摘要：日本結(jié)縷草（Zoysia japonica）耐低修剪，適應(yīng)性強，是一種具備多種優(yōu)良特性的暖季型草種，但持綠性較差的缺點嚴重影響其在北方的廣泛應(yīng)用。日本結(jié)縷草滯綠（Zoysia japonica Stay Green，ZjSGR）基因已被證明可加速植物葉綠素的降解，因此Zjsgr突變植株可能具有良好的滯綠潛能，但其滯綠性獲得提升的同時，抗逆性是否下降并不清楚。本研究為驗證Zjsgr突變植株的滯綠性，并進一步探討其在北京地區(qū)的耐寒性，檢測對比了突變株系與同克隆來源對照植株在北京秋季降溫后的生理指標(biāo)，如草坪坪觀質(zhì)量、葉綠素含量、相對含水量、細胞膜透性、丙二醛含量及抗氧化酶活性。結(jié)果說明，突變植株的草坪質(zhì)量、葉綠素含量、過氧化物酶活性顯著高于對照植株，且突變植株在降溫過程中細胞膜穩(wěn)定性更好，即電解質(zhì)滲透率低，初步說明突變植株具有更好的耐寒性，這為其未來在北方地區(qū)的推廣運用提供了理論依據(jù)，并為培育持綠性和抗逆性多性狀改良的優(yōu)良結(jié)縷草株系奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：耐寒性；日本結(jié)縷草；葉綠素含量；細胞膜透性；抗氧化酶

中圖分類號：S688.4 " " " "文獻標(biāo)識碼：A " " " "文章編號：1007-0435（2025）01-0028-06

Preliminary Analysis on Cold Resistance of Zoysia japonica Mutant Plant Zjsgr in Beijing District

LU Shuang， LIU Yue-yue， MAO Jia-jing， XU Xin-yu， LUO Li-wei， HAN Lie-bao， XU Li-xin*

（College of Grassland Science， Beijing Forestry University， Beijing 100083，China）

Abstract：Zoysia japonica is a warm-season grass species with various excellent characteristics. It is resistant to low mowing and has strong adaptability. However， its poor green retention seriously affects its wide application in North China. The ZjSGR gene has been shown to accelerate the degradation of chlorophyll in plants. Therefore， Zjsgr mutant plants may have better stay green trait. However， it is not clear whether the stress resistance will be decreased or not. In order to verify the stay green trait of Zjsgr mutant plants and further investigate their cold tolerance in Beijing， physiological indexes of Zjsgr mutant plants and control plants were measured and compared in Beijing in the early autumn， such as turf quality， chlorophyll content， relative water content， cell membrane permeability， MDA content and antioxidant enzyme activities. The results showed that turf quality， the chlorophyll content and peroxidase activity of the mutant plants were significantly higher than that of the control plants， and the membrane stability of the mutant plants was better （low EL）， which preliminarily indicated that the mutant plants had better cold resistance， and provided a theoretical basis for their subsequent popularization and application in northern China. It also laid a foundation for cultivating excellent zoysia grass lines with improved green period and stress resistance.

Key words：Cold tolerance；Zoysia japonica；Chlorophyll content；Membrane permeability；Antioxidant enzymes

日本結(jié)縷草（Zoysia japonica）作為一種禾本科多年生草本植物，因其耐踐踏、耐旱、低養(yǎng)護等特性，在城市綠化及專業(yè)運動場草坪建設(shè)中被廣泛應(yīng)用。然而，它在北方應(yīng)用的一個局限是綠期相對較短。因此，尋找與其持綠功能相關(guān)的基因?qū)τ谂嘤齼?yōu)良品種顯得尤為重要。目前，關(guān)于SGR基因在日本結(jié)縷草持綠方面的作用已有初步研究［1-3］。

草坪綠期即為草坪草葉片持續(xù)呈現(xiàn)綠色的時間段，葉片呈現(xiàn)綠色和葉綠素含量動態(tài)變化有關(guān)［4］。因此，葉綠素含量的多少和維持時間直接影響到草坪的綠期長短。植物從成熟到衰老過程中，發(fā)生最明顯的變化之一是葉綠素的降解［5-6］。由于葉綠素降解緩慢或未降解，在植物進入衰老時期后葉片依舊能夠保持綠色或少部分黃化的這種現(xiàn)象稱為“滯綠”［7］。前期研究顯示，滯綠基因SGR的功能與葉綠素降解調(diào)控有關(guān)［8］。日本結(jié)縷草ZjSGR基因參與其葉綠素代謝途徑，負向調(diào)控日本結(jié)縷草持綠性狀，其作用主要為促進葉綠素降解，加速老化［1-2］。在葉綠素降解的過程中，SGR蛋白起到了關(guān)鍵作用。它不僅能催化葉綠素a的脫鎂反應(yīng)，還能與光捕捉系統(tǒng)Ⅱ蛋白和其他分解酶共同組成蛋白酶復(fù)合體，共同調(diào)控葉綠素的分解過程［9］。目前，課題組李麗菁等人已通過基因編輯獲得日本結(jié)縷草sgr突變株系，同時，發(fā)現(xiàn)突變植株與對照植株相比葉綠素含量更高［10］。

茅遠煜等通過研究突變植株離體葉片發(fā)現(xiàn)，ZjSGR基因除了在葉綠素降解調(diào)控方面發(fā)揮作用，可能同時還參與日本結(jié)縷草響應(yīng)多種脅迫的防御反應(yīng)，因此推測ZjSGR對日本結(jié)縷草的抗逆性尤其是抵抗低溫脅迫可能有其獨特的功能和作用［3］。因此，本文將通過對比日本結(jié)縷草sgr突變株系與對照植株在北京地區(qū)秋季降溫后的生理指標(biāo)、坪觀質(zhì)量，驗證突變株系在大田環(huán)境下的持綠性和耐寒性，同時分析抗氧化酶在突變植株防御低溫脅迫中的作用，為全面理解ZjSGR基因的功能提供重要參考，也為培育既持綠又抗逆的日本結(jié)縷草品種奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

實驗所用植物材料來自日本結(jié)縷草“Chinese Common”同克隆組織培養(yǎng)材料 （CC1）獲得的對照植株（SC）與sgr突變體植株（S）［10］，突變植株通過規(guī)則成簇的間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）介導(dǎo)的無外源基因編輯技術(shù)體系獲得。植物材料種植于北京林業(yè)大學(xué)教學(xué)科研苗圃基地。三個時間點采樣，四次生物學(xué)重復(fù)。采樣日期為2023年10月19日，2023年10月26日，2023年11月9日。采樣期間溫度變化情況如圖1所示。

1.2 指標(biāo)測定方法

1.2.1 葉綠素含量的測定 葉綠素含量的測量采用分光光度法［11］，8 mL95%乙醇避光靜置24 h浸提葉片，測665 nm，649 nm，470 nm吸光值，計算公式如下。

C葉綠素=6.63A665+18.08A649 （1）

葉綠素含量=C葉綠素×V/W （2）

其中，A665，A649分別指665 nm，649 nm下的吸光度值；C葉綠素指葉綠素總濃度（單位：mg?L-1）；V指提取后的體積（單位為L；0.008L）；W指稱取的葉片質(zhì)量（單位：g）。

1.2.2 電解質(zhì)滲透率（Electrolyte leaking，EL）的測定 稱取新鮮葉片0.1 g，放入裝有20 mL的蒸餾水試管。將試管放入恒溫振蕩器上室溫振蕩24 h后，用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率EL1。再將試管置于水浴鍋中沸水浴30 min，待其冷卻至室溫后測定樣品煮沸電導(dǎo)率EL2以及蒸餾水煮沸電導(dǎo)率EL0，計算公式如下：

電解質(zhì)滲透率= ×100% （3）

1.2.3 相對含水量（Relative water content，RWC）的測定 稱取新鮮葉片0.1 g，記錄稱取重量WF。將葉片完全浸泡于蒸餾水中，遮光靜置24 h后，稱重并記錄重量WT，80℃烘干至葉片恒重，記錄重量WD，計算公式如下［12］：

相對含水量= ×100% （4）

1.2.4 抗氧化酶活性的測定 采用氮藍四唑（Nitroublue tetrazolium chloride，NBT）光還原法［13］測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性， NBT為指示劑，通過測定超氧陰離子自由基對NBT的還原程度來間接反映SOD的活性。當(dāng)SOD酶量使NBT還原減少50%時，定義為一個酶活單位（U）。愈創(chuàng)木酚法［13］測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性，反應(yīng)產(chǎn)物生成速率與POD活性成正比，以每分鐘內(nèi)A470處OD值變化0.01定義為一個酶活單位（U）。紫外吸收法［13］測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性，通過監(jiān)測過氧化氫在紫外光下分解導(dǎo)致的吸光度變化來評估CAT的活性。以每分鐘內(nèi)A240減少0.1的酶量定義為一個酶活單位（U）。紫外吸收法［14］測定抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）活性。硫代巴比妥酸法［15］測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量。

1.2.5 葉片長、寬等形態(tài)指標(biāo)的測定 在每組樣品中隨機選取4～10片葉片用游標(biāo)卡尺測量長度、葉片最寬處的寬度，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，IBM SPSS Statistics 27開展方差分析，Origin 2022軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對對照植株及突變植株表觀形態(tài)的影響

由圖1可知，在試驗階段，氣溫波動式下降，草坪草不斷受到低溫脅迫（圖2），脅迫程度隨時間推移逐步增強。根據(jù)10月19日，10月26日與11月9日的三次取樣時間段的草坪質(zhì)量可以看出，對照植株與sgr突變植株的葉片均出現(xiàn)不同程度的黃化（圖2），植被蓋度均降低。但sgr突變體的黃化程度明顯低于對照，同時，坪觀質(zhì)量高于對照。綜合來看，在大田自然降溫過程中，雖然對照植株與sgr突變植株葉片均出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，但sgr突變植株草坪明顯持綠效果較好，植被蓋度也更高。

2.2 脅迫處理對對照植株及突變植株葉片形態(tài)的影響

葉片形態(tài)指標(biāo)方面，sgr突變植株和對照植株的葉長在取樣時間、植株之間均無顯著變化（圖3A）。從葉寬來看，第一次取樣時，和對照植株相比（4.36 mm），sgr突變植株葉片較窄（3.54 mm），隨著溫度進一步降低，這種差異逐步不顯著（圖3B）。

2.3 突變植株生理指標(biāo)變化

10月19日sgr突變植株較對照植株葉綠素含量更高，分別為1.00 mg?g-1，0.67 mg?g-1；10月26日sgr突變植株葉綠素含量依然高于對照植株，分別為1.06 mg?g-1，0.68 mg?g-1；11月9日，和對照相比，sgr突變植株維持了較高的葉綠素含量，為0.90 mg?g-1，對照植株為0.54 mg?g-1（圖4A）。

三次采樣期間，突變和對照植株的相對含水量都持續(xù)下降。二者相對含水量差異不顯著，但11月9日較10月19日突變植株含水量降幅明顯，而對照植株變化不顯著（圖4B）。

10月19日到10月26日，sgr突變植株細胞膜滲透率增長11.21%，對照植株增長4.89%；而在11月9日的第三次取樣，sgr突變植株膜透性降低至19%，對照植株膜透性出現(xiàn)大幅增加，數(shù)據(jù)表明低溫脅迫下對照植株電解質(zhì)滲透率大幅增加，細胞膜的穩(wěn)定性明顯低于sgr突變植株（圖4C）。

2.4 脅迫處理對對照植株及突變植株MDA含量的影響

由圖5可知，三次采樣期間sgr突變植株與對照植株MDA含量差異不顯著，從10月19日到10月26日以及從10月26日到11月9日，這兩個時間段內(nèi)二者增幅均不顯著。突變植株與對照植株第三次取樣（11月9日）較第一次取樣（10月19日）二者MDA含量分別增加23.48 nmol·g-1 FW，27.85 nmol·g-1 FW。說明隨著氣溫逐步下降，兩種草坪草均受到氧化脅迫，膜過氧化產(chǎn)物MDA增加。

2.5 對照植株及突變植株抗氧化酶活性變化

sgr突變植株與對照植株SOD酶活性差異不顯著（圖6A）。10月19日sgr突變植株高于對照植株P(guān)OD酶活性，分別為8145.00 U·g-1·min-1，5855.00 U·g-1·min-1。第二次取樣時，sgr突變植株P(guān)OD酶活性增至8313.33 U·g-1·min-1，而對照植株降至2886.67 U·g-1·min-1。11月9日sgr突變植株與對照植株P(guān)OD酶活性無顯著差異（圖6C）。三次采樣sgr突變植株與對照植株CAT酶活性（圖6B）和APX酶活性（圖6D）均無差異。數(shù)據(jù)表明，POD酶在突變植株低溫脅迫初期發(fā)揮重要活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除作用。

3 討論

葉綠素是使植物葉色呈現(xiàn)綠色的主要因素。在低溫脅迫時，對照植株表觀褪綠黃化更加明顯，且sgr突變植株的葉綠素含量顯著高于對照植株，說明ZjSGR基因負向調(diào)控葉綠素的降解，這與茅遠煜、周志湘等人的研究結(jié)果一致［3，5］，同時驗證了sgr突變植株在大田自然降溫條件下的持綠性。

植物細胞膜系統(tǒng)是感受低溫最為敏感的部位，同時也是植物抵御低溫傷害的重要結(jié)構(gòu)。電解質(zhì)滲透率和MDA含量是兩個可以有效地反映出細胞膜系統(tǒng)受到的傷害程度和膜脂的過氧化程度［16-18］的重要指標(biāo)。許多研究都表明，抗寒性較強的植物品種相較于抗寒性差的品種，其細胞膜透性更?。?9］。由繼紅等的研究結(jié)果也與此相符，并進一步發(fā)現(xiàn)抗寒性較強的品種與正常品種之間的電解質(zhì)滲透率存在顯著差異［20］。在本研究中，隨著溫度的降低，MDA含量與電解質(zhì)滲透率逐漸升高，說明低溫脅迫導(dǎo)致了膜脂過氧化反應(yīng)，破壞了日本結(jié)縷草的細胞膜系統(tǒng)。隨著氣溫下降，sgr突變體植株的MDA含量變化幅度與對照植株相比差異不大，說明低溫脅迫初期，與對照相比，sgr突變體植株受到同樣程度的氧化脅迫。突變植株降溫期間EL相對更低，細胞膜穩(wěn)定性更好，具有更好的抗寒性。

植物抗寒性強弱也與抗氧化酶活性密切相關(guān)［21］。在低溫條件下，植物體內(nèi)產(chǎn)生與清除ROS的動態(tài)平衡會遭到破壞，從而產(chǎn)生大量的ROS，造成細胞膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致質(zhì)膜系統(tǒng)的損傷。而植物體細胞內(nèi)存在的抗氧化系統(tǒng)能使體內(nèi)活性氧保持動態(tài)平衡，以保護自身免受ROS的傷害，從而減輕或緩解逆境造成的傷害［22-23］。因此，酶活性越高，清除自由基的能力越高，植物的抗逆性也越強［21］。由于突變植株的葉綠素含量更高，因此其活性氧的來源可能更多，從而可能激活或者誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)提升。本研究發(fā)現(xiàn)突變植株P(guān)OD酶活性提升，增強了突變植株的活性氧清除能力，從而提高了其耐寒性。

4 結(jié)論

北京秋季十月下旬開始降溫后，日本結(jié)縷草Zjsgr突變植株能顯著保持葉色，提高葉綠素含量，同時能很好地維持細胞膜穩(wěn)定性，維持較高的POD酶活性。說明突變植株在低溫條件下具有較好的滯綠性，同時突變植株的耐寒性更強，建議推廣種植于日本結(jié)縷草適生區(qū)域，如東北、華北、華中、華東、華南和西南等地區(qū)。

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（責(zé)任編輯 "閔芝智）