenoids）、吡喃酮（Pyrone）、醌（Quinone）和酚類（Phenols）等［27］。這使得鏈格孢屬真菌成為農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域不可或缺的生物活性化合物的豐富來源。

本研究確定DSD103，DSD201和DSD308這3株苦豆子內(nèi)生真菌菌絲中含有槐定堿，表明這3株菌可能在苦豆子植株中參與槐定堿的生物合成，但菌絲體中沒有檢測出同為喹諾里西啶類生物堿的氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿和槐果堿，這可能是因為在目前試驗條件下，所分離到的這3株菌產(chǎn)生太少或不產(chǎn)生該類生物堿。此外，本研究主要是對液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的菌絲體進(jìn)行了檢測，并未對固體培養(yǎng)基和發(fā)酵液中的化學(xué)成分進(jìn)行分析。如果菌株通過胞外分泌的方式產(chǎn)生槐定堿及其他生物堿，這些生物堿可能會進(jìn)入培養(yǎng)基或發(fā)酵液中，從而導(dǎo)致在菌絲中檢測不到。據(jù)李欣等［28］報道，瘋草內(nèi)生真菌在生長的過程中不僅進(jìn)行苦馬豆素胞內(nèi)分泌，還可將苦馬豆素分泌到細(xì)胞的外部，并且在菌絲發(fā)酵液中也檢測到苦馬豆素的存在。而有關(guān)菌株DSD201的胞內(nèi)和胞外分泌方式有待進(jìn)一步研究。

喹諾里西啶類生物堿是主要存在于豆科植物中的次生代謝產(chǎn)物，與其他生物堿如莨菪烷、異喹啉和吲哚類生物堿不同，目前關(guān)于喹諾里西啶類生物堿生物合成的分子機(jī)制研究較少。已報道參與喹諾里西啶類生物堿生物合成機(jī)制的主要酶有：賴氨酸脫羧酶、肽基轉(zhuǎn)移酶和銅胺氧化酶等［29］。主要合成步驟都是L-賴氨酸脫羧形成尸胺，尸胺氧化脫氨基產(chǎn)生5-氨基戊醛，其自發(fā)環(huán)化成Δ1-哌啶堿席夫［15］。雖然構(gòu)建喹諾里西啶類生物堿骨架的前幾個步驟已經(jīng)揭示，但迄今為止，槐定堿及其他喹諾里西啶類生物堿骨架的后續(xù)形成機(jī)制仍不清楚。本試驗探究L-賴氨酸、L-哌啶酸和α-酮戊二酸3種前體物質(zhì)及不同濃度前體物質(zhì)復(fù)配對苦豆子內(nèi)生產(chǎn)生物堿菌株DSD201菌絲生長和槐定堿合成的影響。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)L-賴氨酸濃度為1×10-2 mol·L-1時可顯著促進(jìn)堿產(chǎn)率的提升，但會抑制菌株DSD201的生長。L-哌啶酸可顯著促進(jìn)堿產(chǎn)率的提升，α-酮戊二酸具有促進(jìn)菌株DSD201的菌絲生長和槐定堿合成的趨勢。這與張蕾蕾等［30］的試驗結(jié)果存在差異，這可能是因為吲哚里西啶類生物堿與喹諾里西啶類生物堿生物合成路徑并不完全相同。目前，國內(nèi)外學(xué)者推測以賴氨酸為前體合成喹諾里西啶類生物堿的過程中α-酮戊二酸、哌啶酸、酵母氨酸、鳥氨酸等物質(zhì)為合成喹諾里西啶類生物堿的關(guān)鍵物質(zhì)，通過醛縮合、水解、氧化脫氨和偶聯(lián)在內(nèi)的一系列反應(yīng)來進(jìn)一步生成喹諾里西啶類生物堿，再通過脫氫、氧化、糖基化、羥基化和酯化進(jìn)一步修飾喹諾里西啶類生物堿骨架，從而形成多種喹諾里西啶類生物堿的相關(guān)結(jié)構(gòu)［31］。另外，喹諾里西啶生物堿含量還受基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、酶活性調(diào)節(jié)、代謝產(chǎn)物分布、轉(zhuǎn)移和積累以及分解代謝等因素影響，這其中的關(guān)系極為復(fù)雜，有待進(jìn)一步地研究［32］。

4 結(jié)論

本研究以前期從苦豆子種子中分離的50株內(nèi)生真菌為材料，篩選得到3株產(chǎn)槐定堿菌株DSD103，DSD201和DSD308，均屬于互隔鏈格孢。菌株DSD201槐定堿堿產(chǎn)率隨著天數(shù)和pH值的增加先增加后減少。L-賴氨酸、L-哌啶酸、α-酮戊二酸均能提升菌株DSD201的槐定堿產(chǎn)率，并且優(yōu)化復(fù)配添加前體物質(zhì)濃度組成更能促進(jìn)菌株DSD201產(chǎn)槐定堿，菌株DSD201堿產(chǎn)率較不添加前體物質(zhì)的堿產(chǎn)率相比提高了74.12%，與響應(yīng)面優(yōu)化前單獨(dú)添加前體物質(zhì)的堿產(chǎn)率最高值相比提高22.92%。本研究篩選出能夠產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿的苦豆子內(nèi)生真菌菌株3株，初步明確其發(fā)酵條件，提高堿產(chǎn)量，為寧夏野生苦豆子內(nèi)生真菌資源的發(fā)掘利用提供了技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯 "閔芝智）