關(guān)鍵詞：桄榔；ISSR分子標記；遺傳多樣性；聚類分析

桄榔Arengapinnata為棕櫚科桄榔屬多年生植物，產(chǎn)自中南半島及東南亞，主要分布于我國廣西、廣東、海南、云南等地，廣西境內(nèi)多見于靖西、德保、天等、大新等石灰?guī)r地帶，龍州分布較多[1]。桄榔具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值，其幼嫩果實可以制蜜餞，子可入藥；花序汁液可制糖、釀酒；嫩葉可作蔬菜，葉基部硬棕可制繩索、刷子等，根部可用于治療腎結(jié)石[2-4]；由莖干髓心加工成的桄榔粉為藥食同源的中藥[5]，被稱為“可食用的木頭”。此外，桄榔樹可作為改造石漠化石山地區(qū)和西部山區(qū)生態(tài)環(huán)境的苗木，也適用于退耕還林坡耕地的造林，是一種優(yōu)良的造林綠化樹種[6]。

因具有獨特的食用、藥用價值，桄榔的開發(fā)利用愈來愈受到重視。開發(fā)利用依賴于天然資源，由于桄榔植株被砍伐后無復萌能力[7]，加之長期不合理采伐與利用，以及該物種生長緩慢、種子發(fā)芽率低等自然障礙，桄榔天然林遭受嚴重破壞，生境破碎化，群體更新不良，居群數(shù)量急劇下降。如果長期無節(jié)制開采，必將導致桄榔資源枯竭，甚至滅絕。因此，亟須開展桄榔天然群體遺傳多樣性研究，加強桄榔天然林的保護，制定科學有效的資源保護策略。

隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，DNA分子標記已經(jīng)成為研究植物遺傳多樣性最普遍使用的方法，目前已有關(guān)于棕櫚科植物的遺傳多樣性方面的研究報道。如Loo等[8]用RAPD方法對分布于馬來西亞半島的林下軸櫚3個群體進行了聚類分析；Naoto等[9]用RAPD分子標記分析了8個日本蒲葵變種群體，并探討了其起源；Haymes等[10]用AFLP和SSR標記分析了海棗的遺傳多樣性；Knudsen[11]從形態(tài)學角度，結(jié)合RAPD標記對棕櫚進行了群體生物學研究，發(fā)現(xiàn)了較高的遺傳多樣性。目前，ISSR已被廣泛用于遺傳育種[12-13]、遺傳圖譜構(gòu)建[14-16]、品種鑒定[17-18]、種質(zhì)資源分類和親緣關(guān)系分析[19-20]等領(lǐng)域，是多種植物遺傳多樣性分析的主要技術(shù)手段之一[21]。將ISSR技術(shù)應用于棕櫚科植物遺傳多樣性方面的研究也有較多相關(guān)報道。丁燦等[22]以22份來自海南和云南的油棕新品種為試材，利用ISSR技術(shù)分析其遺傳多樣性，使用23條引物擴增出201條譜帶，其中84條譜帶為多態(tài)性，多態(tài)性比率為41.8%，在遺傳相似性系數(shù)0.838處被聚為2類，推測在海南和云南選育的新油棕種質(zhì)材料可能來自不同的國家或地區(qū)。李文表[23]以云南、廣西、湖南棕櫚為試材，分析其分布范圍和居群特征，結(jié)果表明棕櫚各居群內(nèi)個體數(shù)量較少，幼苗和幼樹較少，呈現(xiàn)衰退型的年齡結(jié)構(gòu)，棕櫚各居群的遺傳距離為0.06～0.27，遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。賈春媛[24]以香棕種群為試材，研究其遺傳多樣性水平及居群遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明香棕生境多樣化、環(huán)境適應性能力較強，其物種內(nèi)存在豐富的遺傳多樣性。這些研究結(jié)果為棕櫚科植物品種改良和保護策略的提出提供了重要的信息。目前，有關(guān)桄榔的研究主要集中于繁育技術(shù)[25-26]以及桄榔粉的理化性質(zhì)[27-28]、品質(zhì)和加工[29-30]等方面；在遺傳多樣性方面，蘭秀等[31]以來自8個地區(qū)的16份桄榔樣品為試材，調(diào)查和測定了其15個表型性狀，結(jié)果表明16份桄榔種質(zhì)的表型遺傳多樣性較豐富，不同地區(qū)的桄榔種質(zhì)資源存在較大變異性。然而，關(guān)于桄榔的分子標記遺傳多樣性的研究鮮見報道。

本文中采取野外調(diào)查與室內(nèi)試驗相結(jié)合的方法，采用ISSR分子標記對桄榔遺傳多樣性進行了分析，側(cè)重比對觀測等位基因數(shù)、Shannon’s遺傳多樣性信息指數(shù)、有效等位基因數(shù)量等群體遺傳變異參數(shù)，評價廣西桄榔天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)及其在物種水平和種群水平上的遺傳多樣性，以期為廣西桄榔天然遺傳資源的科學保護提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為健康桄榔新鮮嫩葉，樣品來源詳見表1，共有來自18個居群的201份材料。由于樹齡不同、居群大小不一致等，在每個居群中采集的樣本數(shù)量不相同。百色市田林縣（TL）9個樣本，河池市巴馬縣（BM）6個樣本，崇左市大新縣（DX）15個樣本，崇左市天等縣（TD）8個樣本，南寧市隆安縣（LA）8個樣本，廣西藥用植物園分園（JX）24個樣本，百色市德?？h（DB）10個樣本，崇左市龍州縣南亞所（NYS）18個樣本，龍州縣上龍鄉(xiāng)弄在村（NZ）7個樣本，龍州縣上龍鄉(xiāng)上龍村（SL）6個樣本，龍州縣逐卜鄉(xiāng)峪埂村（YG）8個樣本，龍州縣逐卜鄉(xiāng)隴亨村（LH）13個樣本，南寧市青秀山景區(qū)（QXS）5個樣本，南寧市人民公園（RMGY）3個樣本，廣西藥用植物園（南寧市ZWY）9個樣本，龍州縣武德鄉(xiāng)武德村（WD）17個樣本，龍州縣水口鎮(zhèn)舊街（SK）13個樣本，龍州縣逐卜鄉(xiāng)弄崗保護區(qū)（NG）22個樣本。采集后，將樣品置于硅膠袋中干燥備用。

1.2試驗方法

1.2.1總DNA的提取與質(zhì)量檢測

采用北京博友順生物技術(shù)有限公司的磁珠試劑盒提取植物干燥葉片總DNA。取3μLDNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。電泳譜帶清晰明亮，說明DNA純度較高，結(jié)果可靠；電泳譜帶彌散模糊、有脫尾現(xiàn)象，說明DNA純度不高，可能已經(jīng)降解。用ThermoNanoDropTM/ND-2000C檢測其濃度與純度，根據(jù)OD值分析純度，以1.8左右為宜。電泳檢測后將待測液稀釋至50mg/L，置于-20℃保存。

1.2.2ISSR-PCR反應引物篩選

從加拿大哥倫比亞大學公布的100條ISSR通用引物（https：//max.book118.com/html/2022/0715/5242031013004310.shtm，BUC801-UBC900）中隨機篩選出48條，以4個差異較大的樣本作為DNA模板，利用選定的反應體系與程序進行PCR擴增。

1.2.3ISSR-PCR反應體系和擴增程序

PCR反應體系總體積為25.0μL，其中含50mg/L的DNA模板2.0μL，10×Bufer2.5μL，引物（0.3μmol/L）2.0μL，4種dNTPs（0.25μmol/L）共2.0μL，MgCl2（1.5mmol/L）2.5μL，TaqDNA聚合酶（1.25U）0.15μL，用ddH2O補足剩余體積。PCR反應程序：94℃預變性5min；94℃變性45s，55～62℃退火45s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，4℃保存。

1.2.4ISSR-PCR擴增產(chǎn)物檢測

PCR結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物使用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，設(shè)定電壓125V，電泳50min，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄保存后，統(tǒng)計分析條帶。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以DL2000Marker為相對分子質(zhì)量標準，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物在凝膠電泳中移動速度的差異，以人工讀帶的方式，在相同遷移位置譜帶清晰可辨的以“1”記，模糊或缺失的以“0”記，在Excel表格中構(gòu)建二元數(shù)據(jù)，形成0/1矩陣圖。使用POPGENE32軟件計算群體的等位基因數(shù)量、有效等位基因數(shù)量、Shannon’s遺傳多樣性信息指數(shù)（I）、多態(tài)性比率、Nei’s基因多樣性指數(shù)等遺傳多樣性參數(shù)[32]。

利用POPGENE軟件得出居群遺傳相似性系數(shù)，使用NTSYS軟件基于非加權(quán)算術(shù)平均配對（UPGMA）法進行桄榔居群聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA質(zhì)量

201份桄榔種質(zhì)基因組DNA的擴增產(chǎn)物經(jīng)過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的所有譜帶清晰明亮、無拖尾現(xiàn)象，DNA片段完整無污染（圖1）。OD260/280值為1.7～2.0，說明DNA純度較高，質(zhì)量完好，適合進一步的PCR反應。

2.2引物擴增多態(tài)性

通過篩選從48條引物中獲得帶型穩(wěn)定、清晰、多態(tài)性較好的10條ISSR引物。對18個桄榔居群的201個DNA樣本進行PCR擴增，10條引物在所有樣本中均擴增出目的條帶，未出現(xiàn)無效等位基因或空缺條帶（圖2）。分析數(shù)據(jù)顯示：10條引物共擴增出150個位點，這些位點均具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為100%，平均每個引物擴增出15條譜帶，擴增片段長度為200～2000bp（表2）。各引物擴增出的總譜帶、多態(tài)性譜帶和多態(tài)性位點各不相同。P39引物擴增出22條譜帶，其多態(tài)性位點最多；P22引物擴增出6條譜帶，其多態(tài)性位點最少。結(jié)果表明，篩選出的ISSR引物用于擴增桄榔DNA的效果良好，擴增產(chǎn)物具有較高的多態(tài)性，同時供試桄榔的多態(tài)性信息豐富，201個桄榔種質(zhì)材料之間具有豐富的遺傳差異。

2.3遺傳多樣性比較

利用POPGENE32軟件對18個桄榔居群的遺傳參數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，多態(tài)性比例為53.11%，等位基因數(shù)量為1.5522、有效等位基因數(shù)量為1.2786、Nei’s基因多樣性為0.1681、Shannon’s遺傳多樣性信息指數(shù)為0.2578，多態(tài)性位點為150條。引物水平上：P39多態(tài)性位點最多，為22條，等位基因數(shù)量為2、有效等位基因數(shù)量為1.3328、Nei’s基因多樣性為0.2190、Shannon’s遺傳多樣性信息指數(shù)為0.3558；P22多態(tài)性位點最少，僅為6條，等位基因數(shù)量2、有效等位基因數(shù)量為1.3183、Nei’s基因多樣性為0.2096、Shannon’s遺傳多樣性信息指數(shù)為0.3458。18個居群樣本的位點數(shù)量、多態(tài)位點數(shù)量和多態(tài)性比率等遺傳參數(shù)如表3所示，獲得多態(tài)性比率為28.67%～73.33%，龍州縣弄崗保護區(qū)和（龍州縣南亞所樣本的多態(tài)性較高，南寧市人民公園居群（RMGY）樣本的多態(tài)性最低，有6個居群樣本的多態(tài)性比率為40.00%～50.00%。根據(jù)凝膠電泳檢測結(jié)果可知，龍州縣弄崗保護區(qū)、龍州縣南亞所和南寧市人民公園樣本的多態(tài)性比率分別為73.33%、72.00%、28.67%。

Nei’s基因多樣性指數(shù)是衡量供試材料遺傳多樣性較為有效和常用的指標之一，能反映物種等位基因的均勻度和豐富度[33]。本試驗結(jié)果顯示，龍州縣弄崗桄榔居群（NG）的Nei’s基因多樣性指數(shù)最高，南寧市人民公園桄榔居群（RMGY）的Nei’s基因多樣性指數(shù)最低，Nei’s的基因多樣性指數(shù)為0.1047～0.2074，平均值為0.1680。Shannon’s多樣性指數(shù)為0.1571（RMGY）～0.3260（NG），平均值為0.2578，與Nei’s基因多樣性指數(shù)的居群間變化結(jié)果相似。

2.4遺傳相似性與遺傳距離分析

由表4可知：桄榔18個居群之間的遺傳相似性系數(shù)為0.8338～0.9832，平均值為0.9162；遺傳距離為0.0169～0.1817，平均值為0.0882。其中，崇左市天等縣（TD）與南寧市人民公園（RMGY）樣本間的遺傳相似性系數(shù)為0.8338，遺傳距離為0.1817，這2個居群間的遺傳相似性系數(shù)最小，遺傳距離最大，遺傳差異最明顯，親緣關(guān)系最遠。龍州縣水口鎮(zhèn)（SK）與龍州縣武德鄉(xiāng)（WD）的遺傳相似性系數(shù)為0.9832，遺傳距離為0.0169，這2個居群之間的遺傳相似性系數(shù)最大，遺傳距離最小，遺傳差異不明顯，親緣關(guān)系最近。

2.5聚類分析

根據(jù)遺傳相似性系數(shù)，用NTSYS軟件中的UPGMA法進行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。在遺傳相似性系數(shù)為0.928時，可將18個居群分成5組。第1組為百色市田林縣（TL）和河池市巴馬縣（BM）的桄榔居群，占全部居群的11.11%。第2組包括3個居群，分別是崇左市大新縣（DX）、崇左市天等縣（TD）、南寧市隆安縣（LA），占全部居群的16.67%。第3組為靖西市（JX）和百色市德?？h（DB），占全部居群的11.11%。第4組包括9個群體，占全部居群的50.00%，分別是崇左市龍州縣南亞所（NYS）、龍州縣上龍鄉(xiāng)弄在村（NZ）、龍州縣上龍鄉(xiāng)上龍村（SL）、龍州縣逐卜鄉(xiāng)峪埂村（YG）、龍州縣逐卜鄉(xiāng)隴亨村（LH）、廣西藥用植物園（ZWY）、龍州縣武德鄉(xiāng)武德村（WD）、龍州縣水口鎮(zhèn)舊街（SK）、龍州縣逐卜鄉(xiāng)弄崗保護區(qū)（NG），這一部分居群的地理位置間隔較近，遺傳相似度較高，親緣關(guān)系較近，其中，NYS、NZ、SL、YG、LH這5個居群為一個亞組，ZWY、WD、SK、NG這4個居群為另一個亞組。第5組為南寧市青秀山景區(qū)（QXS）和南寧市人民公園（RMGY），占全部居群的11.11%。

3討論與結(jié)論

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，一個物種的遺傳多樣性越高或越豐富，其適應生存的能力就越強[31]。使用10條ISSR引物對18個桄榔居群的201個樣本進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示引物多態(tài)性比率達到了100%、Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.1683、Shannon’s遺傳多樣性信息指數(shù)為0.2578，其多態(tài)性高于桄榔屬的香棕[24]以及棕櫚科的油棕[22]、棕櫚[23]、董棕[34]、石山棕[35]和黃藤[36]，其中龍州縣弄崗保護區(qū)和龍州縣南亞所這2個居群樣本的多態(tài)性較高，南寧市人民公園樣本的多態(tài)性最低，這一結(jié)果與居群數(shù)量有一定的相關(guān)性。南寧市人民公園居群數(shù)量小，為零星分布，采集到的DNA樣本數(shù)量較少；弄崗保護區(qū)的居群數(shù)量較大，居群內(nèi)基因多樣性豐富，說明龍州縣弄崗保護區(qū)桄榔居群的多態(tài)性最豐富，適應環(huán)境的能力最強。

種質(zhì)間的遺傳相似性和差異性可以反映居群間的親緣關(guān)系。當遺傳相似性系數(shù)趨于0時，表明2個居群幾乎無親緣關(guān)系；當遺傳相似性系數(shù)趨于1時，表明2個居群的親緣關(guān)系極為相近[31]。本研究中桄榔種質(zhì)遺傳相似性系數(shù)為0.8338～0.9832，平均值為0.9162；香棕群體的遺傳相似性系數(shù)為0.6921～0.9989[23]，董棕的為0.8120～0.9739[33]，石山棕的為0.5650～0.7970[34]。桄榔種質(zhì)的遺傳一致度與董棕比較接近，與石山棕相差較遠。其原因可能是試驗材料均來自廣西，大部分居群來自崇左市，地理區(qū)域范圍相對狹窄，桄榔居群之間的交流較為頻繁，遺傳一致度較高。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似性系數(shù)為0.928時，可將18個居群分成5組，大部分居群的遺傳距離與地理距離存在一定的關(guān)系。聚在第1組的是百色田林居群和河池巴馬居群，其地理位置非常接近；第2組為崇左的大新居群、天等居群和南寧的隆安居群，其地理位置相互接壤，因而聚集在一起；來自龍州縣的8個居群聚集在第4組，這些居群的地理位置間隔較近，可能存在較強的基因交流，遺傳相似度較高，親緣關(guān)系較近，其起源可能相同。然而，也有少部分桄榔居群的遺傳關(guān)系與地理距離的關(guān)系不明顯，來自南寧市的3個栽培居群中ZWY與龍州縣武德鄉(xiāng)居群WD有較近的親緣關(guān)系，聚在第4組，而QXS和RMGY聚在第5組，這2個居群是屬于景區(qū)中的觀賞栽培種，也與其他桄榔居群間隔較遠，且從遺傳距離來看其與其他居群也有較大差異，推測其起源與其他居群不同。蘭秀等[31]根據(jù)表型數(shù)據(jù)在主成分分析的基礎(chǔ)上，將16份桄榔種質(zhì)聚為3類，第Ⅰ類為來自不同地區(qū)的9份種質(zhì)，大多數(shù)同區(qū)域的種質(zhì)被聚為一類，但少數(shù)同區(qū)域的種質(zhì)未被聚在一類，比如來自南寧藥用植物園的V1和V2種質(zhì)，V1與來自青秀山的2份種質(zhì)聚在第Ⅱ類，V2則被聚在Ⅰ類中，來自海南的4份種質(zhì)被聚到第Ⅲ類中，這一結(jié)果與本研究的結(jié)果不同，本研究中青秀山居群與南寧市人民公園居群被聚為一類，南寧藥用植物園居群與龍州武德縣居群被聚為一類。

通過分析廣西18個桄榔居群的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系，結(jié)果表明，廣西桄榔遺傳多樣性水平較高，ISSR分子標記在桄榔種質(zhì)間有豐富的多態(tài)性，多態(tài)性比率為100%，等位基因數(shù)量為1.5522，有效等位基因數(shù)量為1.2786，Shannon’s遺傳多樣性信息指數(shù)為0.2578，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.1681。弄崗保護區(qū)桄榔居群的遺傳多樣性最高（Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.2144），南寧市人民公園桄榔居群的遺傳多樣性最低（Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.1047），201份供試材料的遺傳相似性系數(shù)為0.8338～0.9832，平均值為0.9162，其中，崇左市天等縣居群與南寧市人民公園居群之間遺傳相似性系數(shù)最小，遺傳差異最明顯，親緣關(guān)系最遠；龍州縣水口鎮(zhèn)居群與龍州縣武德鄉(xiāng)居群之間遺傳相似性系數(shù)最大，遺傳差異不明顯，親緣關(guān)系最近。根據(jù)聚類分析結(jié)果，在遺傳相似性系數(shù)為0.928時，可將18個居群分成5個類群。

文中探討了廣西桄榔種質(zhì)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，研究結(jié)果存在一些局限性。例如，部分居群的樣本數(shù)量相對較少，后續(xù)研究應盡量擴大樣本規(guī)模，考慮收集引進更多地區(qū)的桄榔資源，以獲取更全面的遺傳信息，揭示更廣泛的桄榔遺傳多樣性。另外，不同的分子標記方法可能會提供不同層次的遺傳信息，文中僅采用了ISSR分子標記技術(shù)，未來可以考慮采用更多分子標記方法（如SRAP、SCOT、SNP等），并結(jié)合表型性狀，開展遺傳多樣性研究，更全面地反映種質(zhì)資源所攜帶的遺傳信息，從而更充分地解析桄榔的遺傳特征，為資源評價和開發(fā)利用提供更科學的參考。