摘要：為探究不同放牧強(qiáng)度對北方農(nóng)牧交錯帶草地功能微生物參與的硝化過程影響機(jī)理。本研究以設(shè)置不放牧（0羊單位·hm-2·生長季-1）、輕度（2.35羊單位·hm-2·生長季-1）、中度（4.80羊單位·hm-2·生長季-1）和重度（7.85羊單位·hm-2·生長季-1）4個放牧強(qiáng)度的放牧實驗平臺為研究對象，通過同位素15N庫稀釋法，測定土壤總硝化速率。結(jié)果表明：相比于對照，土壤總硝化速率在輕度、中度和重度放牧處理下分別提高了18.1%，6.2%，22.1%；氨氧化細(xì)菌基因AOB amoA豐度分別提高了10.72%，8.92%，42.01%，但在不同放牧強(qiáng)度之間無顯著差異。土壤總硝化速率（6.72 mg·kg-1·d-1）及AOB amoA拷貝數(shù)（1.12×107copies·g-1）最高值均出現(xiàn)在9月份，且整體高于其他月份。本研究表明，氨氧化細(xì)菌是參與晉北農(nóng)牧交錯帶放牧草地土壤總硝化速率的主要微生物。此外，土壤含水量、銨態(tài)氮含量及土壤微生物生物量氮是影響土壤總硝化速率的關(guān)鍵因子。

關(guān)鍵詞：總硝化作用；放牧強(qiáng)度；農(nóng)牧交錯帶；氨氧化古菌；氨氧化細(xì)菌

中圖分類號：S812.2""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）09-2769-08

收稿日期：2024-01-15；修回日期：2024-04-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金區(qū)域創(chuàng)新發(fā)展聯(lián)合基金重點項目（U22A20576，32301375）；山西省重點實驗室項目（202104010910017） 資助

作者簡介：

郝杰（1992-），男，漢族，山西偏關(guān)人，博士研究生，主要從事草地生態(tài)與管理研究，E-mail：ndhaojie@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：dongkuanhu@sxau.edu.cn

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.09.010

引用格式：

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HAO Jie， DIAO Hua-jie， WU Shuai-kai，et al.Response of Total Nitrification Rate to Grazing Intensity in The Agro-Pastoral Ecotone in Northern Shanxi［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（9）：2769-2776

Response of Total Nitrification Rate to Grazing Intensity in The

Agro-Pastoral Ecotone in Northern Shanxi

HAO Jie1，3，4， DIAO Hua-jie2，3，4， WU Shuai-kai2，3，4， SU Yuan2，3，4， GAO Yang-yang2，3，4，

LIANG Wen-jun2，3，4， NIU Hui-min1，2，3， YANG Qian-wen2，3，4， CHANG Jie2，3，4， MA Teng-fei2，3，4，

WANG Ting-shuai2，3，4， QI Zhi-yuan2，3，4， WANG Chang-hui2，3，4， DONG Kuan-hu2，3，4*

（1. College of Forestry， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 2. College of Grassland Science，

Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 3. Shanxi Key Laboratory of Grassland Ecological

Protection and Native Grass Germplasm Innovation， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 4.Youyu Loess Plateau

Grassland Ecosystem Research Station， Youyu， Shanxi Province 037200， China）

Abstract：To explore the mechanism of the effect of different grazing intensities on the nitrification process involving functional microorganisms in grasslands of the northern agro-pastoral ecotone. This study focused on a grazing experimental platform with four grazing intensities：no grazing （0 sheep units·hm-2·growing season-1），light grazing （2.35 sheep units·hm-2·growing season-1），moderate grazing （4.80 sheep units·hm-2·growing season-1），and heavy grazing （7.85 sheep units·hm-2·growing season-1）. The soil total nitrification rate was measured using the isotope 15N pool dilution method. The results showed that compared to the control，the soil total nitrification rate under light，moderate，and heavy grazing treatments increased by 18.1%，6.2%，and 22.1%，respectively. The abundance of ammonia-oxidizing bacteria gene AOB amoA increased by 10.72%，8.92%，and 42.01%，respectively，but there were no significant differences among different grazing intensities. The highest values of soil total nitrification rate （6.72 mg·kg-1·d-1） and AOB amoA copy number （1.12×107 copies·g-1） were both observed in September and were generally higher than in other months. This study indicates that ammonia-oxidizing bacteria are the main microorganisms involved in the soil total nitrification rate in grazing grasslands of the northern agro-pastoral ecotone. Additionally，soil moisture content，ammonium nitrogen content，and soil microbial biomass nitrogen are the key factors affecting the soil total nitrification rate.

Key words：Total nitrification;Grazing intensity;Agro-pastoral ecotone;Ammonia oxidizing archaea;Ammonia oxidizing bacteria

硝化作用作為氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不僅決定了植物與微生物對氮素的利用率，而且與土壤酸化，硝酸鹽流失及氧化亞氮排放等環(huán)境問題密切相關(guān)［1］。因此，全面了解土壤總硝化作用動態(tài)及其控制因子對于構(gòu)建草地氮循環(huán)過程模型及制定適應(yīng)性的草地管理措施至關(guān)重要［2］。之前的研究多數(shù)集中于凈氮礦化速率，而對土壤微生物通過氧化NH+4或有機(jī)氮產(chǎn)生硝酸鹽（NO-3）的速率，即總硝化速率，卻少有研究［3-5］。凈硝化速率，即NO-3生產(chǎn)和消耗過程之間的平衡，指示了NO-3可利用性，但沒有提供硝化過程與控制因素的關(guān)系［6］。

放牧主要通過采食、踐踏、糞尿歸還等對植物群落結(jié)構(gòu)及土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了顯著影響，這些作用均會使硝化微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了草地土壤總硝化速率［7-8］。在內(nèi)蒙古典型草原不同放牧梯度實驗發(fā)現(xiàn)，重度放牧顯著減少了氧化亞氮排放并降低了土壤的總硝化速率，這主要與植被蓋度降低導(dǎo)致的微生物群落改變有關(guān)［9］。此外，另有研究表明，重度放牧條件下草地土壤總硝化速率顯著提高，這與土壤中銨態(tài)氮大量累積引起的微生物群落結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)［10］。硝化作用是由兩組功能明確的微生物來完成的，其中一組硝化菌群是將氨氧化為亞硝酸鹽的氨氧化菌，它是由兩種完全不同的微生物組成，一種是我們眾所周知的氨氧化細(xì)菌（Ammonia oxidizing bacteria，AOB），另一種是最近被發(fā)現(xiàn)的氨氧化古菌（Ammonia oxidizing archaea，AOA），雖然它們都能將氨氧化為亞硝酸鹽，但是它們的酶途徑不同，且豐度受環(huán)境因素的影響差異較大［11］。Pan等［12］發(fā)現(xiàn)，輕度放牧可顯著提高硝化作用，而重度放牧?xí)@著降低硝化作用；在輕度放牧小區(qū)土壤中，與AOB相比，AOA在調(diào)控硝化作用占主導(dǎo)地位，在重度放牧小區(qū)，AOB占主導(dǎo)地位。Liu等［13］在中國黃土高原半干旱草地輪牧實驗結(jié)果表明，放牧增加了可培養(yǎng)AOB菌群規(guī)模，且隨著放牧強(qiáng)度的增加，顯著提高了0～10 cm土層硝化潛力。由此可見，在放牧草地生態(tài)系統(tǒng)中，兩類微生物在硝化作用中的重要性和相對貢獻(xiàn)還尚不清楚。因此，在特定的草地環(huán)境及放牧干擾條件下，迫切需要準(zhǔn)確評估兩類微生物參與的土壤總硝化速率對不同放牧強(qiáng)度的響應(yīng)機(jī)制。

本研究依托2016年在晉北農(nóng)牧交錯帶草地建立的放牧試驗平臺，通過同位素15N庫稀釋法和生物學(xué)技術(shù)手段，探討晉北農(nóng)牧交錯帶草地土壤總硝化速率如何響應(yīng)不同放牧強(qiáng)度，并揭示兩類微生物在硝化作用中的重要性。為制定晉北農(nóng)牧交錯帶草地可持續(xù)發(fā)展的氮循環(huán)調(diào)控措施和微生物氮轉(zhuǎn)化的模型預(yù)測提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗地概況

本研究在山西省右玉黃土高原草地生態(tài)系統(tǒng)研究站（39°59′48″ N，112°19′40″ E，海拔1348 m）進(jìn)行，該地區(qū)是中國北方典型農(nóng)牧交錯帶草地生態(tài)系統(tǒng)。該地區(qū)年平均降水量為 425 mm（1991—2019年），其中60%出現(xiàn)在6月至8月；年平均氣溫為4.6℃，月平均氣溫最低為1月的-14.0℃，最高為 7月的 20.2℃（1991—2019年）［14-15］。試驗期間（2020年6—9月），生長季平均氣溫為 17.0℃；生長季平均降水量為72 mm，6月份最低（55.9 mm），8月份最高（81.4 mm，圖1）。無霜期為 94—146 d。研究地點的土壤屬于栗鈣土［16］。優(yōu)勢種為賴草（Leymus secalinus），其他伴生種有堿地風(fēng)毛菊（Saussurea japonica）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、鵝絨委陵菜（Potentilla anserina）等［14-15］。

1.2" 試驗設(shè)計

自 2016 年 8月起，在研究區(qū)內(nèi)圍封了16個大小相同的小區(qū)（每個小區(qū)面積為2000 m2）開展放牧試驗。試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共設(shè)4個處理，分別為設(shè)置不放牧：0羊單位· hm-2·生長季-1（UG）、輕度放牧：2.35羊單位·hm-2·生長季-1（LG）、中度4.80羊單位·hm-2·生長季-1（MG）和重度放牧：7.85羊單位·hm-2·生長季-1（HG）。每個處理包括四個重復(fù)。放牧處理從每年6月1日至9月30日進(jìn)行。

1.3" 測定指標(biāo)及方法

1.3.1" 總硝化速率的測定" 為了能更好的反映總硝化速率對放牧強(qiáng)度響應(yīng)的真實情況，于2020年生長季（6—9月）用100 cm3環(huán)刀取原狀土進(jìn)行野外原位試驗。每個放牧小區(qū)用5個環(huán)刀取表層土壤（0～10 cm），并用保鮮膜包好（保證土壤的完整性）帶回實驗室。在其中的一個環(huán)刀內(nèi)取20 g土壤放入105℃烘箱烘干24 h測定土壤含水量。其它土壤用15NH4，15NO3均勻標(biāo)記并分為二組（每組2個環(huán)刀），其中一組15NH4或15NO3標(biāo)記好的土壤直接用150 mL 0.5 mol·L-1硫酸鉀溶液浸提（記為培養(yǎng)前：T0），另一組埋回原位培養(yǎng)48 h，重復(fù)T0浸提步驟。將浸提液帶回實驗室進(jìn)一步測定15NH4和15NO3。具體步驟為：用50 mL注射器將30 mL的過濾溶液依次加入圓口玻璃瓶中（瓶內(nèi)放置玻璃珠），向其中加入0.3 g氧化鎂（pH＞11），敞開，30℃振蕩24 h，150 r/min。用鑷子將直徑為0.5 cm圓片濾紙掛在別針制成的掛勾上，固定于橡膠墊片上，塞進(jìn)瓶蓋，每個掛鉤掛2張無灰濾紙片，各加入10 μL的1 mol·L-1的草酸溶液；然后向振蕩過后的瓶內(nèi)加入0.3 g戴氏合金，擰緊瓶蓋繼續(xù)30℃ 150 r·min-1振蕩24 h。待振蕩完成后，打開瓶蓋，用干凈鑷子取出無灰濾紙，放入96孔樣品盤中，做好標(biāo)記，然后將此批樣品放入干燥器中，24 h小時后取出。最后通過氣相色譜-同位素質(zhì)譜（GC－IRMS）技術(shù)分析濾紙片收集的15N豐度，最后根據(jù)公式計算總硝化速率［17-18］。

GN=Mi-Mft×ln（Hi/Hf）ln（Mi/Mf）

公式中，Mi=初始14+15N庫（μg·g-1干土），Mf=培養(yǎng)后14+15N庫（μg·g-1干土），Hi=初始15N庫（μg·g-1干土），Hf=培養(yǎng)后15N庫（μg·g-1干土），t=天（d）。

1.3.2" 土壤氨氧化微生物基因豐度的測定" 在2020年8月，在每個小區(qū)用直徑為3 cm土鉆在0～10 cm土層取土壤樣品。過2 mm篩后，將樣品迅速保存于-80℃冰箱，用來測定氨氧化古菌基因AOA amoA、氨氧化細(xì)菌基因AOB amoA豐度。使用FastDNASPIN Kit提取土壤DNA，實時熒光定量PCR儀（Quantitative Real-time PCR）對AOA amoA和AOB amoA豐度進(jìn)行測定。擴(kuò)增體系為25 μL，配置如下：SYBYGreen Ex Taq緩沖液5 μL，dNTP Mix 4 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補(bǔ)足至 25 μL。采用博日LineGene9600plus型熒光定量PCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增程序及引物見表1，擴(kuò)增斜率為-3.3～-3.7之間，擴(kuò)增效率gt;80%，R2gt;0.99，溶解曲線為單峰［19］。

1.3.3" 土壤微生物生物量、全碳、全氮、pH值及容重測定" 一份鮮土采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法，總有機(jī)碳分析儀（TOC，Elementar vario，德國）測定土壤微生物生物量碳（Microbial biomass carbon，MBC）和微生物生物量氮（Microbial biomass nitrogen，MBN）［20］。另一份土風(fēng)干后用元素分析儀（Elementar vario MACRO cube，德國）測定土壤中C，N含量。土壤容重（Bulk density，BD）的測定采用環(huán)刀法。在每年8月份取完地上生物量的位置挖掘土壤刨面，并用100 cm3的環(huán)刀采取0～10 cm土層土樣，設(shè)置3個重復(fù)，采樣過程中不破壞土壤結(jié)構(gòu)，取出環(huán)刀后，削除兩端多余的土并將壁上的土擦干凈后，放入自封袋帶回實驗室，放入105℃烘箱中烘干至恒重并稱重，最后計算土壤容重。依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1377—2007，取10 g風(fēng)干土放入100 mL小燒杯中，放入磁轉(zhuǎn)均勻攪拌1 min，然后靜置30 min，用pH（ST-2100，USA）計測定土壤pH值。

1.3.4" 土壤無機(jī)氮、溫度及含水量測定" 在生長季（6月—9月），鄰近總硝化速率測定的取樣位置，使用3 cm的土鉆，隨機(jī)取3鉆0～10 cm深的土樣，混合成一個土壤樣品。取過2 mm篩后的鮮土10 g采用K2SO4浸提法測定土壤銨態(tài)氮（NH+4-N）和硝態(tài)氮（NO-3-N）含量。在生長季，每月用數(shù)顯式溫度計（M-SP-E-17，北京）與TDR（Time domain reflectometry，USA）測定4次0～10 cm深度土壤溫度（Soil temperature，ST）和土壤含水量（Soil moisture，SM）。

1.4" 數(shù)據(jù)分析

混合線性模型（LMEs）中的重復(fù)測量方差分析用來分析放牧強(qiáng)度、月份及其交互作用對總硝化速率、AOA amoA、AOB amoA基因豐度和AOA/AOB的影響。其中月份視為重復(fù)觀測變量，區(qū)組視為隨機(jī)因子。單因素方差分析用來檢驗不同處理之間的效應(yīng)。使用R語言（version 4.2.0;R Core Team，2022）的“nlme”和“corrplot”包分別進(jìn)行混合線性模型和相關(guān)性分析［21-22］。其余分析均使用R軟件進(jìn)行分析。使用Origin 2021軟件作圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同放牧強(qiáng)度對土壤總硝化速率的影響

重復(fù)測量混合效應(yīng)模型結(jié)果顯示，不同放牧強(qiáng)度及其與月份的交互作用對土壤總硝化速率均無顯著影響（表2，圖2）。比較處理間的均值發(fā)現(xiàn)，不同放牧強(qiáng)度間無顯著差異，但相比于UG，LG、MG和HG處理下土壤總硝化速率分別提高了18.1%，6.2%，22.1%?？傁趸俾时憩F(xiàn)出明顯的季節(jié)動態(tài)（P＜0.01）?？傁趸俾首罡咧担?.72 mg·kg-1·d-1）出現(xiàn)在9月份，且整體明顯高于其它月份。

2.2" 不同放牧強(qiáng)度對AOA amoA，AOB amoA基因豐度的影響

晉北農(nóng)牧交錯帶草地生態(tài)系統(tǒng)中，AOA amoA基因豐度高于AOB amoA基因豐度，這表明AOA在本研究地點數(shù)量較多（圖3a-d）。重復(fù)測量混合效應(yīng)模型結(jié)果表明，放牧強(qiáng)度、月份及二者之間的交互作用對AOA amoA拷貝數(shù)無顯著影響（表2，圖3a-b）；7月達(dá)到最高為1.58×108 copies·g-1，9月份達(dá)到最低為1.07×108 copies·g-1。放牧強(qiáng)度及放牧強(qiáng)度與月份的交互作用對AOB amoA拷貝數(shù)無顯著影響（表2）；而AOB amoA的拷貝數(shù)表現(xiàn)出明顯的季節(jié)動態(tài)（表2，圖3c，Plt;0.01）。AOB amoA拷貝數(shù)最高值（1.12×107copies·g-1）出現(xiàn)在9月份，且整體高于其它月份。從均值看，與UG相比，AOB amoA拷貝數(shù)在LG、MG與HG處理下分別提高了10.72%，8.92%，42.01%（圖3 d）。放牧強(qiáng)度、月份對AOA/AOB有顯著影響（表2，Plt;0.05），而放牧強(qiáng)度與年份之間的交互作用無顯著影響。相比于其它處理，HG顯著降低了AOA/AOB（圖3e-f，Plt;0.05）。隨時間的推進(jìn)AOA/AOB逐漸降低，在6月達(dá)到最大（68.67），9月最低（13.69）。

2.3" 影響土壤總硝化速率的因子

相關(guān)性分析結(jié)果表明，GN與AOB amoA基因豐度、MBN，NH+4-N呈顯著正相關(guān)關(guān)系（圖4，Plt;0.05）；GN與SM呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）。AOA amoA基因豐度、AOA/AOB，MBC，MBC/MBN、TN，BD，ST，NO-3-N與GN無顯著相關(guān)關(guān)系。AOB amoA基因豐度與NH+4-N呈顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05），與SM和AOA/AOB呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）。AOA amoA基因豐度與MBN，TN呈顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）。

3" 討論

總硝化作用增加了土壤氮損失和徑流的風(fēng)險，因此，準(zhǔn)確評估人為干擾對總硝化速率的影響將有助于確定適當(dāng)?shù)牡芾砗蜏厥覛怏w緩解策略［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，放牧有增加土壤總硝化速率的趨勢，這與之前有關(guān)放牧強(qiáng)度對總硝化速率影響的結(jié)果一致［7-8］。許多研究表明，放牧增加了土壤總硝化速率［1］。Liu等［13］在中國黃土高原半干旱草地輪牧實驗中表明，放牧增加了可培養(yǎng)氨氧化細(xì)菌菌群規(guī)模，且0～10 cm土層硝化潛勢隨放牧強(qiáng)度的增加逐漸增加。Xie等［8］以青藏高寒草甸為研究對象，探索放牧對硝化與反硝化菌群的影響中發(fā)現(xiàn)，相比于對照，放牧使青藏高寒草甸土壤中AOB高出40倍、AOA高出3倍左右，進(jìn)而促進(jìn)了土壤總硝化速率。Pan等［25］發(fā)現(xiàn)，AOB amoA基因的豐度隨放牧強(qiáng)度的增加而增加，AOB amoA相比于AOA amoA對放牧強(qiáng)度的響應(yīng)更高，而AOA amoA基因豐度比AOB amoA高2倍左右，AOA/AOB的比值隨放牧強(qiáng)度的增加逐漸增加。AOB amoA豐度與土壤總硝化速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系表明，在我們的研究地點，盡管AOA amoA豐度高于AOB amoA，但氨氧化細(xì)菌在調(diào)控總硝化速率對放牧強(qiáng)度響應(yīng)中占主導(dǎo)地位［25-26］。這也進(jìn)一步證明了在絕大多數(shù)放牧草地生態(tài)系統(tǒng)中，相比于其他硝化微生物，氨氧化細(xì)菌是限制硝化反應(yīng)的重要微生物［27-28］。與總硝化速率的變化趨勢一致，放牧增加了AOB豐度，進(jìn)而提高了土壤總硝化速率。然而，盡管我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)放牧提高了土壤總硝化速率，但與對照相比沒有達(dá)到顯著水平。這可能與土壤中NH+4-N的可利用性有關(guān)。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，土壤總硝化速率、AOB amoA基因豐度均與NH+4-N呈顯著正相關(guān)關(guān)系。放牧通過糞尿歸還提高了土壤中NH+4-N的可利用性，進(jìn)而提高了土壤中總硝化速率；但同時，放牧通過采食作用減少凋落物中的養(yǎng)分歸還可能會抵消部分這種正效應(yīng)，因此，與對照相比未達(dá)到顯著水平［29-30］。此外，土壤總硝化速率、AOB amoA基因豐度均與土壤含水量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明硝化作用通常發(fā)生在氧氣充足的表層土壤中［11］。放牧通過采食作用，降低植被蓋度，增加土壤中水分蒸發(fā)會提高土壤中的氧氣含量，可能會增加土壤中氨氧化細(xì)菌豐度與總硝化速率；但這種正效應(yīng)也可能會被踐踏增加的土壤容重所抵消［31-32］。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，總硝化速率與AOB amoA呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)動態(tài)，總硝化速率和AOB amoA豐度在9月份明顯高于其他月份。這可能與土壤底物濃度有關(guān)［33-35］。之前的一項整合分析表明，在全球尺度上，土壤總硝化速率主要受土壤底物濃度和微生物生物量調(diào)控［2］。土壤微生物生物量氮與土壤總硝化速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系也進(jìn)一步表明，在生長季末期9月，部分根系死亡提供了更多的可利用性養(yǎng)分來刺激微生物生長與活動，從而提高了氨氧化細(xì)菌豐度與土壤總硝化速率［36-37］。此外，在降雨量較低的9月份，土壤含水量也通常較低，較高的氧氣濃度也可能為氨氧化細(xì)菌提供了有利的生存環(huán)境［2，38］。這些結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了深入探究土壤總硝化速率季節(jié)動態(tài)變化及其調(diào)控機(jī)制的必要性，以期在未來研究中為土壤氮循環(huán)的高效管理奠定堅實的科學(xué)基礎(chǔ)。

4" 結(jié)論

放牧提高了土壤總硝化速率，且呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)動態(tài)。氨氧化細(xì)菌主導(dǎo)了土壤總硝化速率對放牧強(qiáng)度的響應(yīng)。此外，土壤銨態(tài)氮含量、土壤含水量及微生物生物量氮是影響北方農(nóng)牧交錯帶草地土壤總硝化速率的重要因子。

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