摘要：目的" 研究孕前、孕期直至哺乳期鎘暴露對(duì)子代雄鼠睪丸發(fā)育的影響及其潛在機(jī)制。方法" 將10周齡C57BL/6J雌雄小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和鎘暴露組。12周齡時(shí)，兩組小鼠分別按雌鼠/雄鼠為2∶1的比例合籠交配。鎘暴露組孕鼠繼續(xù)予低劑量鎘喂養(yǎng)至哺乳結(jié)束。子代雄鼠哺乳喂養(yǎng)至3周齡斷乳。斷乳后，部分3周齡雄性仔鼠終止實(shí)驗(yàn)，另一部分按親代分組方式繼續(xù)喂養(yǎng)至10周齡。結(jié)果" 與對(duì)照組比較，鎘暴露組子代3周齡及10周齡小鼠睪丸組織內(nèi)鎘濃度明顯升高，且10周齡小鼠明顯高于3周齡（Plt;0.05）;鎘暴露組子代3周齡小鼠睪丸組織未見(jiàn)明顯損傷，cleaved caspase-3/caspase-3表達(dá)比例無(wú)明顯變化（Pgt;0.05）;鎘暴露組子代10周齡小鼠睪丸生精上皮排列紊亂、生精細(xì)胞脫落，cleaved caspase-3/caspase-3、BAX/BCL-2的表達(dá)比例顯著升高（Plt;0.05），cleaved caspase-8/caspase-8、caspase-12、IRE1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化（Pgt;0.05）。結(jié)論" 鎘可通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入子代雄鼠體內(nèi)并在睪丸內(nèi)蓄積，對(duì)幼年期睪丸發(fā)育無(wú)明顯損傷，但其不斷積累可通過(guò)增加睪丸細(xì)胞凋亡引起青春期雄性大鼠睪丸的損傷。

關(guān)鍵詞：鎘;雄性;子代;睪丸

中圖分類號(hào)：R114" " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.19.011

文章編號(hào)：1006-1959（2024）19-0068-06

Effects of Cadmium Exposure on Testiculus of Mice Offspring at Different Weeks of Age

XIONG Lijuan1，ZHOU Bin2

（Department of Emergency1，Department of Endocrinology，Genetics and Metabolism2，Jiangxi Provincial

Children’s Hospital，Nanchang 330006，Jiangxi，China）

Abstract：Objective" To study the effects of cadmium exposure before pregnancy， during pregnancy and lactation on testiculus development of male offspring and its potential mechanism.Methods" Ten-week-old C57BL/6J male and female mice were randomly divided into control group and cadmium exposure group. At the age of 12 weeks， the two groups of mice were mated according to the ratio of female/male mice of 2∶1. The pregnant rats in the cadmium exposure group continued to be fed with low-dose cadmium until the end of lactation. The male offspring were fed to weaning at 3 weeks of age. After weaning， some 3-week-old male pups terminated the experiment， and the other part continued to be fed to 10 weeks of age according to the parental grouping method.Results" Compared with the control group， the cadmium concentration in the testiculus tissue of the 3-week-old and 10-week-old mice in the cadmium exposure group was significantly increased， and that in the 10-week-old mice were significantly higher than that in the 3-week-old mice （Plt;0.05）. There was no significant damage to the testiculus tissue of the 3-week-old mice in the cadmium exposure group， and there was no significant change in the expression ratio of cleaved caspase-3/caspase-3 （Pgt;0.05）. In the cadmium exposure group， the spermatogenic epithelium of the testis of the 10-week-old mice was disordered， the spermatogenic cells were detached， and the expression ratios of cleaved caspase-3/caspase-3 and BAX/BCL-2 were significantly increased （Plt;0.05）.Conclusion" Cadmium can enter the male mice offspring through the placental barrier and accumulate in the testiculus， and has no obvious damage to the development of the testiculus in the juvenile stage， but its continuous accumulation can cause testiculus damage in adolescent male mice by increasing testiculus cell apoptosis.

Key words：Cadmium;Male;Offspring;Testiculus

近幾十年來(lái)，全球不孕不育率呈逐年上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)達(dá)8%～12%[1]，其中因男性因素所致者占40%～50%[2]，其年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率以每年0.291%的速率增加[1]，已成為全球性的健康問(wèn)題。男性特發(fā)性不育最常見(jiàn)，占男性不育癥的30%～50%[2]。男性特發(fā)性不育的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括不良生活習(xí)慣、社會(huì)心理壓力和環(huán)境毒物暴露等[3]。鎘（cadmium， Cd）是常見(jiàn)的有毒環(huán)境化學(xué)物之一，主要以化合物的形式（CdO， CdCl2或CdSO4等）存在于自然界中。隨著工業(yè)化的發(fā)展，鎘被廣泛應(yīng)用于橡膠加工、鍍鋅工藝、塑料穩(wěn)定劑、農(nóng)藥和化肥等領(lǐng)域[4]，并被釋放到水、空氣和土壤中造成環(huán)境污染。人類主要是通過(guò)食用受污染的食物、飲用受污染的水、吸煙等途徑吸收鎘。鎘進(jìn)入人體后因排泄率極低、半衰期長(zhǎng)，易在體內(nèi)蓄積造成重要器官系統(tǒng)的損傷[7]。近年來(lái)，大量研究表明鎘具有生殖毒性[5，6]。流行病學(xué)調(diào)查表明[7，8]，職業(yè)或非職業(yè)鎘暴露者血液和精液中的鎘濃度與精子參數(shù)和精子酶活性成反比。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[9-11]，直接鎘暴露可通過(guò)損傷生精細(xì)胞、減少Sertoli和Leydig細(xì)胞、破壞血睪屏障等引起睪丸損傷。但目前的研究大多考慮鎘暴露后對(duì)成年子代雄鼠生殖的影響，而極少涉及對(duì)子代未成熟睪丸的影響。因此，本研究采用親代小鼠交配前開(kāi)始鎘暴露至哺乳期結(jié)束，模擬人類孕前、孕期及哺乳期鎘暴露，旨在研究親代鎘暴露后對(duì)子代睪丸的影響。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑" HM325切片機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司），BX43奧林巴斯顯微鏡（日本Olympus公司）及電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS， 美國(guó)Thermo Fisher公司）。氯化鎘（CdCl2·5H2O）（英國(guó)Alfa Aesar公司）;硝酸（美國(guó)Thermo Fisher公司）;TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）;TaqMannbsp; 引物（美國(guó)Thermo Fisher公司）;RT-PCR一步法成套試劑盒及DNA marker（美國(guó)Promega公司）;山羊抗鼠/兔二抗（美國(guó)CST公司）;兔源BAX一抗、兔源BCL-2一抗、兔源caspase-12 一抗（ABclonal公司）;兔源cleaved caspase-3、兔源caspase-3、兔源CHOP、兔源cleaved caspase-8、兔源caspase-8、鼠源β-actin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Bio-Rad公司）;TUNEL 試劑盒（美國(guó)Promega公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組" 8周齡SPF級(jí)C57BL/6 J小鼠（親代）雌性24只，體重（20.1±1.5）g;雄性12只，體重（25.5±1.1）g，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（贛）-2015-0001。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠盒（IVC）的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，維持恒溫（25 ℃），相對(duì)濕度為（55±5）%，12 h明暗循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)南昌大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3染毒方法" SPF級(jí)8周齡親代C57BL/6 J小鼠開(kāi)始給予實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)飲食，并予去離子水喂養(yǎng)。1周后，標(biāo)準(zhǔn)飲食改為AIN-76A純化飼料，以防止金屬污染，每周記錄用水量。10周齡時(shí)，親代小鼠分為兩組：對(duì)照組（飼糧為AIN-76A純化飼料和去離子水）和低劑量鎘暴露組（提供含鎘的飲用水，終濃度為5 mg/L），根據(jù)國(guó)際化學(xué)品安全計(jì)劃報(bào)道此劑量低于鎘的1% LD50，為低劑量鎘[11，12]。12周齡時(shí)，兩組小鼠分別按雌鼠/雄鼠為2∶1的比例合籠交配。鎘暴露組孕鼠繼續(xù)予低劑量鎘喂養(yǎng)直至哺乳結(jié)束。子代雄鼠哺乳喂養(yǎng)至3周齡斷乳。斷乳后稱重，以三溴乙醇（阿弗丁，250 mg/kg）麻醉小鼠后處死，收集部分雄性仔鼠睪丸;另部分雄性仔鼠按親代分組方式分別給予去離子水及含鎘飲用水喂養(yǎng)（終濃度為5 mg/L），直至10周齡。

1.4睪丸組織內(nèi)鎘濃度測(cè)量" 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）儀測(cè)定睪丸內(nèi)鎘的含量。切取約10～20 mg睪丸組織，置于2 ml試管中稱量。然后進(jìn)行鎘濃度的測(cè)定，方法同本課題組前期研究發(fā)表文獻(xiàn)中的操作[11]。完成后，數(shù)據(jù)導(dǎo)出進(jìn)行分析。

1.5睪丸組織病理?yè)p傷評(píng)價(jià)" 將睪丸在福爾馬林中固定至少24 h，然后進(jìn)行石蠟包埋。用HM325切片機(jī)將石蠟包埋的睪丸樣品切成約4 μm厚的薄片。樣本切片用蘇木精和伊紅染色（Hamp;E），使用奧林巴斯BX43顯微鏡在100倍和400倍放大下觀察。

1.6 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白" 切取20 mg組織塊置于2 ml凍存管中，加入400 μl組織裂解液，置于冰上，用組織勻漿器在冰上勻漿3次，每次10 s左右。將勻漿后的組織標(biāo)本置于旋轉(zhuǎn)攪拌器上，4 ℃震蕩1 h，4 ℃ 12 000轉(zhuǎn)離心20 min，取上清液測(cè)蛋白質(zhì)濃度并保存。與課題組既往實(shí)驗(yàn)研究方法相同[13]，取測(cè)好蛋白濃度的組織液制樣，采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，進(jìn)而封閉、敷抗體，最后進(jìn)行曝光保存照片。對(duì)采集到的圖像使用 Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" 所有數(shù)據(jù)均以（x±s）形式表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。GraphPad Prism 8軟件用于數(shù)據(jù)分析和圖表制作。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1仔鼠睪丸內(nèi)鎘含量的測(cè)定" 與對(duì)照組3周齡仔鼠相比，鎘暴露組3周齡仔鼠睪丸組織內(nèi)平均鎘含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與對(duì)照組10周齡仔鼠相比，鎘暴露組10周齡仔鼠睪丸組織內(nèi)平均鎘含量為（38.12±15.18）ng/g，明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）;與鎘暴露組3周齡仔鼠相比，鎘暴露組10周齡仔鼠睪丸組織內(nèi)平均鎘含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。鎘暴露后仔鼠睪丸內(nèi)鎘含量的變化見(jiàn)圖1。

2.2仔鼠體重、睪丸重量及其臟器系數(shù)的測(cè)定結(jié)果" 與相對(duì)應(yīng)周齡的對(duì)照組雄性仔鼠比較，鎘暴露組雄性仔鼠的體重、睪丸重量及睪丸系數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。鎘染毒仔鼠體重、睪丸重量及其臟器系數(shù)的變化見(jiàn)表2。

2.3鎘暴露對(duì)仔鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響" 如圖2所示，睪丸組織Hamp;E染色結(jié)果顯示，對(duì)照組3周齡仔鼠睪丸組織內(nèi)睪丸索規(guī)則排列，精原細(xì)胞及精母細(xì)胞形態(tài)完整;鎘暴露組3周齡仔鼠睪丸組織近似正常組織，睪丸索排列整齊，內(nèi)可見(jiàn)精原細(xì)胞及精母細(xì)胞。對(duì)照組10周齡仔鼠睪丸生精上皮完整、連續(xù)，生精細(xì)胞排列整齊;鎘暴露組10周齡仔鼠睪丸生精上皮排列紊亂、生精細(xì)胞脫落。

2.4仔鼠睪丸內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響" 與對(duì)照組3周齡相比較，鎘暴露組3周齡仔鼠睪丸組織內(nèi)cleaved caspase-3/caspase-3表達(dá)比例無(wú)明顯升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），兩組間BAX/BCL-2、cleaved caspase-8/caspase-8表達(dá)比例及caspase-12、IRE1蛋白表達(dá)的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）;與對(duì)照組10周齡相比較，鎘暴露組10周齡仔鼠睪丸組織cleaved caspase-3/caspase-3及BAX/BCL-2的表達(dá)比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）;cleaved caspase-8/caspase-8表達(dá)比例及caspase-12、IRE1蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見(jiàn)表3、圖3、圖4。

3討論

隨著工業(yè)化的加速，鎘污染日漸加重。既往流行病調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)鎘暴露與精子數(shù)量、精子質(zhì)量等參數(shù)呈反比，提示男性不育可能與鎘污染有關(guān)。短時(shí)間大劑量鎘暴露或長(zhǎng)時(shí)間小劑量鎘暴露后可通過(guò)引起小鼠睪丸內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥等直接損傷小鼠睪丸組織[14，15]。孕期、哺乳期鎘暴露可透過(guò)胎盤屏障將鎘傳給子代小鼠，引起成年子代雄鼠睪丸內(nèi)雄性類固醇激素的活性，使睪酮水平下降，導(dǎo)致精子數(shù)量減少、精子質(zhì)量下降[16，17]。目前研究大多集中在鎘暴露對(duì)自身睪丸的直接影響及對(duì)成年子代小鼠睪丸的影響，親代鎘暴露后對(duì)仔鼠睪丸的影響研究較少。因此，本研究擬建立親代小鼠鎘暴露模型，觀察親代鎘暴露后對(duì)未成年子代小鼠睪丸的影響。

ICP-MS檢測(cè)結(jié)果顯示，親代鎘暴露后可引起子代3周齡及10周齡小鼠睪丸內(nèi)鎘含量升高，且10周齡小鼠睪丸內(nèi)鎘含量高于3周齡子代小鼠。說(shuō)明鎘可以通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入子代小鼠體內(nèi)，并在子代小鼠睪丸內(nèi)蓄積，與既往研究報(bào)道結(jié)果一致[18，19]。10周齡子代小鼠自3周齡時(shí)被停止哺乳后繼續(xù)飲用鎘污染水，導(dǎo)致鎘的蓄積增加，導(dǎo)致其睪丸內(nèi)鎘含量高于3周齡子代小鼠睪丸內(nèi)鎘含量。盡管鎘在子代小鼠睪丸內(nèi)有明顯的蓄積，但對(duì)子代小鼠的體重及睪丸重量無(wú)明顯影響。

Huang Y等[20]的研究結(jié)果與本研究不一致，該研究對(duì)孕鼠灌胃進(jìn)行鎘暴露[氯化鎘劑量分別為0.5、2、8 mg/（kg·d）]，產(chǎn)下的第1代雌鼠再與正常雄鼠交配產(chǎn)下第2代小鼠，觀察鎘暴露對(duì)后兩代小鼠生殖的影響，采用電鏡觀察第1代和第2代21日齡小鼠睪丸的超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)高鎘暴露組（8 mg/kg）第1代小鼠睪丸內(nèi)精原細(xì)胞核染色質(zhì)聚集和細(xì)胞分裂，高鎘暴露組第2代小鼠睪丸內(nèi)生精細(xì)胞出現(xiàn)核仁染色質(zhì)聚集和核仁濃度升高，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，部分細(xì)胞出現(xiàn)碎裂，表明高鎘暴露組未成年子代小鼠的睪丸發(fā)生了結(jié)構(gòu)損傷。本研究中鎘暴露組子代3周齡小鼠睪丸組織近似正常，睪丸索排列整齊，內(nèi)有精原細(xì)胞及精母細(xì)胞，提示親代鎘暴露后雖然引起子代3周齡小鼠睪丸組織內(nèi)鎘含量蓄積，但未引起睪丸組織的明顯損傷，這與上述研究結(jié)果不一致，這可能與給藥劑量不一致有關(guān)。本研究鎘暴露劑量為5 mg/L，根據(jù)國(guó)際化學(xué)品安全計(jì)劃（IPCS）報(bào)道此劑量低于鎘的1% LD50，為低劑量鎘暴露[11，12]。Huang Y等[20]研究中引起子代睪丸損傷的鎘暴露劑量為8 mg/kg，為大劑量鎘暴露，提示鎘在睪丸組織內(nèi)需要達(dá)到一定的劑量才可能引起睪丸組織的損傷。鎘暴露組子代10周齡小鼠睪丸內(nèi)生精上皮排列紊亂、生精細(xì)胞脫落，引起睪丸損傷。10周齡子代小鼠自3周齡時(shí)被停止哺乳后繼續(xù)飲用鎘污染水，鎘在睪丸組織內(nèi)不斷蓄積增多而引起組織結(jié)構(gòu)損傷，更進(jìn)一步說(shuō)明鎘可能需要在睪丸組織內(nèi)需要達(dá)到一定的劑量才可能引起結(jié)構(gòu)損傷。

鎘暴露組子代3周齡小鼠睪丸組織內(nèi)cleaved caspase-3/caspase-3表達(dá)比例與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且兩組間BAX/BCL-2、cleaved caspase-8/caspase-8表達(dá)比例及caspase-12、IRE1蛋白表達(dá)的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明親代鎘暴露后對(duì)子代3周齡小鼠睪丸細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響，與前所述不引起其睪丸組織損傷的結(jié)果一致。鎘暴露組子代10周齡小鼠睪丸組織內(nèi)cleaved caspase-3/caspase-3表達(dá)比例較對(duì)照組升高，提示親代鎘暴露后引起子代10周齡小鼠睪丸細(xì)胞凋亡增加，與前述鎘暴露組子代10周齡小鼠睪丸組織病理?yè)p傷結(jié)果一致，提示親代鎘暴露疊加自身鎘暴露引起的睪丸損傷可能是由于鎘在睪丸內(nèi)蓄積導(dǎo)致睪丸細(xì)胞凋亡增加而引起的。親代鎘暴露組子代10周齡小鼠睪丸組織BAX/BCL-2的表達(dá)比例較對(duì)照組升高，但cleaved caspase-8/caspase-8表達(dá)比例及caspase-12、IRE1蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異異，提示鎘暴露可能主要通過(guò)線粒體途徑引起子代10周齡小鼠睪丸細(xì)胞凋亡。

綜上所述，親代小鼠孕前至哺乳期鎘暴露后鎘可透過(guò)胎盤屏障進(jìn)入子代小鼠體內(nèi)，引起子代小鼠睪丸內(nèi)鎘蓄積。鎘暴露對(duì)子代3周齡小鼠睪丸的組織學(xué)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，沒(méi)有引起細(xì)胞凋亡的增加。子代3周齡小鼠斷乳后繼續(xù)進(jìn)行鎘暴露至10周齡后，10周齡小鼠睪丸內(nèi)鎘含量較3周齡明顯升高，且引起了睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡增多引起的。本研究未觀察子代3周齡小鼠體內(nèi)鎘蓄積是否引起表觀遺傳學(xué)變化，未深入研究鎘暴露致子代10周齡小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，課題組將在未來(lái)的工作中進(jìn)一步深入鎘暴露致子代小鼠的損傷機(jī)制，旨在為鎘暴露致后代男性不育的防治提供理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-08-16;修回日期：2023-09-27

編輯/肖婷婷

基金項(xiàng)目：1.江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：202130863）;2.江西省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：20224BAB216028）

作者簡(jiǎn)介：熊麗娟（1987.4-），女，江西豐城人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究