摘要：布魯氏菌病是由布氏桿菌感染引起的慢性接觸性人畜共患病，發(fā)病多為非典型性表現，極易被誤診，治療難度大。近年來，我國各地區(qū)上報的病例越來越多，盡管目前關于該病感染動物的報道很多，但有該病診斷研究的相關資料與調查研究較少，因此正確認識該病并及時準確地診斷對預防和控制該病具有至關重要的作用。本文從布魯氏菌病的流行病學、臨床特征、診斷技術等方面進行了介紹，以期為該病的診斷提供科學依據。

關鍵詞：布魯氏菌?。辉\斷技術；臨床癥狀

布魯氏菌病（brucellosis）是一種與農業(yè)社會演變有關的細菌性疾病，畜牧業(yè)是農業(yè)社會的一個組成部分，分布在世界各地。它被聯合國糧食及農業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織認為是最普遍的人畜共患病之一，該病對外界抵抗力很低，細菌在環(huán)境內極其不易存活，但在低溫下易存活，對畜牧業(yè)影響深遠[1]。到目前為止，根據其生化特性、抗原成分、宿主特異性和對宿主致病性將布氏桿菌分為10個種，我國目前存在有3個布氏桿菌生物亞型[2]，其中羊種布氏桿菌的毒力是最強的，豬種布氏桿菌次之，牛種菌的毒力最弱，羊型布氏桿菌對人的致病性最強危害性最大。臨床當中對于布魯氏菌病的治療還存在一定難度，傳統(tǒng)上一般采用抗生素療法，但容易產生耐藥性，效果不佳，因此在臨床中對于該病的診斷及各種養(yǎng)殖場的生物安全及環(huán)境檢測提出更高標準的要求[3]。

1 流行病學

在早期，當家畜在動物主人的附近飼養(yǎng)時，動物管理中的任何漏洞以及食用不安全的乳制品或其他動物產品都是牛布魯氏菌病及其人畜共患形式在人類中傳播的主要因素。隨著時間的推移，布魯氏菌病已經成為一種造成嚴重經濟損失的疾病，由于病原體對不同宿主的多種免疫防御機制的遺傳適應，它能夠影響許多物種的動物和人類。

布魯氏菌病在全世界的分布范圍在發(fā)生變化，每年都有多個地區(qū)連續(xù)性發(fā)生和消滅后又反復發(fā)生的報道，主要流行于非洲、亞洲的一些貧困落后的牛羊養(yǎng)殖集中地區(qū)以及經濟技術相對落后的地區(qū)[4]。在布氏桿菌的所有種型中，羊布氏桿菌對羊和人具有高度易感性，對畜牧生產危害也最嚴重，牛布魯氏菌病對牛的易感性最大，對人的危害僅次于羊布氏桿菌。布魯氏菌病的主要傳染源是患病動物以及帶菌動物，患病動物的排泄物、子宮分泌物、流產胎兒、胎盤以及乳液中都含有布氏桿菌，此外還包括被布氏桿菌污染的水、土壤、塵埃和皮毛等。通過直接傳播和間接傳播，在動物之間傳播，人類患病通常是由患病動物傳播給人類，而人與人之間的傳播十分罕見[5]。

2 臨床癥狀

布魯氏菌病主要臨床癥狀為懷孕的母畜在妊娠的任何階段發(fā)生流產癥狀，公畜則失去生育能力，通過胎盤傳播，順利生產的幼畜也會攜帶病原菌，感染病菌后潛伏2～3周，感染布魯氏菌病報道較多的動物主要有羊、牛和豬[6]。流產布氏桿菌是感染牛的主要布魯氏菌。然而，豬螺旋體也可能感染牛。豬白僵菌可通過牛奶傳播，導致人類感染。山羊布魯氏菌病的主要病原是山羊布氏桿菌。然而，山羊也可能感染布氏桿菌，感染后山羊、綿羊主要表現在流產和乳房炎并伴隨著支氣管炎，在懷孕的20～30 d流產，引發(fā)母羊精神萎靡，食欲嚴重下降、渴欲增強以及陰道炎等癥狀。感染公羊時，發(fā)生化膿性壞死性睪丸炎，睪丸明顯腫大，精囊內可見出血點和壞死灶。患病母牛在受孕后的6～8個月可能發(fā)生流產，多數胎兒表現為虛弱或死胎，伴隨著子宮炎和乳房炎、乳腺淋巴結肥大等癥狀。流產前，陰道黏膜會呈現潮紅、出現微小紅色結節(jié)并有化膿性分泌物，若流產導致胎衣滯留，子宮長期未能愈合，還可能會導致無法再次懷孕的后果。公?；疾t會引起病牛關節(jié)炎，出現生殖器癥狀，包括睪丸腫大、觸碰發(fā)熱和明顯疼痛等[7]。患病母豬的主要癥狀為流產、子宮炎、不孕、產死胎或弱仔。公豬表現為睪丸炎或附睪炎。人感染布氏桿菌病后的臨床表現可分為潛伏期、急性期、亞急性期和慢性期4期。處于急性期的患者通常會出現皮疹或黃疸，處于慢性期的患者通常存在骨關節(jié)的損害。最主要的癥狀是間歇性發(fā)熱、渾身無力、關節(jié)疼痛伴隨著大量出汗、體重急劇下降、頭痛、食欲不振等癥狀，常見的并發(fā)癥有關節(jié)炎、脊柱炎。男性患者出現附睪炎和睪丸炎、女性患者出現流產癥狀[8]。

3 細菌學診斷

布氏桿菌的分離培養(yǎng)是診斷布魯氏菌病的“金標準”，是布魯氏菌病確診的重要依據。通過采集患病動物的血液、組織、分泌物等，進行細菌的分離培養(yǎng)，常用的培養(yǎng)基主要有馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、血清葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等特殊培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基種類需要根據不同種屬的布氏桿菌來選擇。由于我國相關法律規(guī)定，布氏桿菌分離培養(yǎng)需要在生物安全3級（biologicalsafely level-3，BSL-3）的實驗室進行，并由專門的實驗人員進行操作，而且布魯氏桿菌的分離率較低，分離純化的培養(yǎng)基易被污染，所以對布魯氏桿菌的分離需要的時間也相對較長，至少3～9 d，也不能及時作出判斷，不適合普遍使用。

4 血清學診斷

4.1 虎紅平板凝集試驗

虎紅平板凝集試驗（RBT）是我國國標中布魯氏菌病的診斷方法之一。該方法的特點是操作相對簡單、可快速診斷、成本低而且靈敏度較高，但僅可對樣品進行初篩，可作為養(yǎng)殖場大規(guī)模檢疫的初步判斷標準。將血清樣品與RBT抗原在玻璃板上混勻，靜置一段時間后肉眼觀察，能夠觀察得到明顯的凝集現象即為陽性[9]；慢性病畜的血清產生假陰性的概率極高。此外，該方法敏感度較低、特異性也很差，容易與交叉感染的病畜血清而產生假陽性，最終結果需要與其他特異性高的檢測方法進行驗證。

4.2 試管凝集試驗

試管凝集試驗（SAT）是國標中規(guī)定對初篩陽性樣本確診而使用的進一步檢測方法，也是在實際生產工作中常使用的布氏桿菌檢測方法，該方法既可以定性，也可以用于定量試驗和半定量試驗。這種方法的結果判定相比虎紅平板凝集實驗更精確。此外，實踐證明，試管凝集試驗比較穩(wěn)定，特異性強，敏感性高結果判定簡單，能夠適當地排除一些交叉性的反應[10]。同時檢測IgM的敏感性相對較高，如果多次操作試管凝集試驗，血清中的蛋白持續(xù)上升，對診斷的意義重大。但該操作費時費力，操作煩瑣、耗時，且會因為布氏桿菌產生變異使得結果出現假陰性的情況，因此該方法并不適用于大規(guī)模的檢測[11]。

4.3 全乳環(huán)狀試驗

全乳環(huán)狀試驗（MRT）主要用于篩查泌乳期的動物布氏桿菌，當檢測出乳汁中含有布氏桿菌抗體時，會形成紫色的乳脂環(huán)，這種方法最大的優(yōu)點就是不僅可用于單個乳樣的檢測，更適用于大種群動物的混合乳樣[12]。在對泌乳牛大范圍篩查過程中，使用該方法不僅簡單快捷，而且成本低，可重復利用，節(jié)省人力物力，并且由于免采血的過程，不會對泌乳期的動物造成應激。但是該方法靈敏度較低，容易受乳品質影響，比如患有乳房疾病的奶牛、初乳、哺乳后期乳液等因素都會影響檢測結果，出現假陽性[13]。此外，脂肪凝集因子和乳中IgM、IgA濃度過低都會影響檢測結果，因此僅能當作初篩方法使用。MRT是WOAH推薦的用于奶牛布魯氏菌病篩查和檢測的方法之一，主要用于較大的規(guī)模化奶牛場進行布魯氏菌病的篩查，WOAH不建議該方法用于小型反芻動物乳汁中布氏桿菌的檢測。

4.4 補體結合試驗

補體結合試驗（CFT）是一種特異性很強的檢測IgM和IgG1抗體的試驗。然而，IgG2型抗體阻礙補體固定，導致假陰性結果。與IgM型抗體相比，CFT對IgG1型抗體的定量測量更多，因為失活過程導致IgM抗體的部分破壞。CFT被認為更適合布魯氏菌病的控制和監(jiān)測規(guī)劃。蔣卉等[14]參照常量法CFT的反應條件和判定標準，從反應時間、結果判定等各方面改進了國標mCFT標準，改進后的方法極大提升了mCFT的檢測效率，又達到了常量法的準確性，高于國標中mCFT與常量法89.24 %的符合率[5]。

4.5 熒光偏振試驗

熒光偏振試驗（FPA）是WOAH規(guī)定的檢測牛和豬布魯氏菌病的方法之一。該方法根據抗原抗體結合后體積變大，將熒光素附著在抗原或抗體，然后通過偏振光對結合物進行檢測最終進行判定的一種方法。該方法屬于同源分析，分析物無需分離，因而該方法簡便快捷。其診斷布病的敏感性與ELISA相近。通過將熒光素標記的小分子抗原加到待檢血清或其他可能存在抗體的液體中，若存在相應抗體，抗體與標記抗原結合后會降低轉速，通過儀器測量減速便可確定相應抗體的存在。FPA方法屬于同源性分析，無需將分離物分離，因而簡便快捷，是國際貿易指定試驗。FPA在某些發(fā)達國家已經大量應用，成為檢測動物布病快速、準確、高通量的新技術，也不會受到疫苗免疫的影響，主要用于動物群體布病的檢疫、篩查和凈化，但我國對該研究方法的研究起步較晚，進出口貿易中牛、羊布魯氏菌病FPA檢測方法均依賴于使用進口試劑盒。

4.6 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術（ICG）已被作為該病的一種初篩方法納入我國衛(wèi)生行業(yè)標準《布魯菌病診斷》（WS 269—2019）。該方法操作簡便、敏感性高，較適合基層獸醫(yī)現場檢測。使用該方法對布氏桿菌慢性感染者檢測效果不佳，但其對急性期的感染者的檢測效果明顯高于其他傳統(tǒng)的檢測方法，靈敏度甚至高于ELISA。郭健等[4]建立了動物布魯氏菌病和結核病的雙抗原夾心法膠體金檢測，用于臨床快速血清檢測，敏感性高，與其他病原無交叉反應。黃曉兵等、董浩等均對4種布魯氏菌病膠體金試紙條進行了比較研究，發(fā)現膠體金試紙條較虎紅平板凝集試驗敏感性更高，便于該病的早期診斷和篩查。

5 分子生物學診斷

5.1 ELISA

ELISA法檢測布魯氏菌抗原是培養(yǎng)技術的合適替代方法，根據一項研究，具有100 %的靈敏度和99.2 %的特異性。共凝集和抗原檢測方法被認為是布魯氏菌特異性抗原檢測的適當技術。據報道，ELISA （IgG+IgM）和布魯氏菌CAPT（免疫捕獲凝集）試驗對人類布魯氏菌病的診斷具有高度特異性。當傳統(tǒng)血清學試驗測試陰性時，特別推薦ELISA。并且這種方法可以用來大規(guī)模的布氏桿菌的篩選。韓國的Simborio等使用SAT陰性和陽性血清樣本，通過這種方法測定了重組蛋白B.abortus 在布氏桿菌中的檢測效果，聯合檢測了rOMP抗原的敏感性、特異性和準確性，均得到了較好的結果，這些組合為未來開發(fā)高效的布氏桿菌疫苗提供了強有力的依據。

5.2 普通PCR

常聚合酶鏈反應（PCR）是一種快速的診斷方法，甚至可以應用于質量差的樣品。這可以用于流行病學解釋和分析以及分子表征。許多序列已被認為是布魯氏菌屬特異性PCR檢測的目標，即Omp2和bcsp31，16SrRNA和16S-23s區(qū)域。PCR在診斷復發(fā)性布魯氏菌病、評估治療效果、鑒定和區(qū)分生物變體和生物型方面也被證明是有用的，快速、準確地診斷牛流產病例需要使用敏感、特異和可靠的診斷方法，相關研究者還設計了更準確的兩步PCR，用于從39例布魯氏菌病病例和25例對照病例中早期檢測布魯氏菌病，多序列比對（MSA）分析顯示，Omp2蛋白的N端區(qū)域與布氏桿菌基因組的高度保守區(qū)域相關。有研究表明PCR的敏感性較高，甚至能夠檢測到1 pb左右的布氏桿菌核酸。

5.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR（Real-Time PCR）包括染料結合法、水解探針法、熒光標記物引物、分子信標以及雜交探針五種方法，這些檢測方法都屬于分子生物學領域，最顯著的優(yōu)點就是簡便、快捷并無污染。隨著大量的研究者對布魯氏菌病領域的不斷探索與研究，這種方法與常規(guī)PCR相比較，已經表現出了靈敏度和特異度更好的優(yōu)勢，已經可以通過計算機數字化來將樣品的核酸定量。Real-Time PCR對早期以及慢性的布魯氏菌病感染的診斷特異性和敏感性可達100 %，可成為新的布魯氏菌病的診斷方法。Real-Time PCR具有高度特異性和敏感性，是目前核酸檢測技術確定樣品中DNA拷貝數最準確的方法，它克服了終點PCR在進入平臺期后進行定量帶來的誤差，實現了對DNA或RNA模板的精確定量，不用像普通PCR一樣進行凝膠電泳，縮短了檢測時間，也避免了因擴增產物帶來的污染，在2～3 h內便得到檢測結果。

5.4 微滴式數字聚合酶鏈式反應技術

微滴式數字聚合酶鏈式反應技術（ddPCR）是一種新一代的改良PCR技術。該方法的操作原理是利用微滴生成器，生成多個可以作為獨立進行反應單位的微滴，微滴或含將其擴增后，再將其產生的熒光信號值收集起來，最后通過陽性微滴個數比例來決定目的DNA分子，產生的結果并不會依賴于標準曲線。目前ddPCR技術在檢測各種微生物核酸中已有應用，在檢測低濃度DNA方面具有更高的靈敏度和準確性，在多個領域中證明其方法比實時熒光定量PCR具有更好的靈敏度與準確性。但是ddPCR方法仍然存在一些難以解決的問題，比如耗費時間過長、通量低以及單位時間內產效低等，不適宜大量檢測樣品。

5.5 環(huán)介導等溫核酸擴增

環(huán)介導等溫核酸擴增技術（LAMP）是Notom于2000年發(fā)明的一種擴增技術，該技術使用了DNA聚合酶和特殊引物進行高效擴增的方法，產生新的DNA。這種方法可以直接人工用肉眼來進行結果判定，不需要增加額外專用的擴增儀器來進行判定，極大地節(jié)約了成本及時間，只需4個引物、DNA聚合酶和常規(guī)實驗室水浴或熱塊即可進行反應。這種方法在等溫條件下擴增DNA時效率高、特異性強以及速度快的優(yōu)點，對于養(yǎng)殖場的布魯氏菌病的檢測以及基層疫病防疫有十分重要的意義。但是該方法的效率大小還會取決于產生的DNA的大小，當DNA大小超過500 bp時，該方法的擴增效果就會很差，并且該方法也無法對長片段的DNA進行擴增，也無法區(qū)分出異變出來的特殊DNA，所以受到污染時，容易造成假陽性的結果。于廣江等建立并優(yōu)化了LAMP快速檢測體系，通過倍比稀釋法等完成靈敏度和特異性實驗，在60 min內成功檢測到了目的基因，且無非特異性擴增，更重要的是減少了布魯氏菌以及核酸片段造成的環(huán)境生物污染。

6 結語

布魯氏菌病預防診斷主要是依賴于疾病的早期、準確和精確診斷。因此在牲畜和動物產品的地方、區(qū)域、國家和國際貿易及運輸過程中，應嚴格遵守各種法規(guī)和準則。此外，有效的動物布魯氏菌病控制系統(tǒng)取決于若干措施，包括確定受感染動物的強有力監(jiān)測機制，防止受感染動物和牛群向未受感染牛群傳播，清除布魯氏菌感染的宿主，采取預防措施阻止該疾病在畜群中再次引起。預防、控制和根除布魯氏菌病的最佳方法是對所有易感動物宿主進行疫苗接種，并在流行地區(qū)消滅患病動物。根據布魯氏菌病的易感—暴露—感染—恢復—易感（SEIRS）模型，觀察到在對牛羊接種疫苗后，在牛羊混合種農場消滅布魯氏菌病需要3.5年的時間，將疫苗限制在綿羊中導致其消除時間增加到16.8年。因此，動物布魯氏菌病疫苗在動物和人類疾病管理中起著至關重要的作用。

參考文獻：

葛宇婷，郭文潔.羊布魯氏菌病發(fā)生特點及防控建議[J].現代農村科技，2023（2）：66. [1]

馬帥，李金積，趙明，等.布魯氏菌病研究進展[J].中國動物檢疫，2020，37（7）：73-79. [2]

毛景東，王景龍，楊艷玲.布魯氏菌病的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011， 38（1）：222-227. [3]

吳宗豪.反芻動物布氏桿菌病的綜合防控措施[J].畜禽業(yè)，2023，34（1）：55-57. [4]

BAGHERI N R，KRECEK R C，et al.Brucellosis in the Middle East：Current situation and a pathway forward[J].PLoS neglected tropical diseases，2020，14（5）：e0008071. [5]

歐爾魯木加甫，哈西巴特.家畜布魯氏桿菌病的綜合防治[J].新疆畜牧業(yè)，2015（S1）：67-68. [6]

王智英.探討牛布氏桿菌病的臨床診斷[J].中獸醫(yī)學雜志，2023（5）：43-45. [7]

CIFTDOAN DILEK YIMAZ，ASLAN SELDA.Osteoarficular involvement of brucellosis in pediatric patients clinical and laboratory characteristics[J].The Turkish journal of pediatrics，2020，62（2）：199-207. [8]

李安娜，張桂珍，李鐵峰，等.影響布氏菌試管、平板凝集試驗質量控制因素的探討[J].中國地方病防治雜志，1994，9（5）：301-302. [9]

[10]SHOME R，NAGALINGAM M，SHOME B R，et al.Milk ring test from lab to field：A surveillance strategy for states under brucellosis control program.[J]，The Indian Journal of Animal Sciences，2015，85（10）：17-20.

[11]KOTHALAWALA KA，MAKITA K，KOTHALAWALA H，et al.Association of farmers’ socio-economics with bovine brucellosis epidemiology in the dry zone of Sri Lanka[J].Prev Vet Med，2017，147：117-123.

[12]楊本錄.牛羊布魯氏桿菌病診斷及綜合防治措施[J].中獸醫(yī)學雜志，2023（11）：46-48.

[13]張小梅，郭亞男，何生虎，等.牛羊布魯氏桿菌病診斷技術及養(yǎng)殖場生物安全體系研究進展[J].寧夏農林科技，2022，63（2）：42-47+62.

[14]蔣卉，馮宇，秦玉明，等.布魯氏菌病微量補體結合試驗的方法改進和應用[J].中國農業(yè)科學，2022，55（8）：1676-1684.