摘要：【目的】確定葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量最適的暗適應(yīng)時(shí)間、測量光強(qiáng)度，分析葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化特征并確定最適測量時(shí)間，提出優(yōu)化測量方法的建議，為進(jìn)一步研究葡萄光合特性提供理論依據(jù)，以提高研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性?！痉椒ā窟x擇陽光玫瑰葡萄和巨峰葡萄葉齡為40～50 d的健康成熟葉片，利用JIP測定（JIP-test）和主成分分析（PCA）研究葡萄葉片在不同暗適應(yīng)時(shí)間（5、10、15、20、25、30、35和40 min）、不同測量光強(qiáng)度［500、1000、1500、2000、2500、3000和3500μmol/（m2·s）］和一天中不同時(shí)間點(diǎn)（8：00、10：00、12：00、14：00、16：00、18：00和20：00）的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)（OJIP）曲線特征，分析不同測量條件對(duì)葡萄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。【結(jié)果】暗適應(yīng)時(shí)間和測量光強(qiáng)度均明顯影響葡萄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)，較長的暗適應(yīng)時(shí)間和較高的測量光強(qiáng)度能獲得更穩(wěn)定和可靠的測量結(jié)果。OJIP曲線特征顯示，在較短的暗適應(yīng)時(shí)間（5～15 min）內(nèi)，各暗適應(yīng)時(shí)間與暗適應(yīng)5 min間的特征區(qū)間（OJ相、JI相和IP相）相對(duì)可變熒光差值（ΔWOJ、ΔWJI和ΔWIP）曲線變化幅度較大，初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）和最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）等參數(shù)波動(dòng)較大，當(dāng)暗適應(yīng)時(shí)間達(dá)30 min以上時(shí)，各參數(shù)再無顯著變化（P>0.05，下同），趨于穩(wěn)定。隨著測量光強(qiáng)度的增加，F(xiàn)m、Fv/Fm、OJIP曲線的初始斜率（Mo）和單位面積反應(yīng)中心數(shù)量（RC/CSm）等參數(shù)呈上升趨勢，各測量光強(qiáng)度與500μmol/（m2·s）測量光強(qiáng)度間的ΔWOJ、ΔWJI和ΔWIP曲線呈正K峰、負(fù)H峰和正G峰，當(dāng)光強(qiáng)度達(dá)3000μmol/（m2·s）以上時(shí)，各參數(shù)均無顯著變化。葡萄葉片的多數(shù)葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨著一天中時(shí)間點(diǎn)的推移而變化，光系統(tǒng)II（PSII）光化學(xué)效率在12：00之前較高，14：00時(shí)光化學(xué)效率下降，16：00之后PSII逐漸恢復(fù)至最佳狀態(tài)。【結(jié)論】針對(duì)葡萄葉片進(jìn)行OJIP曲線測定時(shí)，暗適應(yīng)時(shí)間應(yīng)為30 min以上，最小測量光強(qiáng)度為3000μmol/（m2·s），測量時(shí)間宜選擇在12：00之前和16：00之后，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

關(guān)鍵詞：葡萄葉綠素?zé)晒?；OJIP曲線；暗適應(yīng)時(shí)間；測量光強(qiáng)度；日變化特征

中圖分類號(hào)：S663.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）08-2248-14

Optimization of measurement methods for chlorophyllfluorescence parameters and analysis of diurnal variationcharacteristics in grape leaves

CAO Xiong-jun HAN Jia-yu XIE Shu-yu HUANG Qiu-mi DENG Hai-yan PAN Feng-ping WANG Bo3，JIANG Chun-fen SHI Xiao-fang BAI Xian-jin1*

（1Grape and Wine Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China；2Horticultural Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China；3College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】To determine the optimal dark adaptation duration and measurement light intensity for asses-sing chlorophyll fluorescence parameters in grape leaves，and to analyze the diurnal variation characteristicss of these pa-rameters.This study aimed to provide recommendations for optimizing measurement protocols，thereby offering theoreti-cal reference for further research into grape photosynthetic characteristics and enhancing the accuracy and reliability of ex-perimental data.【Method】Healthy，mature leaves of Shine Muscat and Kyoho grape varieties aged 40-50 d were selected.The JIP-test and principal component analysis（PCA）were utilized to investigate the rapid chlorophyll fluorescence induc-tion kinetics（OJIP）curves under different dark adaptation durations（5，10，15，20，25，30，35 and 40 min），various measurement light intensities［500，1000，1500，2000，2500，3000 and 3500μmol/（m2·s）］，and at different timesthroughout the day（8：00，10：00，12：00，14：00，16：00，18：00 and 20：00）.The influence of these experimental condi-tions on the chlorophyll fluorescence parameters was evaluated.【Result】Dark adaptation duration and measurement lightintensity greatly influenced the chlorophyll fluorescence parameters of grape leaves.Extended dark adaptation durations and increased measurement light intensities resulted in more stable and reliable fluorescence parameter measurements.OJIP curve characteristics indicated that under short dark adaptations（5-15 min），the characteristic interval（OJ phase，JI phase and IP phase）relatively variable fluorescence difference（ΔWOJ，ΔWJI andΔWIP）curves between each dark adapta-tion duration and dark adaptation 5 min had a large variation，parameters such as initial fluorescence（Fo），maximumfluorescence（Fm）and maximum photochemical efficiency（Fv/Fm）fluctuated greatly.When dark adaptation exceeded 30 min，the parameters had no significant difference（P>0.05，the same below），and tended to be stablized.With increasing measurement light intensity，F(xiàn)m，F(xiàn)v/Fm the initial slope of OJIP curves（Mo），and number of reaction centers per unit area（RC/CSm）showed an upward trend，and theΔWOJ，ΔWJI andΔWIP curves between each measured light intensity and the measured light intensity at 500μmol/（m2·s）showed positive K peaks，negative H peaks and positive G peaks.Once thelight intensity exceeded 3000μmol/（m2·s），no further significant changes in fluorescence parameters were observed.Most chlorophyll fluorescence parameters of grape leaves changed with diurnal variations of times，with higher photosys-tem II（PSII）photochemical efficiency before 12：00，a decline at 14：00，and a gradual recovery of PSII to optimal le-vels after 16：00.【Conclusion】For accurate OJIP curve measurements of grape leaves，a dark adaptation duration of atleast 30 min and a minimum measurement light intensity of 3000μmol/（m2·s）are recommended.Optimal measurementtimes are before 12：00 and after 16：00 to ensure the accuracy and reliability of the results.

Key words：grape chlorophyll fluorescence；OJIP curve；dark adaptation duration；measuring light intensity；diur-nal variation characteristics

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（U21A20227）；Guangxi Natural Science Founda-tion（2022GXNSFAA035540）；Science and Technology Development Project of Guangxi Academy of Agricultural Scien-ces（Guinongke 2023JZ11）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021 YT126）

0引言

【研究意義】快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)（OJIP）曲線是一種廣泛應(yīng)用于植物生理生態(tài)研究的工具，主要用于評(píng)估植物光合作用效率和生理狀態(tài)。該方法因簡便、快速且具有非破壞性，被廣泛應(yīng)用于植物光合作用研究（李鵬民等，2005；Liu et al.，2020；Swoczynaetal.，2022）。通過測量葉綠素?zé)晒鈪?shù)，可獲得植物光系統(tǒng)的狀態(tài)信息，從而深入了解植物光合性能及其對(duì)逆境的響應(yīng)機(jī)制（林榮呈等，2021；楊文強(qiáng)等，2024；Pessarakli，2024）。然而，葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性受多種因素影響，包括暗適應(yīng)時(shí)間、測量光強(qiáng)度和測量時(shí)間點(diǎn)的選擇（Kalajietal.，2016；Lysenko et al.，2022）。合理優(yōu)化上述測量條件能提高測量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，為植物光合作用研究提供更可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葡萄（Vitis vinifera L.）的生長發(fā)育受多種生理和環(huán)境因素調(diào)控（Palliotti and Poni，2015；Liu et al.，2019；徐文清等，2023），其中光合作用是決定葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵生理過程（謝計(jì)蒙等，2012；Naulleauetal.，2021；曹雄軍等，2023；Zhou et al.，2024）。葉綠素?zé)晒鉁y量技術(shù)通過測定葉片對(duì)激發(fā)光的熒光響應(yīng)，反映光系統(tǒng)II（PSII）的功能狀態(tài)（Goltsev et al.，2016；Kalaji et al.，2017；Pessarakli，2024）。OJIP曲線是一種標(biāo)準(zhǔn)的熒光測量方法，JIP測定（JIP-test）是建立在生物膜能量流動(dòng)理論基礎(chǔ)上針對(duì)OJIP曲線的數(shù)據(jù)分析和處理方法，通過測量葉片在暗適應(yīng)后受到強(qiáng)光照射時(shí)的熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，采用JIP測定分析熒光誘導(dǎo)曲線O、J、I和P階段的相位，能提供關(guān)于PSII反應(yīng)中心和電子傳遞鏈的信息（Strasser，1981；Strasser and Strasser，1995）。葉綠素?zé)晒鈪?shù)是評(píng)估植物光合作用效率及其對(duì)環(huán)境壓力響應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)。研究表明，不同的環(huán)境應(yīng)激條件，如光照強(qiáng)度、溫度變化等，對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)有顯著影響（Kalaji et al.，2017；Pessarakli，2024）。葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測量通常需要在暗適應(yīng)條件下進(jìn)行，暗適應(yīng)時(shí)間是影響葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素之一（Murchie and Lawson，2013；Kalaji et al.，2018）。暗適應(yīng)需要在測量前將植物樣品置于黑暗中，以使光合色素完全恢復(fù)至原始狀態(tài)。如果暗適應(yīng)時(shí)間不足，PSII反應(yīng)中心可能未能完全恢復(fù)至原始狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致曲線中O、J、I和P階段的特征不完整或有偏差，影響對(duì)光合性能的準(zhǔn)確評(píng)估，使得對(duì)光合效率和光抑制的分析變得困難。而過長的暗適應(yīng)時(shí)間增加了試驗(yàn)總時(shí)間，可能使試驗(yàn)過程過于冗長，且過長的暗適應(yīng)時(shí)間可能會(huì)引發(fā)植物樣品的生理變化，從而影響最終測量結(jié)果。測量光強(qiáng)度的選擇對(duì)OJIP曲線的測量結(jié)果也有顯著影響（Gaevskii et al.，2000；Janeeshma et al.，2022；Su et al.，2024）。OJIP曲線是利用光合色素?zé)晒鈦碓u(píng)估光合作用效率的工具，測量光強(qiáng)度會(huì)直接影響曲線的形態(tài)和數(shù)據(jù)的解析。光強(qiáng)度不足可能無法完全激發(fā)PSII反應(yīng)中心的電子傳遞，導(dǎo)致OJIP曲線的峰值和變化不明顯，曲線的動(dòng)態(tài)范圍較小，難以準(zhǔn)確捕捉光合作用的完整特征，使數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性下降。而使用過高的測量光強(qiáng)度可能會(huì)出現(xiàn)過度的熒光淬滅或信號(hào)飽和，導(dǎo)致光抑制或光損傷，使得電子傳遞鏈的負(fù)荷過重，對(duì)光合反應(yīng)中心造成負(fù)面影響，從而影響OJIP曲線的動(dòng)態(tài)特征。為獲得準(zhǔn)確的OJIP曲線，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娘柡凸鈴?qiáng)度，以確保能激發(fā)PSII反應(yīng)中心的電子傳遞，同時(shí)避免光抑制和熒光信號(hào)飽和。試驗(yàn)設(shè)計(jì)需要根據(jù)研究目標(biāo)和植物特性選擇合理的暗適應(yīng)時(shí)間和測量光強(qiáng)度范圍，以確保獲得可靠的數(shù)據(jù)。此外，受光照強(qiáng)度、溫度、濕度和其他環(huán)境因素變化的影響，植物光合作用具有明顯的日變化特征，不同時(shí)間點(diǎn)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)可能存在顯著差異（Li and Chen，2009；Campbell et al.，2019）。測量時(shí)間點(diǎn)的選擇對(duì)于光合作用相關(guān)研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)至關(guān)重要，分析植物樣品在一天中不同時(shí)間點(diǎn)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化可幫助確定最佳的測量時(shí)間點(diǎn)，從而提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性（Kalajietal.，2017；Pessarakli，2024）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)受光合作用影響，開展其光合作用研究需要對(duì)葡萄OJIP曲線測量方法進(jìn)行優(yōu)化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究不同暗適應(yīng)時(shí)間、測量光強(qiáng)度對(duì)葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，分析葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化特征，確定最適的暗適應(yīng)時(shí)間、測量光強(qiáng)度和測量時(shí)間點(diǎn)，提出優(yōu)化測量方法的建議，為進(jìn)一步研究葡萄光合特性提供理論依據(jù)，以提高研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地點(diǎn)為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所一年兩收葡萄示范基地（22°51′19″N，108°14′46″E）。供試葡萄品種為歐美雜種陽光玫瑰和巨峰，其中陽光玫瑰葡萄樹齡為5年，巨峰葡萄樹齡為20年，均采用一年兩收避雨栽培模式管理。選擇葉齡為40～50 d的成熟健康葉片進(jìn)行標(biāo)記，2個(gè)品種各30～40片，標(biāo)記的成熟葉片均位于新梢果實(shí)節(jié)位。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1暗適應(yīng)時(shí)間測定分析設(shè)8組不同的暗適應(yīng)時(shí)間處理，分別為5、10、15、20、25、30、35和40 min。在標(biāo)記的葉片樣本上放置專用葉夾暗適應(yīng)5min后，使用Handy PEA+植物效率分析儀（英國Hansatech Instruments公司）進(jìn)行OJIP曲線測量，測量光強(qiáng)度為3000μmol/（m2·s），測量時(shí)長為2 s，打開葉夾進(jìn)行10 min陽光照射后，關(guān)閉葉夾暗適應(yīng)10min，以相同測量光強(qiáng)度和測量時(shí)長再次進(jìn)行OJIP曲線測量，重復(fù)此過程，每次將暗適應(yīng)時(shí)間增加5 min，直至暗適應(yīng)時(shí)間為40min。每組處理每個(gè)品種測量標(biāo)記的葉片30片，每組處理共測量60次。所有測量均在QF4b0Bu2xiP0wOR3s1Gw/dlok9tjiA7Nt+tUJbVnLoA=12：00前完成，測量過程不破壞植物組織。

1.2.2測量光強(qiáng)度測定分析設(shè)7組不同的測量光強(qiáng)度處理，分別為500、1000、1500、2000、2500、3000和3500μmol/（m2·s）。在標(biāo)記的葉片樣本上放置專用葉夾暗適應(yīng)30min后，使用植物效率分析儀進(jìn)行OJIP曲線測量，設(shè)定光強(qiáng)度為500μmol/（m2·s），測量時(shí)長為2 s，測量后同樣暗適應(yīng)30 min，再次進(jìn)行OJIP曲線測量，設(shè)定光強(qiáng)度為1000μmol/（m2·s），測量時(shí)長為2 s，重復(fù)此過程，每次將測量光強(qiáng)度增加500μmol/（m2·s），直至其為3500μmol/（m2·s）。每組處理每個(gè)品種測量標(biāo)記的葉片30片，每組處理共測量60次。所有測量均在12：00前完成，測量過程不破壞植物組織。

1.2.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化特征分析選擇晴天進(jìn)行試驗(yàn)，分別于8：00、10：00、12：00、14：00、16：00、18：00和20：00測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，使用優(yōu)化后的測量方法進(jìn)行OJIP曲線測量，測量前，標(biāo)記葉片使用專用葉夾在同一位置暗適應(yīng)30 min，設(shè)定測量光強(qiáng)度為3000μmol/（m2·s），測量時(shí)長為2 s。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量每個(gè)品種標(biāo)記的葉片30片，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共測量60次。測量過程不破壞植物組織。

1.2.4 OJIP曲線的JIP測定分析OJIP曲線在熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化時(shí)出現(xiàn)明顯的特征點(diǎn)，即起始點(diǎn)（O）、初期上升點(diǎn)（J）、中期上升點(diǎn)（I）和峰值點(diǎn)（P）。上述特征點(diǎn)代表光合作用過程中不同的狀態(tài)，OJIP曲線中蘊(yùn)藏著豐富的信息，其形態(tài)的變化反映光合機(jī)構(gòu)的功能和狀態(tài)發(fā)生的變化。通過JIP測定可對(duì)OJIP曲線變化進(jìn)行定量分析（Kalajietal.，2018；Pes-sarakli，2024），具體計(jì)算公式和參數(shù)含義參照Golt-sev等（2016）的研究，見表1。

相對(duì)可變熒光差值（ΔVt）曲線，以及OJIP曲線4個(gè)特征區(qū)間（OK相、OJ相、JI相和IP相）的雙歸一化相對(duì)可變熒光差值（ΔWOK、ΔWOJ、ΔWJI和ΔWIP）曲線可用于比較分析不同處理葉片的熒光特性，差值曲線的計(jì)算參照Kalaji等（2018）的方法，ΔVt=Vt（處理）-Vt（對(duì)照）；ΔWOK=WOK（處理）-WOK（對(duì)照），ΔWOJ=WOJ（處理）-WOJ（對(duì)照），ΔWJI=WJI（處理）-WJI（對(duì)照），ΔWIP=WIP（處理）-WIP（對(duì)照）；暗適應(yīng)時(shí)間測定分析以暗適應(yīng)5min為對(duì)照，測量光強(qiáng)度測定分析以測量光強(qiáng)度500μmol/（m2·s）為對(duì)照，葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化特征分析以8：00為對(duì)照。

ΔWOK（L峰，L-band）反映了PSII單元間的連通性和能量傳遞能力，正L峰表示PSII單元間的連通性減小，可能是由于PSII反應(yīng)中心的數(shù)量減少或能量傳遞效率降低，導(dǎo)致光能的捕獲和轉(zhuǎn)化效率降低；負(fù)L峰則表示PSII單元間的連通性增加，可能是由于PSII反應(yīng)中心的數(shù)量增加或能量傳遞效率提高，從而使光能的捕獲和轉(zhuǎn)化效率提高（Kalaji et al.，2018；Dimitrova et al.，2020；Zagorchevetal.，2020）。ΔWOJ（K峰，K-band）反映了PSII供體側(cè)的放氧復(fù)合體（OEC）狀態(tài)，正K峰表示供體側(cè)的電子傳遞速率較慢，表明OEC受損及電子供給和進(jìn)一步將電子轉(zhuǎn)移到醌受體QA間的不平衡；負(fù)K峰則表示供體側(cè)的電子傳遞速率增加或受體側(cè)的電子流出速率減少。ΔWJI（H峰，H-band）反映了2個(gè)光系統(tǒng)間質(zhì)體醌（PQ）池還原的動(dòng)態(tài)，與PQ池的大?。ɑ钴S的PQ分子數(shù)量）及其還原程度密切相關(guān)，正H峰意味著PSII反應(yīng)中心能提供給PQ池的電子數(shù)量減少，PQ池相對(duì)變??；而負(fù)H峰則表示PSII反應(yīng)中心能提供給PQ池的電子數(shù)量增加，PQ池相對(duì)變大。ΔWIP（G峰，G-band）反映的是光系統(tǒng)I（PSI）受體側(cè)的還原情況，即電子從PQ池傳遞到PSI受體側(cè)的過程，當(dāng)G峰為正時(shí)，表示PSI受體側(cè)的電子傳遞受阻或減慢，從PSI受體側(cè)的電子流出速率增加，PSI受體側(cè)的電子接受池相對(duì)變??；相反，如果G峰為負(fù)時(shí)，表示供體側(cè)的電子傳遞速率增加，從PSI受體側(cè)的電子流出速率減少，PSI受體側(cè)的電子接受池相對(duì)較大（Dimitrova et al.，2020；Zagorchevetal.，2020）。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較不同處理間葉綠素?zé)晒鈪?shù)的差異。采用主成分分析（PCA）對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，探究不同試驗(yàn)條件下葉綠素?zé)晒鈪?shù)的主要變化趨勢并篩選代表性參數(shù)。使用Origin 2021繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1不同暗適應(yīng)時(shí)間下葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化趨勢

對(duì)不同暗適應(yīng)時(shí)間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行PCA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各暗適應(yīng)時(shí)間下的葉綠素?zé)晒鈪?shù)聚類分布存在明顯差異（圖1）。暗適應(yīng)時(shí)間達(dá)20 min以上時(shí)，數(shù)據(jù)點(diǎn)聚集性較好，表明較長時(shí)間的暗適應(yīng)有助于獲得更加穩(wěn)定和可靠的測量結(jié)果。在PCA中，聚集在一起的參數(shù)可能存在相關(guān)性，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、φPo等聚集在一起，表明這些參數(shù)在不同暗適應(yīng)時(shí)間下的變化趨勢相似。

根據(jù)PCA結(jié)果，選擇10個(gè)具有代表性的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)一步分析，包括Fo、Fm、Fv/Fm、PIABS、Fo/Fm、Mo、RC/CSm、REo/CSm、DIo/RC和Sm（圖2）。這些參數(shù)的變化趨勢表明暗適應(yīng)時(shí)間對(duì)PSII的各項(xiàng)參數(shù)均有明顯影響。Fo和REo/CSm在暗適應(yīng)15 min后再無顯著變化（P>0.05，下同），趨于穩(wěn)定；Fm、Mo、RC/CSm和DIo/RC在暗適應(yīng)時(shí)間達(dá)20 min后趨于穩(wěn)定；Fv/Fm、Fo/Fm和PIABS在暗適應(yīng)25 min后趨于穩(wěn)定；Sm在暗適應(yīng)30 min后均趨于穩(wěn)定，上述結(jié)果反映了PSII在不同暗適應(yīng)時(shí)間下的性能變化。

不同暗適應(yīng)時(shí)間的OJIP曲線特征反映葡萄葉片在不同暗適應(yīng)時(shí)間下的熒光響應(yīng)（圖3）。如圖3-B所示，以暗適應(yīng)5 min為對(duì)照，隨著暗適應(yīng)時(shí)間的延長，能明顯觀察到ΔVt曲線中的ΔJ負(fù)峰和ΔH、ΔG正峰，ΔJ負(fù)峰表示PQ池的還原速度較慢，ΔH正峰表示PQ池的相對(duì)大小減小，ΔG正峰表示PSI受體側(cè)的電子傳遞受阻或減慢。

如圖3-C所示，不同的暗適應(yīng)時(shí)間下ΔWOK區(qū)別不大，表明不同的暗適應(yīng)時(shí)間不會(huì)影響PSII單元間連通的穩(wěn)定性，暗適應(yīng)時(shí)間的長短不會(huì)對(duì)PSII反應(yīng)中心間的能量傳遞能力產(chǎn)生明顯影響。ΔWOJ曲線如圖3-D所示，在較短的暗適應(yīng)時(shí)間（5～15 min）內(nèi)，供體側(cè)的電子傳遞速率較慢，但暗適應(yīng)時(shí)間增加至20 min以上時(shí)，供體側(cè)的電子傳遞速率增加，且熒光變化趨于平穩(wěn)。ΔWJI曲線如圖3-E所示，當(dāng)暗適應(yīng)時(shí)間在5～25 min內(nèi)，隨著暗適應(yīng)時(shí)間的延長，PQ池相對(duì)大小越來越小，即PSII反應(yīng)中心能提供給PQ池的電子數(shù)量減少，當(dāng)暗適應(yīng)時(shí)間為30～40 min時(shí)，PQ池的相對(duì)大小趨于穩(wěn)定，可能此時(shí)PSII反應(yīng)中心幾乎沒有電子提供給PQ池。ΔWIP曲線如圖3-F所示，在5～30 min的暗適應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著暗適應(yīng)時(shí)間的延長，PSI受體側(cè)的電子接受池相對(duì)大小越來越小，即電子從PSII通過PQ池傳遞到PSI的速率越來越慢，當(dāng)暗適應(yīng)時(shí)長為35～40 min時(shí)，PSI受體側(cè)的電子接受池的相對(duì)大小不再發(fā)生明顯變化，達(dá)到一個(gè)新的穩(wěn)態(tài)，此時(shí)PSII反應(yīng)中心可能已完全處于開放狀態(tài)，幾乎沒有電子傳遞到PSI受體側(cè)。

綜上所述，暗適應(yīng)5～15 min時(shí)，各葉綠素?zé)晒鈪?shù)波動(dòng)較大，ΔWOJ、ΔWJI和ΔWIP曲線變化幅度較大。隨著暗適應(yīng)時(shí)間延長，各參數(shù)波動(dòng)減少，開始趨于穩(wěn)定。當(dāng)暗適應(yīng)時(shí)間延長至30 min時(shí)，各參數(shù)變化幅度較小，表明此時(shí)葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)已達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)一步延長暗適應(yīng)時(shí)間至40min，各參數(shù)變化不顯著。因此，測定葡萄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的暗適應(yīng)時(shí)間應(yīng)為30 min以上，以確保各參數(shù)的穩(wěn)定性和一致性。

2.2不同測量光強(qiáng)度下葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化趨勢

不同測量光強(qiáng)度下葉綠素?zé)晒鈪?shù)的PCA結(jié)果如圖4所示，隨著測量光強(qiáng)度的變化，葉綠素?zé)晒鈪?shù)存在明顯差異。在低光強(qiáng)度下，數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布相對(duì)分散，而在高光強(qiáng)度下，數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布相對(duì)集中，表明測量光強(qiáng)度達(dá)到一定水平后，葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化才趨于一致。

根據(jù)PCA結(jié)果選擇10個(gè)代表性葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)一步分析，包括Fm、Fv/Fm、PIABS、PICSm、Fo/Fm、Mo、REo/RC、RC/CSm、δRo和Sm/tFm（圖5），上述參數(shù)主要反映PSII在不同光強(qiáng)度下的性能和效率。Fm、Fv/Fm、Mo和RC/CSm隨著測量光強(qiáng)度增加整體呈上升趨勢，當(dāng)光強(qiáng)度達(dá)2000μmol/（m2·s）后，F(xiàn)v/Fm再無顯著變化，而Fm、Mo和RC/CSm則在光強(qiáng)度達(dá)3000μmol/（m2·s）時(shí)才趨于穩(wěn)定。Fo/Fm、PIABS、PICSm和δRo隨著光強(qiáng)度增加整體呈下降趨勢，F(xiàn)o/Fm在光強(qiáng)度達(dá)2000μmol/（m2·s）后趨于穩(wěn)定，PIABS、PICSm和δRo在光強(qiáng)度達(dá)2500μmol/（m2·s）后測量數(shù)據(jù)無顯著差異。隨著光強(qiáng)度增加，REo/RC和Sm/tFm下降后又上升，且REo/RC和Sm/tFm在測量光強(qiáng)達(dá)2500μmol/（m2·s）后再無顯著變化。上述參數(shù)的變化趨勢表明，在不同測量光強(qiáng)度下，葡萄PSII的性能和效率有所不同，但在3000μmol/（m2·s）以上的測量光強(qiáng)度下，其性能和效率均趨于穩(wěn)定。

不同測量光強(qiáng)度下的OJIP曲線特征表明測量光強(qiáng)度對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)有明顯影響（圖6）。當(dāng)測量光強(qiáng)度從500μmol/（m2·s）增加至3000μmol/（m2·s）時(shí)，OJIP曲線的熒光強(qiáng)度逐漸增加（圖6-A），當(dāng)測量光強(qiáng)度超過3000μmol/（m2·s）時(shí)，熒光強(qiáng)度再無明顯變化。以測量光強(qiáng)度500μmol/（m2·s）為對(duì)照，可觀察到其他測量光強(qiáng)度的ΔWOJ（圖6-D）、ΔWJI（圖6-E）和ΔWIP曲線（圖6-F）呈正K峰、負(fù)H峰和正G峰，但ΔWOK變化幅度很?。▓D6-C），表明本研究設(shè)定的測量光強(qiáng)度基本不影響PSII單元間連通的穩(wěn)定性，隨著測量光強(qiáng)度的增強(qiáng)，PSII反應(yīng)中心能提供給PQ池的電子數(shù)量逐漸增加，PQ池相對(duì)變大，PSI受體側(cè)的電子流出速率逐漸增加，但供體側(cè)的電子傳遞速率逐漸減慢，意味著隨著測量光強(qiáng)度的增強(qiáng)，光系統(tǒng)間的電子傳遞效率逐漸增加，光合作用效率逐漸提高。當(dāng)測量光強(qiáng)度達(dá)3000μmol/（m2·s）以上時(shí)，ΔWOJ、ΔWJI和ΔWIP曲線振幅再無明顯變化，說明此時(shí)PSII光合作用效率達(dá)最大值，光合系統(tǒng)達(dá)到一個(gè)新的穩(wěn)定狀態(tài)。

因此，針對(duì)葡萄葉片測量OJIP曲線時(shí)，合理的最小測量光強(qiáng)度應(yīng)選擇3000μmol/（m2·s），此時(shí)各參數(shù)不再發(fā)生明顯變化，PSII性能和效率保持穩(wěn)定，能真實(shí)反映植物的光合狀態(tài)，而測量光強(qiáng)度小于3000μmol/（m2·s）時(shí)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化較大，會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)誤差較大。

2.3葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的日變化特征

采用30 min暗適應(yīng)時(shí)間和3000μmol/（m2·s）光強(qiáng)度測量一天中不同時(shí)間點(diǎn)（8：00、10：00、12：00、14：00、16：00、18：00、20：00）OJIP曲線。PCA結(jié)果（圖3-A）表明，8：00和20：00的數(shù)據(jù)點(diǎn)相對(duì)靠近，而12：00和14：00的數(shù)據(jù)點(diǎn)則更分散，意味著葉綠素?zé)晒鈪?shù)在一天中存在明顯變化。

通過PCA選擇10個(gè)代表性葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)一步分析，包括Fo、Fm、Fv/Fm、PIABS、Fo/Fm、Wk、REo/CSm、RC/CSm、φRo和Sm（圖8）。Fo和Fm在8：00—16：00各時(shí)間點(diǎn)間均無顯著差異，但14：00時(shí)，F(xiàn)o略升高，F(xiàn)m略下降，導(dǎo)致Fo/Fm比值升高，可能與PSII受強(qiáng)光脅迫時(shí)發(fā)生光抑制現(xiàn)象有關(guān)。而PIABS從早至晚變化不大，各時(shí)間點(diǎn)間均無顯著差異，表明葡萄葉片在一天中的PSII整體光合性能相對(duì)穩(wěn)定。Fv/Fm、RC/CSm和Sm隨著一天中時(shí)間點(diǎn)的推移整體呈先下降后上升的變化趨勢，數(shù)值在早上較高，隨后開始下降，至14：00達(dá)到最低值，之后開始上升，晚上數(shù)值較高。Fv/Fm、RC/CSm和Sm的下降共同反映了葡萄在PSII功能、光合反應(yīng)中心數(shù)量和能量分布方面發(fā)生了不利變化，光合作用效率降低，可能是光抑制或環(huán)境脅迫導(dǎo)致。表明在14：00，PSII的最大光化學(xué)效率、反應(yīng)中心數(shù)量等低于其他時(shí)間點(diǎn)。Fo/Fm、Wk、REo/CSm和φRo則隨著一天中時(shí)間點(diǎn)的推移整體呈先上升后下降的變化趨勢，早上的數(shù)值較低，隨后開始上升，至14：00達(dá)最大值（除REo/CSm在12：00達(dá)最大值），之后開始下降，晚上的數(shù)值較低。這些參數(shù)的升高表明葡萄光合作用的增強(qiáng)，反映出PSII在光能捕獲、電子GFMi0J5Xy7tW0WJOHZRRO8yA/5ZGcjIvIHBka4giCjA=傳遞和光化學(xué)反應(yīng)等方面的性能得到改善，可能是由于光照強(qiáng)度增加，使更多光能被吸收和轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。然而，在高溫和強(qiáng)光條件下，Wk的上升表明OEC受到了潛在損傷或光抑制現(xiàn)象的發(fā)生，這反映了葡萄PSII在高溫和強(qiáng)光條件下的應(yīng)激狀態(tài)，隨著應(yīng)激的加劇，PSII的光化學(xué)效率降低。

不同時(shí)間點(diǎn)的OJIP曲線特征反映葡萄葉片在一天中的熒光響應(yīng)（圖9）。OJIP曲線表明，葡萄在8：00的熒光強(qiáng)度較高，之后熒光強(qiáng)度逐漸降低，14：00降至最低值，然后逐漸上升，至20：00達(dá)最大值（圖9-A），表明PSII的活性在中午光照最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)有所降低。

以8：00測量的結(jié)果為對(duì)照，能明顯觀察到其他時(shí)間點(diǎn)的ΔWOK（圖9-C）、ΔWOJ（圖9-D）、ΔWJI（圖9-E）和ΔWIP曲線（圖9-F）呈正L峰、正K峰、正H峰和正G峰，表明從8：00開始，PSII單元間的連通性和能量交換效率逐漸降低，供體側(cè)的電子傳遞速率逐漸下降，PSII反應(yīng)中心提供給PQ池的電子數(shù)量逐漸減少，PQ池相對(duì)大小也逐漸變小，電子從PSII通過PQ池傳遞到PSI的速率逐漸減慢，至14：00后，PSII單元間的連通性和能量交換效率逐漸升高，供體側(cè)的電子傳遞速率逐漸上升，PSII反應(yīng)中心提供給PQ池的電子數(shù)量逐漸增加，PQ池相對(duì)大小也逐漸變大，電子從PSII通過PQ池傳遞到PSI的速率逐漸加快，推測與外界光照強(qiáng)弱和溫度高低變化有關(guān)。

因此，OJIP曲線和參數(shù)的日變化趨勢反映了葡萄葉片在一天中的光合作用變化，12：00之前，葡萄處于活躍狀態(tài)，PSII光化學(xué)效率較高；14：00時(shí)，PSII光化學(xué)效率下降，光系統(tǒng)可能受到潛在損傷或光抑制現(xiàn)象開始顯現(xiàn)；16：00之后，PSII逐漸恢復(fù)至最佳狀態(tài)，效率回升。

3討論

3.1暗適應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

暗適應(yīng)對(duì)于分析Fv/Fm和非光化學(xué)淬滅（NPQ）至關(guān)重要（Murchie and Lawson，2013）。暗適應(yīng)可消除NPQ和其他干擾因素，使PSII達(dá)到完全氧化狀態(tài)，暗適應(yīng)時(shí)間通常設(shè)為20～30 min，以確保所有快速和慢速的NPQ成分完全消失。通過暗適應(yīng)，可獲得準(zhǔn)確的Fo和Fm，從而準(zhǔn)確評(píng)估Fv/Fm，對(duì)確保測量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。

本研究結(jié)果表明，暗適應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)有明顯影響，較長時(shí)間的暗適應(yīng)有助于獲得更加穩(wěn)定可靠的測量結(jié)果。Fo和REo/CSm在暗適應(yīng)15 min后趨于穩(wěn)定；Fm、Mo、RC/CSm和DIo/RC在暗適應(yīng)20 min后趨于穩(wěn)定；Fv/Fm、Fo/Fm和PIABS在暗適應(yīng)25 min后趨于穩(wěn)定；Sm在暗適應(yīng)30min后趨于穩(wěn)定。因此，測定葡萄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的暗適應(yīng)時(shí)間應(yīng)在30min以上，以確保各參數(shù)的穩(wěn)定性和一致性。

3.2測量光強(qiáng)度對(duì)葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

光強(qiáng)度對(duì)光合作用速率影響較大（Wang et al.，2017；Janeeshma et al.，2022；Su et al.，2024）。選擇合適的測量光強(qiáng)度，尤其是最小飽和光強(qiáng)度，對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估植物光合效率至關(guān)重要。光強(qiáng)度在初期會(huì)提升光合效率，直至光飽和點(diǎn)，此時(shí)光系統(tǒng)的電子傳遞速率和最大量子產(chǎn)率達(dá)到頂峰；最小飽和光強(qiáng)度是指光合作用速率不再顯著增加的最低光強(qiáng)度。在測量光合效率時(shí)，采用合適的飽和光強(qiáng)度不僅能確保光合作用速率的最大化，還能避免低光強(qiáng)度導(dǎo)致的低估和高光強(qiáng)度引發(fā)的光抑制及熒光淬滅現(xiàn)象，從而防止試驗(yàn)結(jié)果失真（Li et al.，2023；Longoni et al.，2023）。因此，選擇適當(dāng)?shù)墓鈴?qiáng)度是確保光合效率測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確和可靠的關(guān)鍵（Kalajietal.，2017；Pessara-kli，2024）。

本研究結(jié)果表明，不同測量光強(qiáng)度下葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生明顯變化，高光強(qiáng)度能獲得更穩(wěn)定的測量結(jié)果。Fv/Fm和Fo/Fm在光強(qiáng)度達(dá)2000μmol/（m2·s）后再無顯著變化，PIABS和REo/RC等參數(shù)在光強(qiáng)度達(dá)2500μmol/（m2·s）時(shí)趨于穩(wěn)定，光強(qiáng)度達(dá)3000μmol/（m2·s）時(shí)，各參數(shù)均無顯著變化。因此，測量葡萄葉片OJIP曲線的最小測量光強(qiáng)度為3000μmol/（m2·s）。在實(shí)際測量中，還應(yīng)根據(jù)具體的試驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)臏y量光強(qiáng)度，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

3.3測量時(shí)間點(diǎn)對(duì)葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

選擇合適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y量對(duì)光合作用研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)至關(guān)重要。了解葡萄在一天中不同時(shí)間點(diǎn)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化有助于確定最適合的測量時(shí)間點(diǎn)，從而提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究結(jié)果表明，葡萄葉片的多數(shù)葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨著一天中時(shí)間點(diǎn)的推移而變化。PCA結(jié)果表明，8：00和20：00葉綠素?zé)晒鈪?shù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)靠近，而12：00和14：00的數(shù)據(jù)點(diǎn)分散。隨著一天中時(shí)間點(diǎn)的推移，F(xiàn)v/Fm、RC/CSm和Sm整體呈先下降后上升的變化趨勢，F(xiàn)o/Fm、Wk、REo/CSm和φRo整體呈先上升后下降的變化趨勢，而Fo、Fm、PIABS變化不大，但Fo在14：00時(shí)略升高，F(xiàn)m略下降，說明14：00時(shí)PSII效率下降，而早晚的PSII效率較高。

葡萄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的日變化特征與環(huán)境光照強(qiáng)度、溫度及植物自身的光合節(jié)律有關(guān)。白天光強(qiáng)度變化較大，早晨和傍晚光強(qiáng)度較低，中午光強(qiáng)度最高，這些變化會(huì)影響光合作用效率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。溫度在一天中也會(huì)變化，通常中午溫度最高，中午高溫和強(qiáng)光可能導(dǎo)致PSII部分抑制，光化學(xué)量子產(chǎn)量下降。此外，氣孔導(dǎo)度的變化影響二氧化碳吸收和水分蒸騰，從而進(jìn)一步影響光合作用和葉綠素?zé)晒猓↙i and Chen，2009；Campbell et al.，2019；Akinyemietal.，2023；Zhuang et al.，2023）。因此，在實(shí)際研究中，應(yīng)結(jié)合環(huán)境因素和植物生理狀態(tài)，綜合分析葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化規(guī)律，選xUZZviVfR8JOvCZzN+dynePRHsvD/tvsTpHXQCEayrg=擇最適合的測量時(shí)間點(diǎn)。

4結(jié)論

針對(duì)葡萄葉片進(jìn)行OJIP曲線測定時(shí)，暗適應(yīng)時(shí)間應(yīng)為30 min以上，最小hV2qf7Nf/190Gmi+m8C53cGSKWeaNoONDjH8t7gYfTk=測量光強(qiáng)度為3000μmol/（m2·s），測量時(shí)間點(diǎn)宜選擇在12：00之前和16：00之后，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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（責(zé)任編輯劉可丹）