摘 要：目的：探討綠原酸對(duì)氧化損傷細(xì)胞的改善作用及相關(guān)機(jī)制。方法：采用2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2，2’-azobis-2-methyl-propanimidamide，AAPH）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人胚腎細(xì)胞建立氧化損傷模型，并給予綠原酸進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定細(xì)胞中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性等抗氧化指標(biāo)以及氧化損傷相關(guān)通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果：綠原酸可降低活性氧水平和丙二醛含量（p＜0.05），提高谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力、過(guò)氧化氫酶活力以及超氧化物歧化酶活性（p＜0.05），可通過(guò)調(diào)控Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1/血紅素氧合酶1（Kelch-like ECH-associated protein 1 / Heme Oxygenase 1，Keap1/HO-1）通路以及降低NADPH氧化酶4（NADPH Oxidase 4，NOX4）的水平（p＜0.05）來(lái)改善細(xì)胞氧化損傷情況。結(jié)論：綠原酸的抗氧化機(jī)理可能與通過(guò)對(duì)Keap1/HO-1通路和NOX4蛋白的調(diào)控相關(guān)。

關(guān)鍵詞：綠原酸；抗氧化；蛋白免疫印記；Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1/血紅素氧合酶1（Keap1/HO-1）通路；NADPH氧化酶4（NOX4）

Study on Antioxidative Effect and Mechanism of

Chlorogenic Acid

Abstract： Objective： To study the effect of improvement and related mechanism of chlorogenic acid on oxidation-damaged cells. Method： Human embryonic kidney 293 cells （HEK293 cells） cultured in vitro were induced by 2，2’-azobis-2-methyl-prolimidamide （AAPH） to establish the oxidative damage model， and chlorogenic acid was given to intervention. Antioxidant indexes such as glutathione peroxidase activity， malondialdehyde content， superoxide dismutase activity and the expression of oxidative damage related pathway proteins in the cells were determined. Result： Reactive oxygen species levels and malondialdehyde content were reduced by chlorogenic acid （p＜0.05）. Glutathione content， glutathione peroxidase activity， catalase activity and superoxide dismutase activity were incerased by chlorogenic acid （p＜0.05）. And chlorogenic acid can improve cellular oxidative damage by regulating the Kelch-like ECH-associated protein 1/heme oxygenase 1 （Keap1/HO-1） pathway and reducing the expression of NADPH oxidase 4 （NOX4） （p＜0.05）. Conclusion： The antioxidant mechanism of chlorogenic acid may be related to its regulation of the Keap1/HO-1 pathway and NOX4 protein.

Keywords： chlorogenic acid; antioxidant; western blot; Kelch-like ECH-associated protein 1 / heme oxygenase 1 （Keap1/HO-1） pathway; NADPH oxidase 4 （NOX4）

“藥食同源”最早由《黃帝內(nèi)經(jīng)》提出，指既可作為藥物又可作為食物的一類物質(zhì)，因其具有特定的藥用屬性，可以預(yù)防多種疾病，如富含抗氧劑的食品可以降低某些癌癥和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)；某些食物還可以作為輔助治療手段，如山楂、生姜?！吨腥A人民共和國(guó)食品安全法》指出，生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的食品中不得添加藥品，但是允許添加既是食品又是中藥材的物質(zhì)，使相關(guān)產(chǎn)品在滿足原有功能的基礎(chǔ)上，增添保健功效。我國(guó)《既是食品又是中藥材名單》從最初的33種發(fā)展至如今的102種[1]，人們對(duì)藥食同源資源的市場(chǎng)需求在不斷增長(zhǎng)，其研究與開發(fā)成果逐漸顯現(xiàn)，“中醫(yī)館”“國(guó)潮茶飲”等新的養(yǎng)生方式深受大眾追捧。隨著健康中國(guó)戰(zhàn)略的持續(xù)推進(jìn)，《“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要》等指導(dǎo)性政策的出臺(tái)，不僅為健康產(chǎn)業(yè)的規(guī)范、快速、可持續(xù)發(fā)展提供了有力的支撐，也為藥食同源類產(chǎn)品的研究與開發(fā)帶來(lái)了更大的機(jī)遇。

許多慢性變性疾病的病因，包括身體相關(guān)炎癥、糖尿病及癌癥，都與氧化應(yīng)激有關(guān)[2-3]。氧化應(yīng)激是由細(xì)胞中氧化和抗氧化活動(dòng)之間的失衡引起的，伴隨著氧化還原通路破壞和大分子損傷[4]。病理性氧化應(yīng)激能產(chǎn)生大量的氧化中間物，如活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）、活性氮自由基等。正常細(xì)胞中有較低濃度的ROS，能夠傳遞細(xì)胞信號(hào)和維持穩(wěn)態(tài)，當(dāng)ROS水平升高，可導(dǎo)致諸多慢性變性疾病的發(fā)生，并對(duì)生物大分子造成嚴(yán)重?fù)p害。

綠原酸是金銀花、菊花、杜仲葉、蒲公英等多種藥食同源類植物資源的活性成分，在保健食品方面，《保健食品中綠原酸的測(cè)定》（GB/T 22250—2008）公布了綠原酸的檢測(cè)方法。綠原酸類物質(zhì)是由奎尼酸的羥基和反式苯基丙烯酸的羧基縮合形成的酯，是一種天然的抗氧化劑，研究發(fā)現(xiàn)綠原酸可通過(guò)降低ROS水平，上調(diào)抗氧化酶活性進(jìn)而降低或阻止氧化應(yīng)激的發(fā)生[5-6]。此外，綠原酸具有多種生物活性，如抗炎、抗菌、降血脂、調(diào)節(jié)血糖、抗疲勞、抗腫瘤、改善皮膚狀態(tài)等，被譽(yù)為植物黃金[7-11]。因膳食抗氧化劑具有預(yù)防氧化損傷和遏制慢性疾病發(fā)展的功效[12]，本研究擬利用綠原酸的抗氧化活性來(lái)驗(yàn)證其作為養(yǎng)生類食品或者保健品成分的優(yōu)勢(shì)，并探索綠原酸發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)理。

人胚腎（Human Embryonic Kidney 293，HEK293）細(xì)胞是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒DNA的永生化細(xì)胞，相比腫瘤細(xì)胞，其代謝條件更接近正常人體細(xì)胞，因此更能真實(shí)地模擬人體氧化應(yīng)激狀態(tài)[13]。2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2，2’-azobis-2-methyl-propanimidamide，AAPH）常用于構(gòu)建體外細(xì)胞氧化損傷模型，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA、線粒體、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生氧化損傷，最終引起細(xì)胞自噬、壞死和凋亡[14]。

基于上述原因，本文采用HEK293細(xì)胞為模型細(xì)胞、AAPH為氧化損傷誘導(dǎo)劑，構(gòu)建HEK293細(xì)胞氧化損傷模型，并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞抗氧化指標(biāo)及蛋白通路的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證綠原酸改善細(xì)胞氧化損傷情況的能力，為綠原酸在養(yǎng)生類食品或保健品中的應(yīng)用研究與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

HEK293細(xì)胞：國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)。

AAPH：美國(guó)Sigma公司；綠原酸（純度99.3%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；增強(qiáng)型細(xì)胞活力（Cell Counting Kit-8，CCK8）檢測(cè)試劑盒、二辛可寧酸（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒、還原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione Disulfide，GSSG）檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物：碧云天生物科技有限公司；過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）測(cè)定試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；NADPH氧化酶4抗體（anti-NADPH Oxidase 4，anti-NOX4）：英國(guó)Abcam公司；聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride，PVDF）、Gibco胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）：Thermo"Fisher Scientific公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（Enhanced Chemiluminescence，ECL）法顯色試劑盒：武漢塞維爾生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、過(guò)硫酸鉀、醋酸鈉（均為分析純）：北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（BB15）：Thermo Fisher Scientific公司；超凈工作臺(tái)（THM#51013522）：Thermo Fisher Scientific公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1780）：日本SHIMADZU公司；凝膠成像儀（4200SF）：上海天能科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：普瑞斯機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的環(huán)境下，用細(xì)胞完全培養(yǎng)基[89%DMEM（高糖）+10%FBS+1%雙抗]孵育。

1.3.2 氧化損傷模型的建立與綠原酸濃度選擇

將HEK293細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種至96孔板內(nèi)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵化24 h后，分為模型組（各加入濃度為0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1 AAPH，n=6）和綠原酸組（各加入濃度為10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1綠原酸，n=6）。處理24 h后，通過(guò)CCK8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，確定AAPH和綠原酸的適宜實(shí)驗(yàn)濃度范圍。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)ROS試劑盒和乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試驗(yàn)確定AAPH和綠原酸的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)濃度。

1.3.3 細(xì)胞分組及培養(yǎng)

對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分為空白組、模型組及綠原酸組。每孔移取2 mL HEK293（1×105個(gè)/孔）細(xì)胞懸液置于6孔板內(nèi)，每組2個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，空白組加2 mL完全培養(yǎng)基，模型組和綠原酸組加完全培養(yǎng)基配制的最優(yōu)濃度AAPH溶液各2 mL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 d后，空白組和模型組各加入2 mL完全培養(yǎng)基以替換掉原培養(yǎng)液，綠原酸組加入2 mL完全培養(yǎng)基配制的最優(yōu)濃度綠原酸溶液以替換掉原培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，棄去培養(yǎng)液，加入200 μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

（1）GSH含量測(cè)定。使用GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液樣品中的GSH濃度。將樣品以10 000 r·min-1離心5 min。于96孔板內(nèi)加入上清液0.01 mL，每孔加入0.15 mL GSH檢測(cè)工作液，室溫孵育5 min，加還原型輔酶Ⅱ溶液50 μL。（25±5）℃反應(yīng)25 min，檢測(cè)412 nm處吸光度。制備系列濃度的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，以吸光度對(duì)濃度作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如圖1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中GSH濃度。

（2）GSH-Px活力檢測(cè)。使用GSH-Px檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液樣品中的GSH-Px活性。配制應(yīng)用液和GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，將試劑一應(yīng)用液、試劑二應(yīng)用液及待測(cè)樣品37 ℃水浴5 min后混勻，4 000 r·min-1離心10 min，上清液分別與GSH標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液、20 μmol·L-1的GSH標(biāo)準(zhǔn)液及試劑應(yīng)用液三、四、五混勻，（25±5）℃靜置15 min，測(cè)定412 nm處吸光度?？鄢敲阜磻?yīng)的作用，1 mg樣品1 min內(nèi)使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1定義為一個(gè)酶活力單位。根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品中GSH-Px活力（U·mg-1）。

式中：c標(biāo)準(zhǔn)為GSH標(biāo)準(zhǔn)液濃度，20 μmol·L-1；N為酶促反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)，5；t為反應(yīng)時(shí)間，5 min；V樣為樣品取樣量，0.2 mL；cpr為細(xì)胞裂解液蛋白濃度，mg·mL-1；A非酶管、A酶管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管分別為按照試劑盒說(shuō)明書配制各檢測(cè)樣品管的吸光度。

（3）MDA含量檢測(cè)。使用脂質(zhì)氧化MDA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液樣品的MDA含量。取0.1 mL待測(cè)樣品分別與0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇及試劑一混合，在上述混合后的試劑中依次加入試劑二、試劑三及50%冰醋酸，95 ℃水浴40 min，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液測(cè)定532 nm處吸光度。MDA含量（nmol·mg-1）計(jì)算公式為

式中：C標(biāo)準(zhǔn)為四乙氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)品濃度，10 nmol·mL-1；A測(cè)定、A對(duì)照、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白分別為按照試劑盒說(shuō)明書配制各檢測(cè)樣品管的吸光度。

（4）總SOD活性檢測(cè)。使用總SOD活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液樣品的總SOD活力。配制工作液和反應(yīng)啟動(dòng)液待用。樣品組：依次加入0.02 mL處理后的細(xì)胞裂解液、0.02 mL反應(yīng)啟動(dòng)液和0.16 mL工作液；對(duì)照組1：依次加入0.02 mL SOD檢測(cè)緩沖液、0.02 mL反應(yīng)啟動(dòng)液和0.16 mL工作液；對(duì)照組2：依次加入0.04 mL SOD檢測(cè)緩沖液和0.16 mL工作液。37 ℃下孵育0.5 h，測(cè)定吸光度450 nm和600 nm處吸光度，實(shí)測(cè)吸光度=A450-A600。一個(gè)酶活力單位（U）指抑制率為50%對(duì)應(yīng)的SOD活力。樣品的總SOD活力計(jì)算公式為

式中：A1、As、A2分別為對(duì)照組1、樣品組和對(duì)照組2吸光度。

（5）CAT活力測(cè)試。使用CAT測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液樣品CAT活力。取0.1 mL待測(cè)樣品與試劑一、試劑二立即混勻，37 ℃水浴60 s，加入試劑三、試劑四混勻，測(cè)定405 nm處吸光度。樣本中每毫克蛋白對(duì)應(yīng)的 CAT 每秒鐘分解1 μmol 的H2O2 為一個(gè)活力單位。CAT酶活力（U·mg-1）計(jì)算公式為

式中：V樣為取樣量，0.1 mL；T為反應(yīng)時(shí)間，60 s；A對(duì)照、A測(cè)定分別為按照試劑盒說(shuō)明書配制相應(yīng)樣品管的吸光度；271為斜率倒數(shù)。

1.3.5 蛋白免疫印跡法測(cè)定相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平4 ℃、12 000 r·min-1條件下，將細(xì)胞裂解液離心30 min，BCA試劑盒測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度。將0.02 mg蛋白質(zhì)用上樣緩沖液稀釋，95 ℃下孵育8 min后采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺混合凝膠進(jìn)行電泳，取電泳膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶-含Tween20 Tris緩沖液（Tris-buffered saline with Tween-20， TBST）阻斷2 h，TBST沖洗至少3次，每次8 min。封閉盒中一抗與PVDF膜在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST沖洗3次。封閉盒中二抗與處理過(guò)的PVDF膜在（25±5）℃下孵育120 min。TBST洗滌3遍后，使用ECL顯色試劑盒使條帶可視化，以β-actin為內(nèi)參，并通過(guò)凝膠圖像處理系統(tǒng)和ImageJ2分析軟件分析目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK-8基本原理詳見LI和LIU等的描述[15-16]。

從圖2可以看出，隨著AAPH濃度的逐漸升高，細(xì)胞存活率隨之逐漸降低，其中100 μmol·L-1和200 μmol·L-1 AAPH處理HEK293細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率接近100%，表明其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響；而當(dāng)AAPH的濃度大于200 μmol·L-1時(shí)，隨著AAPH濃度逐漸升高，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率逐漸下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能是高濃度的AAPH誘導(dǎo)了細(xì)胞不可逆的氧化損傷。因此選擇100 μmol·L-1和200 μmol·L-1AAPH用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖3顯示了不同濃度的綠原酸對(duì)細(xì)胞存活率及抑制率的影響，當(dāng)綠原酸濃度大于200 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率急劇降低，造成此現(xiàn)象的可能原因是高濃度的綠原酸影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。根據(jù)圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇40 μg·mL-1和80 μg·mL-1綠原酸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 ROS實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)機(jī)體氧化-抗氧化體系的平衡被打破，ROS含量持續(xù)上升，過(guò)量的ROS將會(huì)進(jìn)攻細(xì)胞的脂質(zhì)膜、DNA等，進(jìn)而誘發(fā)相關(guān)疾病，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[17-18]。圖4為AAPH的ROS測(cè)定結(jié)果，最終確定采用100 μmol·L-1 AAPH作為構(gòu)建HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的造模濃度，理由如下。100 μmol·L-1和200 μmol·L-1的AAPH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，但100 μmol·L-1 AAPH誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的量明顯多于200 μmol·L-1，為后期綠原酸通過(guò)抗氧化作用來(lái)改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)提供更顯著的效果。綠原酸ROS測(cè)定結(jié)果見圖5，結(jié)果表明40 μg·mL-1 綠原酸能夠顯著抑制AAPH誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，故后續(xù)選擇40 μg·mL-1綠原酸用于進(jìn)一步研究。

不同英文字母表示差異顯著，p＜0.05。下同。

2.3 乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK-8實(shí)驗(yàn)和ROS實(shí)驗(yàn)篩選出了100 μmol·L-1 AAPH既能成功誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷同時(shí)不會(huì)抑制細(xì)胞存活率，40 μg·mL-1綠原酸也顯示了較好的抗氧化活性?；贑CK-8和ROS實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繼續(xù)進(jìn)行乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性測(cè)試[19]，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，100 μmol·L-1 AAPH可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞發(fā)生約3.2%的死亡率，而添加綠原酸干預(yù)后，細(xì)胞死亡率降到了0.2%左右，證明綠原酸能夠抑制AAPH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.4 抗氧化指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

GSH是機(jī)體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化劑，可以幫助機(jī)體清除自由基和過(guò)氧化物，提高生物體對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力，進(jìn)而維持機(jī)體的相對(duì)穩(wěn)定。GSH含量測(cè)定結(jié)果見圖7，表明綠原酸能夠顯著提高氧化損傷細(xì)胞的GSH含量（p＜0.05）。

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，其活力大小可以反映機(jī)體的硒水平。硒是GSH-Px酶系的組成部分，可以催化有害的過(guò)氧化物還原為無(wú)害的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能的完整性[20-21]。圖8為GSH-Px活力測(cè)定結(jié)果，綠原酸組的GSH-Px活力明顯高于模型組（p＜0.05），表明綠原酸能夠保護(hù)細(xì)胞中GSH-Px免受AAPH的消耗。

MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，反映了細(xì)胞和組織的氧化應(yīng)激水平。較高的MDA水平表明機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)強(qiáng)烈，氧化應(yīng)激性損傷程度較大。圖9為MDA測(cè)定結(jié)果，表明綠原酸能夠顯著抑制AAPH誘導(dǎo)的MDA損傷。

SOD是防御氧化應(yīng)激的第一道防線，SOD可以將超氧化物轉(zhuǎn)化為CAT，隨后通過(guò)CAT或氧化還原酶轉(zhuǎn)化為水，間接體現(xiàn)了機(jī)體清除自由基的能力大小[22]。圖10顯示了綠原酸對(duì)氧化損傷的HEK293細(xì)胞中所含SOD酶活力的影響，可以看出，綠原酸組的SOD活力顯著高于模型組（p＜0.05），雖然AAPH影響了細(xì)胞MDA的產(chǎn)生，但是經(jīng)具有抗氧化活性的綠原酸處理后，可以保護(hù)細(xì)胞免受AAPH的損傷。

CAT是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中扮演著重要角色。在240 nm波長(zhǎng)下，H2O2具有特征吸收峰，隨著H2O2被CAT逐步分解，反應(yīng)溶液的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，因此可根據(jù)吸光度的變化率間接反映CAT活性。圖11顯示了40 μg·mL-1綠原酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞的CAT活性的影響，可以發(fā)現(xiàn)與模型組相比，綠原酸組的CAT活性增加（p＜0.05），表明40 μg·mL-1的綠原酸能夠較好地抑制AAPH導(dǎo)致的細(xì)胞CAT活性降低，從而抑制H2O2過(guò)度產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。

2.5 氧化應(yīng)激通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase 1，HO-1）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)與氧化應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)源性保護(hù)通路[23]。當(dāng)細(xì)胞受到活性氧的攻擊時(shí)，Keap1與核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）發(fā)生分離[24]，細(xì)胞中Keap1含量增加，導(dǎo)致其下游效應(yīng)蛋白HO-1增加，HO-1具有抗氧化的作用，從而可使細(xì)胞免受ROS的損傷。

圖12顯示AAPH建立的氧化損傷模型成功誘導(dǎo)了HEK293細(xì)胞Keap1過(guò)表達(dá)（p＜0.05），而綠原酸組細(xì)胞的Keap1表達(dá)水平與空白組相比無(wú)顯著性差異。此外，與空白組相比，模型組細(xì)胞中HO-1表達(dá)水平降低（p＜0.05），結(jié)果見圖13，說(shuō)明Keap1/HO-1通路被抑制，而加入綠原酸后這種損傷被逆轉(zhuǎn)，可見HO-1表達(dá)水平的顯著提升（p＜0.05），這與王麗娟的研究結(jié)果一致[25]。

構(gòu)成NOXs家族的跨膜酶包括NOX1～3和NOX5，這些跨膜酶能夠產(chǎn)生超氧陰離子和NOX4，且細(xì)胞或組織中NOX4的量與氧化損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[26]。圖14為細(xì)胞NOX4的蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果，可以明顯發(fā)現(xiàn)模型組NOX4過(guò)表達(dá)（p＜0.05），而綠原酸組NOX4表達(dá)量與空白組接近，表明綠原酸能夠降低AAPH誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)水平。

綜上所述，綠原酸可通過(guò)調(diào)控Keap1/HO-1通路以及NOX4蛋白表達(dá)來(lái)改善細(xì)胞氧化損傷情況。

3 結(jié)論

本研究以綠原酸為對(duì)象，以AAPH誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞造成氧化損傷，探究綠原酸改善細(xì)胞氧化損傷的效果及機(jī)理。結(jié)果表明，綠原酸可顯著抑制氧化損傷細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的異常增高（p＜0.05），同時(shí)維持細(xì)胞抗氧化指標(biāo)GSH含量、GSH-Px酶活、CAT酶活及總SOD酶活在正常水平（p＜0.05），保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。此外，綠原酸可以調(diào)控氧化損傷相關(guān)通路Keap1/HO-1和NOX4蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了其出色的抗氧化活性，為綠原酸在養(yǎng)生類食品或保健品的應(yīng)用研究與開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于降低氧化損傷相關(guān)慢性病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]康力，葛瑞宏，周良，等.我國(guó)藥食同源產(chǎn)業(yè)發(fā)展問(wèn)題解析及綜合發(fā)展建議[J].生命科學(xué)，2024，36（8）：981-990.

[2]YAZAR I，SARIKAYA B，KOYUNCU I，et al.Evaluation of oxidative stress in degenerative rotator cuff tears[J].Journal of Shoulder and Elbow Surgery，2022，31（10）：e490-e497.

[3]YAN Z，WAN J，LIU J，et al.α-lipoic acid ameliorates hepatotoxicity induced by chronic ammonia toxicity in crucian carp （Carassius auratus gibelio） by alleviating oxidative stress，inflammation and inhibiting ERS pathway[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2023，266：115533.

[4]MIRZAEI H，MOMENI F，SAADATPOUR L，et al.MicroRNA： relevance to stroke diagnosis， prognosis， and therapy[J].Journal of Cellular Physiology，2018，233（2）：856-865.

[5]HIMSHWETA，VERMA N，TREHAN N，et al. Molecularly imprinted polymers in the analysis of chlorogenic acid： a review[J].Analytical Biochemistry，2024，694：115616.

[6]朱超，徐靖，汪笑秋，等.綠原酸通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善大鼠糖尿病氧化性腎損傷[J].中國(guó)藥師，2019，22（10）：1824-1828.

[7]GUO C，ZHANG X，YU Y，et al.Lonicerae Japonicae Flos extract and chlorogenic acid attenuates high-fat-diet-induced prediabetes via CTRPs-AdipoRs-AMPK/PPARα axes[J].Frontiers in Nutrition，2022，9：1007679.

[8]HE X，ZHENG S，SHENG Y，et al.Chlorogenic acid ameliorates obesity by preventing energy balance shift in high-fat diet induced obese mice[J].Journal of the Science of Food and"Agriculture，2021，101（2）：631-637.

[9]郜研.綠原酸抗疲勞功效評(píng)價(jià)及作用機(jī)理研究[J].中國(guó)食品添加劑，2023，34（12）：154-161.

[10]KIMSA-DUDEK M，SYNOWIEC-WOJTAROWICZ A，KRAWCZYK A，et al.The apoptotic effect of caffeic or chlorogenic acid on the C32 cells that have simultaneously been exposed to a static magnetic field[J].International Journal of Molecular Sciences，2022，23（7）：3859.

[11]ZUOU Y，RUAN Z，ZHOU L，et al.Chlorogenic acid ameliorates endotoxin-induced liver injury by promoting mitochondrial oxidative phosphorylation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2015，469（4）：1083-1089.

[12]FREI B.Efficacy of dietary antioxidants to prevent oxidative damage and inhibit chronic disease[J].The Journal of Nutrition，2004，134（11）：3196S-3198S.

[13]LIU J，CHEN Z，HE J，et al.Anti-oxidative and anti-apoptosis effects of egg white peptide，Trp-Asn-Trp-Ala-Asp，against H2O2-induced oxidative stress in human embryonic kidney 293 cells[J].Food and Function，2014，5（12）：3179-3188.

[14]BARYGINA V，BECATTI M，LOTTI T，et al.ROS-challenged keratinocytes as a new model for oxidative stress-mediated skin diseases[J].Journal of Cellular Biochemistry，2019，120（1）：28-36.

[15]LI C，ZHAN Y，MA X，et al.B7-H4 facilitates proliferation and metastasis of colorectal carcinoma cell through PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Clinical and Experimental Medicine，2020，20（1）：79-86.

[16]LIU L，QIU T X，SONG D W，et al.Inhibition of a novel coumarin on an aquatic rhabdovirus by targeting the early stage of viral infection demonstrates potential application in aquaculture[J].Clinical and Experimental Medicine，2020，174：104672.

[17]Lü J M，LIN P H，YAO Q Z，et al.Chemical and molecular mechanisms of antioxidants：experimental approaches and model systems[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2010，14（4）：840-860.

[18]NEMOTO S，TAKEDA K，YU ZX，et al.Role for mitochondrial oxidants as regulators of cellular metabolism[J].Molecular and Cellular Biology，2000，20（19）：7311-7318.

[19]LU Q，LIN X，WU J，et al.Matrine attenuates cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury through activating AMPK/Sirt3 signaling pathway[J].Journal of Receptor and Signal Transduction Research，2021，41（5）：488-493.

[20]CHI A P，LI H，KANG C Z，et al.Anti-fatigue activity of a novel polysaccharide conjugates from Ziyang green tea[J].International Journal of Biological Macromolecules，2015，80：566-572.

[21]LUAN X，YAN Y，ZHENG Q，et al.Excessive reactive oxygen species induce apoptosis via the APPL1-Nrf2/HO-1 antioxidant signalling pathway in trophoblasts with missed abortion[J].Life Science，2020，254：117781.

[22]BASHKATOVA V，ALAM M，VANIN A，et al.Chronic administration of rotenone induces Parkinsonian symptoms and increases levels of nitric oxide in rat brain[J].BMC Pharmacology，2008，8（S1）：A33.

[23]CAI Y H，XIAO R，ZHANG Y D，et al.DHPA protects SH-SY5Y cells from oxidative stress-induced apoptosis via mitochondria apoptosis and the Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway[J].Antioxidants（Basel），2022，11（9）：1794.

[24]LUO R，ZHU L，ZENG Z，et al.Dl-butylphthalide inhibits rotenone-induced oxidative stress in microglia via regulation of the Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway[J].Experimental and Therapeutic Medicine，2021，21（6）：597.

[25]王麗娟.基于Nrf2/Keap1/HO-1通路調(diào)控氧化應(yīng)激探討三芪祛濕方治療膜性腎病的機(jī)制研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2023.

[26]KURODA J，AGO T，MATSUSHIMA S，et al.NADPH oxidase 4 （Nox4） is a major source of oxidative stress in the failing heart[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（35）：15565-15570.