摘要：肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面具有重要的作用。為探究紅芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.）黃酮類成分合成的分子調(diào)節(jié)機制，本研究以紅芪幼苗為材料，通過RACE技術(shù)，克隆HpC4H基因，并進行生物信息學(xué)分析和表達模式分析。結(jié)果顯示：HpC4H基因全長為1634 bp，編碼477個氨基酸，蛋白分子量為54.94 kD，不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。亞細胞定位預(yù)測顯示，該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，具有C4H保守功能區(qū)并屬于細胞色素P450超基因家族。序列分析發(fā)現(xiàn)，HpC4H氨基酸序列與檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom.）的相似性高達92.84%。qRT-PCR結(jié)果表明，HpC4H基因在紅芪不同組織中的表達模式為：根gt;莖gt;葉，同時，該基因的表達量在不同濃度鐵鹽干預(yù)下有上調(diào)趨勢，推測鐵鹽可能在調(diào)控紅芪HpC4H基因表達中發(fā)揮一定作用，且低濃度鐵鹽溶液作用顯著。

關(guān)鍵詞：紅芪；肉桂酸-4-羥化酶；基因克?。昏F鹽溶液；基因表達

中圖分類號：Q946.5""" 文獻標(biāo)識碼：A"""" "文章編號：1007-0435（2024）09-2749-10

收稿日期：2024-04-07；修回日期：2024-06-20

基金項目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)項目（82160730）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目（81860683）；甘肅省教育廳雙一流重大科研項目（GSSYLXM-05）資助

作者簡介：

何軍剛（1993-），男，漢族，甘肅省天水人，博士研究生，主要從事中藥鑒定與品質(zhì)評價研究，E-mail：1604360479@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：gslichengyi@163.com

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.09.008

引用格式：

何軍剛， 李昕蓉， 魏小成，等.紅芪HpC4H基因的克隆及其鐵鹽干預(yù)下的表達分析［J］.草地學(xué)報，2024，32（9）：2749-2758

HE Jun-gang， LI Xin-rong， WEI Xiao-cheng，et al.Cloning and expression analysis of HpC4H in Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. with the intervention of iron salt［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（9）：2749-2758

Cloning and expression analysis of HpC4H in Hedysarum polybotrys

Hand.-Mazz. with the intervention of iron salt

HE Jun-gang1， LI Xin-rong2， WEI Xiao-cheng1， XIE Yao-hui1， XIE Xin-ming1， LI Cheng-yi1*

（1. College of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou， Gansu Provicne 730000， China; 2. College of Acupuncture

and Massage， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou， Gansu Provicne 730000， China）

Abstract：Cinnamate-4-hydroxylase （C4H） has an important role in the regulation of plant growth and development. To investigate the molecular regulatory mechanism of flavonoid synthesis in Hedysarum polybotrys，the HpC4H gene was cloned from Hedysarum polybotrys seedlings by the RACE technique，and its bioinformation and expression patterns were analyzed in this study. The results showed that the full length of HpC4H was 1634 bp in length which encodes 477 amino acids. The molecular weight of the HpC4H protein was 54.94 kD. The HpC4H protein structure did not contain signal peptides and transmembrane structural regions. Subcellular localization prediction showed that the HpC4H protein was located in the endoplasmic reticulum. It had a C4H-conserved functional region and belonged to the cytochrome P450 supergene family. The amino acid sequence of HpC4H showed the highest similarity of 92.84% with Caragana korshinskii. The results of qRT-PCR showed that the HpC4H gene was predominantly expressed in roots，followed by stems and leaves. At the same time，the expression of this gene was up-regulated under the intervention of different concentrations of iron salt. This study speculated that different concentrations of iron salts might play a certain role in regulating the expression of the HpC4H gene in Hedysarum polybotrys，and the low iron salt solution had a significant effect.

Key words：Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.;Cinnamate-4-hydroxylase;Gene clone;Iron salt solution;Gene expression

紅芪（Hedysari Radix）為豆科（Leguminosae）植物多序巖黃芪（Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.）的干燥根，是甘肅省道地藥材。紅芪具有補氣生陽，利水消腫，生津養(yǎng)血等功效，臨床常用于治療氣虛水腫，血虛萎黃等病證［1］。研究表明，其主要含有多糖、黃酮、皂苷、氨基酸等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［2］。目前，紅芪研究主要集中在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定［3-4］、化學(xué)成分分離及分析［5-7］和新藥研發(fā)［8-10］等方面，其C4H基因的克隆及表達分析研究較少。微量元素在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，植物可以通過多種金屬轉(zhuǎn)運蛋白來調(diào)節(jié)養(yǎng)分的吸收、轉(zhuǎn)運和分配，從而維持細胞礦質(zhì)營養(yǎng)平衡［11］。其中，鐵元素可以促進葉綠素合成，提高相關(guān)酶活性［12］。研究表明，鐵元素在土壤中以Fe3+形式存在，難以被吸收，通常采用葉面噴施的方式以補充植物所需的鐵營養(yǎng)［13］。鐵元素主要存在于葉綠體中，鐵缺失影響光合電子的傳遞，導(dǎo)致光化學(xué)損傷［14］；鐵過量影響植物根系的生長，使得葉片出現(xiàn)黃褐色斑點［15］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度（0.5～8 mg·L-1）的鐵鹽溶液可以促進紅芪主要有效成分（黃酮類）的累積，進而可以提高紅芪質(zhì)量［16］。

在植物的次生代謝過程中，苯丙氨酸類代謝途徑形成黃酮類成分。研究發(fā)現(xiàn)［17］苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonia-lyase，PAL）、肉桂酸4-羥化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-ceoumarate：CoA ligase，4CL）和查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）是該代謝過程中的4個關(guān)鍵酶（圖1），其中C4H是苯丙烷代謝途徑中第一個羥化酶，該酶基因催化生成的4-羥基肉桂酸和對香豆酰-CoA是合成黃酮類化合物的重要底物。近年來，已從膜莢黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.）［18］、芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）［19］、獨行菜（Lepidium apetalum Willd.）［20］、華北紫丁香（Syringa oblate Lindl.）［21］、斑地錦（Euphorbia maculate L.）［22］、紫蘇（Perilla frutescens（L.） Britt.）［23］、甘薯（Ipomoea batatas （L.） Lam.）［24］、大豆（Glycine max （L.） Merr.）［25］等植物中克隆得到C4H基因，并展開相關(guān)研究。

基于此，本試驗通過查找GenBank中的其他豆科植物C4H基因的CDS序列，進行同源比對，設(shè)計高度保守片段簡并引物。采用PCR結(jié)合RACE技術(shù)從紅芪中克隆得到全長C4H基因序列，通過生物信息學(xué)手段，對HpC4H蛋白的理化特性、信號肽、亞細胞定位、跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)及機構(gòu)功能區(qū)域等預(yù)測分析。同時分析了紅芪不同部位（根、莖、葉）及不同濃度鐵鹽溶液干預(yù)下紅芪根中C4H基因的相對表達量，旨在從基因水平研究紅芪中黃酮類化合物生物合成途徑及分子調(diào)控作用機制，為深入研究C4H家族蛋白的酶學(xué)特性提供理論依據(jù)［26］。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

將試驗所用紅芪種子剝?nèi)デv膜，挑選種粒飽滿的種子作為培育材料。用體積分數(shù)1%次氯酸滅菌20 min，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)80%的濃硫酸浸泡2～3 min打破種子休眠，之后流水沖洗干凈，最后置于帶有濾紙培養(yǎng)皿中，在人工氣候箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光照8 h/d，溫度25℃，濕度50%～70%［27］。幼苗用于盆栽試驗，土培基質(zhì)由蛭石和珍珠巖（5∶1）組成，盆栽紅芪的營養(yǎng)液配方為［28］：Ca（NO3）2·4H2O 945.000 mg，KNO3 607.000 mg，NH4H2PO4115.000 mg，MgSO4·7H2O493.000 mg，ZnSO4·7H2O 8.600 mg，H3BO3 6.200 mg，MnSO4 22.300 mg，Na2MoO40.250 mg，CuSO4·5H2O 0.080 mg，CoCl2 0.025 mg，溶于1 L蒸餾水中，pH值調(diào)為6.5。根據(jù)《藥用植物營養(yǎng)與施肥技術(shù)》書中內(nèi)容結(jié)合預(yù)實驗設(shè)置鐵鹽溶液濃度［29］，采用葉面噴施法，以3.67 mg·L-1（低濃度）、11.00 mg·L-1（高濃度）2個濃度進行處理，每個處理3個重復(fù)，分別在處理0，6，12和24 h后，取三株長勢一致的紅芪幼苗，混合根組織，迅速置于液氮中冷凍，保存于-80℃超低溫冰箱，備用。

1.2" 試劑與儀器

植物總RNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司，Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒、ApexHF HS DNA聚合酶預(yù)混液-FS、qPCR試劑盒、引物合成，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，SMARTer RACE 5′/3′Kit試劑盒購自于TaKaRa公司，DEPC，50×TAE，DNA Marker DL5000和DL2000購自于北京BioTeke有限公司，渦旋振蕩混勻儀IKA WORKERS高速組織研磨器北京天根生化科技有限公司，瓊脂糖凝膠電泳儀EC250-90，北京六一電泳廠，實時qPCR儀FTC-8000，反轉(zhuǎn)錄PCR儀，超低溫冰箱DW-86L626，超微量分光光度計NanoDrop 2000C，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3" 試驗方法

1.3.1" 紅芪總RNA的提取和cDNA的合成" 取紅芪幼苗100 mg，迅速置于液氮中研成細粉，按照植物總RNA試劑盒說明書步驟提取總RNA，并在超微量分光光度計上檢測其濃度和純度，于-80℃冰箱保存，采用質(zhì)量分數(shù)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，若質(zhì)量符合要求，用Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒，參照說明書步驟將紅芪RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，產(chǎn)物于-20℃保存用于后續(xù)實驗。

1.3.2" HpC4H基因的克隆" 在NCBI網(wǎng)上找到其他豆科植物的這C4H基因CDS序列進行同源比對，找出高度保守區(qū)段，利用Primer6.0軟件設(shè)計一對簡并引物見表1，以紅芪cDNA為模板，根據(jù)ApexHF HS DNA聚合酶預(yù)混液-FS試劑盒對HpC4H基因片段進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，根據(jù)測序的得到的序列片段設(shè)計3′RACE和5′RACE引物，3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA的合成具體操作按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE（TaKaRa）試劑盒進行。PCR反應(yīng)體系和程序按照說明書進行，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接pMD19-T Vertor、轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，挑選陽性菌液稀釋后，送至西安擎科生物科技公司進行測序。利用DNAMAN和BioEdit軟件對HpC4H基因序列進行比對和拼接后，根據(jù)所得全長序列設(shè)計克隆C4H編碼區(qū)全長引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進行PCR擴增，經(jīng)檢測和測序獲得全長序列。反應(yīng)結(jié)束得到的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測目的基因位置。

1.3.3" HpC4H基因的生物信息學(xué)分析" 將所測定的HpC4H基因序列在GenBank上通過Blast搜索核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，由DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，使用ORF Finder查找開放閱讀框。生物信息學(xué)分析主要采用一些網(wǎng)上在線軟件進行分析，如采用ExPASy Protparam分析蛋白質(zhì)相對分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、氨基酸種類占比等；用ProtScale分析蛋白質(zhì)疏水性；SignalP4.1進行信號肽預(yù)測分析；使用TMHMM2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線工具Wolfpsor分析目的序列的亞細胞定位；分別用PRABI，SWISS-MODEL，NetPhos，SMART等預(yù)測分析編碼蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、保守功能結(jié)構(gòu)域。同時運用MEGA7.0將氨基酸序列與已鑒定功能的C4H氨基酸序列進行比對，構(gòu)建氨基酸同源樹。

1.3.4" HpC4H基因的表達水平分析" 利用實時熒光定量PCR檢測HpC4H基因的相對表達量。分別取約100 mg紅芪不同組織（根、莖、葉）和不同鐵鹽處理（0，6，12和24 h）的根部組織，使用植物組織RNA試劑盒快速提取總RNA，再用Evo M-MLV Plus cDNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)課題組前期克隆得到的紅芪actin基因序列［30］，運用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計用于qPCR的特異性引物（見表1），參照SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒的說明書進行操作，反應(yīng)結(jié)束后，確認擴增曲線和熔解曲線，求取三個平行管的Ct值，根據(jù)Ct值計算出目的基因的相對表達量n，公式為n=2-△△Ct［31］，使用GraphPad 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理并作圖，使用SPSS（25.0）軟件進行單因素方差分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" HpC4H基因克隆與核苷酸序列分析

對紅芪根總RNA進行濃度和純度檢測，使用超微量紫外分光光度計測得RNA質(zhì)量濃度為132 ng·μL-1，A260 /A280值為2.01，經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S RNA和18S RNA條帶清晰可見（圖2A），表明所提取的總RNA完整性和純度較好，可用于下一步實驗。根據(jù)克隆得到的HpC4H基因片段（圖2B）序列設(shè)計引物，以紅芪RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用RACE結(jié)合PCR技術(shù)擴增出一條長約為1634 bp的序列（圖2C），使用ORF Finder對HpC4H基因cDNA序列進行分析，開放閱讀框為1155 bp，共編碼477個氨基酸，方框表示起始密碼子和終止密碼子，其中ATT為起始密碼子，TAA為終止密碼子（圖3）。將HpC4H核苷酸序列在GenBank上進行序列比對，結(jié)果顯示，HpC4H與豆科的一些植物相似性較高，如與檸條錦雞兒（C. korshinskii Kom.）、蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.）、膜莢黃芪（A. membranaceus （Fisch.） Bge.）、黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala Bge.）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的核苷酸序列相似性分別在88.96%，85.86%，85.80%，85.42%，85.89%，與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）、紅車軸草（Trifolium pratense L.）、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）、鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）的相似性都在80%以上。比對結(jié)果表明所得基因?qū)儆贑4H家族。

2.2" HpC4H蛋白理化性質(zhì)分析

采用在線工具ExPASy對HpC4H蛋白進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果見表2可知，HpC4H多肽鏈具有20種氨基酸，其中數(shù)目最少的為半胱氨酸（Cys），只有5個，其中亮氨酸（Leu）數(shù)目最多，為52個，占整個氨基酸組成的10.9%。HpC4H蛋白分子式為C2482H3885N691O691S15，分子量為54.94 kD，等電點為8.75，氨基酸殘基中帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為60，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為65，不穩(wěn)定指數(shù)為47.14，脂溶指數(shù)為90.69，親水性平均指數(shù)（GRAVY）為-0.368，根據(jù)GRAVY值范圍在-2～2，正值表明此蛋白為疏水性蛋白，負值表明此蛋白為親水性蛋白，故推測HpC4H蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白。

2.3" HpC4H編碼蛋白信號肽、亞細胞定位、跨膜區(qū)預(yù)測分析

通過Signal P4.1對HpC4H蛋白信號肽預(yù)測，如圖4A顯示，其中S值最大為0.196，表明HpC4H蛋白不存在信號肽。利用TMHMM2.0在線工具預(yù)測可知HpC4H蛋白跨膜螺旋數(shù)為0，結(jié)果見圖4B，可知此蛋白無跨膜區(qū)。使用在線工具Plant-mPLoc分析目的序列的亞細胞定位，結(jié)果顯示，HpC4H蛋白最有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.4" HpC4H蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)功能的預(yù)測分析

利用PRABI在線工具對HpC4H蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測（圖5A），結(jié)果表明，HpC4H蛋白主要由α-螺旋（Alpha helix，圖中為藍色）占46.33%，β轉(zhuǎn)角（Beta turn，圖中為綠色）占4.40%、無規(guī)則卷曲（Random coil，圖中為紫色）占36.27%、延伸鏈（Extended strand，圖中為紅色）占13.00%。利用SWISS-MODEL對HpC4H蛋白質(zhì)進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，如圖5B所示，HpC4H蛋白的GMQE值和QMEAN值分別是0.92和-0.89，說明該模型可靠性較強。Conserved domains在線工具分析表明，HpC4H蛋白在1～472位，在保守區(qū)含有1個PLN02394（反式肉桂酸酯-4-單加氧酶）超家族保守結(jié)構(gòu)域，屬于CYP450超基因家族（圖5C）。

2.5" 磷酸化位點分析和糖基化修飾

利用在線工具NetPhos 3.1預(yù)測HpC4H蛋白磷酸化位點有3類氨基酸分別是Ser、Thr、Tyr，結(jié)果顯示HpC4H蛋白中存在48個潛在的氨基酸磷酸化位點，其中17個酪氨酸磷酸化位點，19個可能的絲氨酸磷酸化位點，12個可能的蘇氨酸磷酸化位點，潛在的磷酸化對蛋白質(zhì)功能的正常發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用。通過NetNGlyc-1.0預(yù)測（圖6），處于34位的甘氨酸可能需要進行N-糖基化修飾。

2.6" HpC4H的氨基酸序列同源比對分析

對HpC4H基因編碼的氨基酸序列在GenBank上進行BLAST比對，結(jié)果如圖7顯示，HpC4H氨基酸序列與豆科植物檸條錦雞兒（C. korshinskii Kom.）的相似性最高，達到了92.84%，與黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala Bge.）、蒙古黃芪（A. membranaceus（Fisch.）Bge.var.）、膜莢黃芪（A. membranaceus Bge.）、雙莢決明（Senna bicapsularis （L.） Roxb.）、洋甘草（Glycyrrhiza glabra L.）、甘草（G. uralensis Fisch.）、鷹嘴豆（C. arietinum L.）的相似性在90.57%～92.63%，相似度很高，可以推測此氨基酸序列就是HpC4H氨基酸序列。利用MEGA7.0軟件對HpC4H氨基酸序列與其他豆科植物進行多序列比對，并進行繪制系統(tǒng)進化樹。從圖8中可以看到，紅芪HpC4H蛋白序列與檸條錦雞兒、洋甘草和甘草屬于同一分支，且與同科植物的檸條錦雞兒在進化關(guān)系上最為接近。

2.7" 紅芪HpC4H基因組織表達分析

選用生長旺盛的紅芪根、莖、葉作為材料，運用qRT-PCR分析HpC4H基因的相對表達量。結(jié)果如圖9所示，HpC4H基因在各個組織中均有表達，表達水平由高到低依次根、莖、葉，表明HpC4H在紅芪不同組織中表達水平具有差異性（Plt;0.05）。

2.8" 鐵鹽干預(yù)下對HpC4H基因表達的影響分析

對紅芪幼苗進行鐵鹽溶液干預(yù)，以不同時間的紅芪根部組織為材料進行qRT-PCR分析HpC4H基因的相對表達量，圖10所示。經(jīng)鐵鹽干預(yù)后，與未干預(yù)相比，紅芪中HpC4H基因的表達水平提升，其中，在6 h達到最高峰，隨后逐漸降低。24 h后，低濃度干預(yù)組表達水平依為對照水平的1.75倍，高濃度干預(yù)組表達水平顯著低于對照水平；6～24 h低濃度鐵鹽干預(yù)組表達水平均比高濃度干預(yù)組高，在12 h時低濃度鐵鹽干預(yù)下的表達水平是高濃度干預(yù)的4.13倍。結(jié)果表明，不同濃度的鐵鹽溶液可以影響HpC4H基因的表達，且低濃度鐵鹽作用較顯著。

3" 討論

傳統(tǒng)生物學(xué)認為蛋白質(zhì)的序列決定其結(jié)構(gòu)和功能［32］?；谏镄畔W(xué)，通過計算機模擬和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，可對未知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能或其相關(guān)的輔助信息進行全面的分析和預(yù)測。目前，C4H基因在大豆中研究比較深入［25］，但紅芪C4H基因研究較少。本研究克隆出紅芪的C4H基因全長序列1634 bp，編碼477個氨基酸，預(yù)測分子量為54.94 kD。植物中的C4H基因可能以多拷貝數(shù)的形式存在，且有利于植物進行復(fù)雜的代謝調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在桂花（Osmanthus fragrans（Thunb.） Lour.）［33］與膜莢黃芪［18］（A. membranaceus Bge.）中至少存在兩個C4H基因拷貝，在大豆［25］（G. max （L.） Merr.）中鑒定出了四個C4H基因，而在豌豆（Pisum sativum L.）［34］中只有一個C4H基因，本研究在紅芪根組織中克隆得到一個與其他物種同源性較高的C4H片段，紅芪中是否也存在C4H基因家族，仍需進一步研究。

利用在線軟件對HpC4H蛋白進行分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)HpC4H蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白，與龍州鳳仙花（Impatiens morsei Hook.f.）ImC4H基因［35］和楓香（Liquidambar formosana Hance）LfC4Hb基因［36］的研究結(jié)果一致。本試驗還發(fā)現(xiàn)HpC4H基因編碼的蛋白不存在信號肽且無跨膜結(jié)構(gòu)，與茶樹（Camellia sinensis （L.） O. Ktze.）C4H基因［37］的研究結(jié)果一致，推測該蛋白質(zhì)可能在細胞內(nèi)部執(zhí)行功能，如催化生化反應(yīng)、參與蛋白質(zhì)合成、調(diào)控基因表達等。亞細胞定位結(jié)果顯示，HpC4H蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性最大。C4H的N-端有錨定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列，其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可能參與了電子鏈的化學(xué)傳遞［38］。研究發(fā)現(xiàn)，從毛竹（Phyllostachys edulis （Carrière） J. Houz.）［39］中鑒定出6個PeC4Hs，亞細胞定位均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，然而，高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）［40］的SbC4H1定位在細胞質(zhì)中，芒果（Mangifera indica L.）［41］的C4H蛋白則定位在線粒體中，因此，不同物種C4H定位存在差異。HpC4H蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，三級結(jié)構(gòu)模型可靠性較強，與荸薺（Eleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.）［42］C4H基因的研究結(jié)果相似，具有C4H所特有的保守結(jié)構(gòu)域，屬于細胞色素P450超基因家族CYP73A亞家族中的一員［43］，細胞色素P450被認為是一類超基因家族編碼的含有血紅素的氧化酶類，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，微粒體和線粒體內(nèi)膜上［44］。蛋白質(zhì)磷酸化作為一種最普遍和最重要的翻譯后修飾調(diào)控著幾乎所有的生命過程，磷酸化修飾常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的側(cè)鏈羥基［45］，與本研究預(yù)測HpC4H蛋白磷酸化位點3類氨基酸相一致，潛在的磷酸化可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。序列分析發(fā)現(xiàn)，HpC4H與其他豆科植物C4H基因的同源性較高，表明這些豆科植物C4H基因在進化的過程中比較保守，預(yù)示著C4H基因在植物的生長發(fā)育中起著重要作用［42］。利用實時熒光定量PCR技術(shù)證實了C4H基因在不同器官組織中具有不同表達模式，研究發(fā)現(xiàn)，HpC4H在根莖葉中均有表達，推測HpC4H基因在根、莖、葉中均能發(fā)揮作用，影響著植物的生長發(fā)育［46］。

當(dāng)植物受逆境脅迫下，可通過調(diào)節(jié)一系列合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影響其黃酮類的合成和積累［47］。其中，就包括C4H基因。Ryan［48］等在矮牽?；ㄖ械难芯堪l(fā)現(xiàn)，UV-B脅迫處理下，C4H等基因表達量的增加使得植物組織中總黃酮含量增加。Liu等［49］發(fā)現(xiàn)K離子缺乏誘導(dǎo)的菊花中C4H等基因的表達量減少，造成了該部位黃酮含量的降低。鐵是植物必需的微量元素之一，廣泛參與植物的葉綠素合成、光合作用、呼吸及電子傳遞等重要過程［50］。研究發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的鐵肥可以改善印度薺菜的品質(zhì)，并且促進對Cd的吸收［51］；鐵脅迫有利于“碭山酥梨”葉片礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收及相關(guān)基因的表達［52］；施用一定量的鐵和錳可以促進隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA三種丹參酮類物質(zhì)的積累［53］。課題組前期通過施加適量鐵鹽溶液以提高紅芪中黃酮類化合物的含量［16］。本研究結(jié)果表明，不同濃度（0.5～8 mg·L-1）鐵鹽對紅芪根系HpC4H基因的表達均有影響，且低濃度鐵鹽影響顯著。基于此，推測鐵鹽可能通過調(diào)控HpC4H基因的表達，促進紅芪異黃酮類成分的積累，進而提高紅芪藥材質(zhì)量。

本研究僅利用在線分析工具對HpC4H蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進行預(yù)測分析，為進一步探究HpC4H基因在紅芪中的生物學(xué)功能，后續(xù)可通過將HpC4H基因克隆質(zhì)粒與p1300-cYFP連接構(gòu)建過表達載體HpC4H-YFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染煙草，于激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細胞定位區(qū)域；采用蛋白印跡法驗證HpC4H在煙草中的表達，進一步驗證其蛋白分子量，為利用分子生物技術(shù)來提高紅芪品質(zhì)提供理論依據(jù)。

4" 結(jié)論

本研究成功克隆出紅芪HpC4H基因全長序列，并對其進行生物信息學(xué)分析顯示，開放閱讀框為1155 bp，共編碼477個氨基酸，蛋白分子量為54.94 kD，不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。HpC4H序列中具有一個C4H保守結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位顯示該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。表達模式分析表明，HpC4H在不同組織中表達有差異，在根中最高，在葉片中最低，該基因表達量在不同濃度鐵鹽干預(yù)下，均在24 h內(nèi)先升高隨后逐漸降低，初步確定HpC4H基因在紅芪中參與鐵鹽脅迫應(yīng)答，為后續(xù)深入探究C4H基因在紅芪中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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