摘 要：目的：建立一種簡(jiǎn)單快速的樣品前處理方法結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)、蘋果汁和鹵豬肉中的納他霉素。方法：樣品經(jīng)75%甲醇水溶液、超聲波提取，經(jīng)色譜柱分離，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，利用高效液相色譜儀進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果：納他霉素在0.1～10.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.995，檢出限為0.1 mg·kg-1。對(duì)糕點(diǎn)、蘋果汁和鹵豬肉進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為83.24%～101.60%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.51%～8.21%（n=6）。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高，準(zhǔn)確性和精密度良好，可滿足食品中納他霉素快速篩查和定量分析的需求。

關(guān)鍵詞：納他霉素；高效液相色譜法；糕點(diǎn)；蘋果汁；鹵豬肉

Determination of Natamycin in Food by High Performance Liquid Chromatography

WU Jinsong， ZHOU Zesong， CHEN Rubo， CHEN Haolang

（Guangdong Test Center for Green Labelling Co.， Ltd.， Guangzhou 510440， China）

Abstract： Objective： To establish a simple and rapid sample pretreatment method combined with high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of natamycin in pastry， apple juice and brine pork. Method： The samples are extracted by ultrasonication with 75% methanol aqueous solution， separated by chromatography column， and eluted by gradient washing with a mobile phase of methanol - 0.1% formic acid aqueous solution， and analyzed qualitatively and quantitatively by HPLC. Result： The linearity of natamycin in the concentration range of 0.1～10.0 μg·mL-1 is good， the correlation coefficient is greater than 0.995， and the detection limit is 0.1 mg·kg-1. The average recovery of pastry， apple juice and brine pork is from 83.24% to 101.60%， and the relative standard deviation is from 1.51% to 8.21%（n=6）. Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive， accurate and precise， and can meet the needs of rapid screening and quantitative analysis of natamycin in food.

Keywords： natamycin; high performance liquid chromatography; pastry; apple juice; brine pork

隨著我國(guó)食品產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，食品添加劑得到了廣泛應(yīng)用。食品添加劑對(duì)于改善食品的色、香、味，調(diào)整食品的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成，防止食品腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)食品的貨架期發(fā)揮著重要作用。中國(guó)商品分類中的食品添加劑種類共有35類，包括增味劑、消泡劑、膨松劑、著色劑及防腐劑等，含添加劑的食品在萬種以上[1-2]。納他霉素，又名匹馬霉素、游霉素，是一種由多種鏈霉素發(fā)酵產(chǎn)生的一種近白色或奶油黃色的天然抗真菌化合物，能有效抑制霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)，且難以被人體消化吸收，對(duì)人體造成的傷害較低，因此其應(yīng)用廣泛[3-6]。雖然納他霉素是國(guó)家允許使用的防腐劑，但食用過量也會(huì)給人體帶來危害[7-8]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中規(guī)定了納他霉素在糕點(diǎn)、果蔬汁和醬鹵肉制品中的最大使用量均為0.3 g·kg-1。

目前，常見的納他霉素測(cè)定方法有高效液相色譜法[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理要求較高，試劑耗材成本較高，不利于大批量食品中納他霉素的測(cè)定。而高效液相色譜法前處理簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)效益高，能滿足日常檢測(cè)需求[10，13]。本研究參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中納他霉素的測(cè)定》（GB 5009.286—2022），優(yōu)化檢測(cè)方法，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，為檢測(cè)食品中納他霉素的含量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糕點(diǎn)、蘋果汁和鹵豬肉，購自廣州市市場(chǎng)；納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.4%），天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher公司；冰乙酸、甲酸（色譜純），北京邁瑞達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀UltiMate 3000型，并配有VWD檢測(cè)器，美國(guó)Thermo Scientific；EFAA-HM-01型多管渦漩混合儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；AK-100S型超聲波清洗機(jī)，深圳鈺潔公司；XS205DU型電子天平，廣州勤拓公司；HR/T20MM型高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西公司；Milli-Q型純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.16 mg納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，加入2.0 mL甲醇和0.1 mL冰乙酸，溶解后定容至刻度，獲得濃度為1.0 mg·mL-1的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL納他霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到濃度為100.0 μg·mL-1的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液，在0～4 ℃條件下避光保存。檢測(cè)時(shí)，用75%甲醇水溶液配制成濃度為0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為305 nm；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液（體積比75∶25）；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為5.0 μL；柱溫為30 ℃。

1.3.3 樣品處理

分別稱取糕點(diǎn)和鹵豬肉5.00 g置于50 mL離心管中，加入15 mL75%甲醇水溶液，放入渦旋混合儀，渦旋振蕩5 min，再超聲波提取20 min，加入5 mL純水混勻，在4 ℃的條件下10 000 r·min-1離心5 min，吸取1.0 mL上清液用0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾，待測(cè)。

稱取蘋果汁5.00 g置于50 mL離心管中，加入15 mL75%甲醇水溶液，超聲提取20 min，在4 ℃的條件下10 000 r·min-1離心5 min，吸取1.0 mL上清液，用0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC條件優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相優(yōu)化

本研究對(duì)比乙腈和甲醇的有機(jī)體系、純水和0.1%甲酸水溶液的水相體系對(duì)納他霉素色譜峰峰形及響應(yīng)強(qiáng)度的影響，此時(shí)使用Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相為乙腈時(shí)，納他霉素峰形較差，不對(duì)稱；如圖1所示，有機(jī)相為甲醇時(shí)納他霉素峰形對(duì)稱。水相為0.1%甲酸水溶液時(shí)納他霉素響應(yīng)強(qiáng)度較高、峰面積較大。樣品色譜圖如圖2所示，納他霉素的分離度良好。因此，本研究選用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.1.2 色譜柱選擇

對(duì)比Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Zafex Supfex JX-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩款常用型色譜柱對(duì)納他霉素（10.0 μg·mL-1）的分離效果。結(jié)果顯示，納他霉素在Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱上得到較好分離，納他霉素的峰形對(duì)稱，且分離度較好；而Zafex Supfex JX-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱出現(xiàn)了峰形拖尾的現(xiàn)象。因此，本研究選用Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.2 前處理優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究對(duì)比75%甲醇水溶液、甲醇和水作為提取溶劑時(shí)納他霉素的提取效果。按1.3.3方法，選取糕點(diǎn)，添加濃度為10.0 mg·kg-1的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，75%甲醇水溶液作為提取溶劑時(shí)納他霉素的回收率最高，為83.72%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）最小，為2.50%。因此，本研究選用75%甲醇水溶液作為前處理提取溶劑。

2.2.2 定容液的選擇

本研究對(duì)比75%甲醇水溶液、甲醇和水作為定容液時(shí)納他霉素的出峰效果。分別用75%甲醇水溶液、甲醇和水配制10.0 μg·mL-1的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對(duì)比三者的色譜圖。結(jié)果表明，納他霉素在水和甲醇中響應(yīng)強(qiáng)度較低，而在75%甲醇水溶液中響應(yīng)強(qiáng)度較高，峰形較好，沒有出現(xiàn)前延或拖尾。因此，本研究選用75%甲醇水溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍和檢出限

配制納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液進(jìn)行檢測(cè)，以納他霉素的濃度為橫坐標(biāo)（X），以目標(biāo)峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），建立線性關(guān)系。測(cè)得納他霉素在濃度為0.1～10.0 μg·mL-1時(shí)的線性方程為Y=0.398 0X-0.006 4，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，說明納他霉素在0.1～10.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍信噪比（S/N）確定方法檢出限，檢出限為0.1 mg·kg-1，說明該方法具有良好的靈敏度，可滿足檢測(cè)需求。

2.3.2 回收率和精密度

選取糕點(diǎn)、蘋果汁和鹵豬肉進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加濃度為1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，以平均回收率來考量方法的準(zhǔn)確性，以RSD來考量方法的精密度。如表1所示，納他霉素的平均回收率為83.24%～101.60%，RSD為1.51%～8.21%，說明該方法的準(zhǔn)確性和精密度良好，可以用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本研究建立的方法對(duì)廣州市市場(chǎng)購買的糕點(diǎn)10批、蘋果汁10批和鹵豬肉10批進(jìn)行檢測(cè)分析，均未檢出納他霉素。

3 結(jié)論

納他霉素具有高效、不影響食物風(fēng)味等特點(diǎn)，常被作為防腐劑添加在食品中。為了保障廣大消費(fèi)者的安全，加強(qiáng)檢測(cè)食品中的納他霉素十分必要[14]。本研究采用75%甲醇水溶液作為提取溶劑，利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，建立食品中納他霉素的檢測(cè)方法。通過優(yōu)化流動(dòng)相、色譜柱及定容液，納他霉素峰形對(duì)稱、響應(yīng)強(qiáng)度較高。通過優(yōu)化前處理提取液，納他霉素的回收率和精密度較高。納他霉素在0.1～10.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.1 mg·kg-1。在3種常見食品（糕點(diǎn)、蘋果汁和鹵豬肉）中納他霉素的平均回收率為83.24%～101.60%，RSD為1.51%～8.21%。該方法前處理簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，成本低，可滿足大批量食品中納他霉素篩查和定量分析的需求。

參考文獻(xiàn)

[1]DA SILVA S V，PICOLOTO R S，F(xiàn)LORES E M M，

et al.Evaluation of bromine and iodine content of milk whey proteins combining digestion by microwave-induced combustion and ICP-MS determination[J].Food Chemistry，2016，190：364-367.

[2]金悅敏，胡國(guó)華.HPLC法測(cè)定糕點(diǎn)類食品中的8種常用防腐劑[J].食品工業(yè)，2018，39（6）：270-273.

[3]官詠儀，邱志超，金夢(mèng)，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中納他霉素和富馬酸二甲酯的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（6）：2246-2250.

[4]莫紫梅.高效液相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)中納他霉素的含量[J].糧食與飼料工業(yè)，2016（8）：66-68.

[5]王韻，郁蕉竹，李巧蓮，等.HPLC測(cè)定食品中納他霉素前處理?xiàng)l件優(yōu)化[J].遼寧化工，2023，52（8）：1237-1240.

[6]羅語薇，太華璋，黃才真，等.生物防腐劑對(duì)蛋糕的防腐作用及機(jī)理[J/OL].食品與發(fā)酵工業(yè)，1-12[2024-10-22].https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040406.

[7]王然然，王楠楠，苗育可，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中8種食品添加劑[J].現(xiàn)代食品，2021（5）：148-150.

[8]張祖麗，徐歡，李歆，等.納他霉素在蛋糕表面防腐保鮮中的應(yīng)用研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2023，49（16）：

182-187.

[9]陳秀英.液相色譜法測(cè)定食品中納他霉素的方法驗(yàn)證[J].現(xiàn)代食品，2022，28（14）：202-204.

[10]王承業(yè)，譚高好，吳基任，等.超高效液相色譜-變波長(zhǎng)法快速檢測(cè)糕點(diǎn)中6種食品添加劑[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2022，13（18）：5924-5932.

[11]李青，藍(lán)夢(mèng)哲，宋光林，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定焙烤食品中多種防腐劑含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（11）：283-287.

[12]李青，李麗君，宋光林.同時(shí)測(cè)定焙烤食品中多種防腐劑含量的方法研究[J].食品科技，2020，45（1）：357-360.

[13]聞佳鈺，劉強(qiáng)欣，何麗娜，等.優(yōu)化QuEChERS方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定年糕中納他霉素[J].現(xiàn)代食品，2021（24）：204-207.

[14]陳婧超，劉淑蕓，馮英鵬，等.RP-HPLC法測(cè)定石斛鮮汁中納他霉素殘留量研究[J].食品工業(yè)，2019，40（3）：273-276.