摘要：【目的】探究不同葡萄砧木品種需冷量及低溫時長對芽休眠相關基因表達的影響，為篩選熱區(qū)葡萄低需冷量砧木品種及探究葡萄萌芽進程調控機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳?5個葡萄砧木品種的冬季修剪枝梢為試驗材料，進行不同低溫時長處理，處理溫度為（4±1）℃，測定各砧木品種的需冷量，統(tǒng)計各葡萄砧木品種萌芽進程；并研究需冷量有差異的葡萄砧木品種，在低溫處理打破休眠過程中枝梢中可溶性總糖和淀粉含量變化；通過實時熒光定量PCR檢測砧木芽中休眠相關基因的相對表達量。【結果】貝達、SO4、101-14、110R、188-08、3309C、140R、Valliant、山河2號、BR No.2、Fercal和5C等12個品種需冷量為0 h，1103P需冷量為168 h。1103P砧木枝梢中可溶性總糖含量隨著低溫處理時長增加呈顯著增加趨勢（P<0.05，下同）；在低溫處理304 h時，可溶性總糖含量最高，達2.55μg/g，此時枝梢中淀粉含量顯著降低，僅0.06μg/g，低需冷量的3309C枝梢中淀粉含量在3個低溫時長處理間無顯著差異（P>0.05，下同）。1103P砧木隨著低溫處理時長增加，胼胝體合成酶基因VvCALLOSE SYNTHASE1的相對表達量呈顯著下降趨勢，未低溫處理的1103P冬芽中VvCALLOSE SYNTHASE1基因的相對表達量顯著高于3309C。3個低溫時長處理中，1103P芽中β-1，3-葡聚糖酶基因VvGLU1、ABA合成關鍵酶基因VvNCED1、GA20-氧化酶基因VvGA20ox-2、響應低溫脅迫的重要轉錄因子基因VvbHLH92和開花抑制基因VvSVP的相對表達量在低溫處理304 h時最高。未進入內(nèi)休眠的3309C在低溫處理過程中，VvCALLOSE SYNTHASE1和VvSVP基因的相對表達量無顯著變化，未經(jīng)低溫處理時的3309C芽中VvGLU1基因、ABA合成誘導因子基因VvXERICO和VvbHLH92基因的相對表達量最高。3個低溫時長下1103P芽中VvSVP基因的相對表達量均顯著高于3309C。【結論】篩選出貝達、SO4、101-14、110R、188-08、3309C、140R、Valliant、山河2號、BR No.2、Fercal和5C等12個不需經(jīng)低溫處理即可萌芽的砧木品種，葡萄的萌芽受品種需冷量、營養(yǎng)和休眠相關基因的共同調控。

關鍵詞：葡萄砧木；需冷量；低溫處理；休眠解除；基因表達

中圖分類號：S663.1文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）08-2237-11

Effects of chilling requirement and chilling duration on theexpression of bud dormancy-related genes in differentgrape rootstock varieties

XIAO Li-bing ZHONG Ting-wei LI Lin-lin LU Xiu-bian LIN Qin-xiong HAN Jia-yu ZHANG Yan-hui3，JIA Hai-feng BAI Xian-jin WANG Bo1*

（1College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；2Grape and Wine Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China；3Guangxi Zhencheng Agricultural Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 530105，China）

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the effects of chilling requirement and chilling duration on the expression of bud dormancy-related genes in different grape rootstock varieties，providing theoretical basis for screeninglow-chilling rootstock varieties suitable for tropical and subtropical regions and exploring the regulatory mechanisms of grape germination.【Method】Winter pruning bud-wood of 15 grape rootstock varieties were used as test materials，andsubjected to different chilling duration treatments at（4±1）℃.The chilling requirement of each grape rootstock variety was detected，and the germination process was recorded.The changes of total soluble sugar and starch content in branches with different chilling requirements were analyzed during dormancy release induced by chilling requirement.The relative expression levels of dormancy-related genes in the buds were determined using real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】The chilling requirement of 12 grape varieties including Bayda，SO4，101-14，110R，188-08，3309C，140R，Valliant，Shanhe No. BR No. Fercal and 5C was 0 h，while the chilling requirement of 1103P was 168 h.The totalsoluble sugar content in the branches of 1103P rootstocks increased significantly with chilling duration added（P<0.05，the same below），reaching a maximum of 2.55μg/g at 304 h of chilling duration，and the starch content in branches decreased significantly to 0.06μg/g.In contrast，there was no significant difference in starch content in branches of 3309 C with low chilling requirement among the three chilling duration treatments（P>0.05，the same below）.With in-creasing chillinng duration treatment，the relative expression of VvCALLOSE SYNTHASE1 in 1103P decreased signifi-cantly.The relative expression of callosal synthase gene VvCALLOSE SYNTHASE1 in 1103P winter buds without chillingtreatment was significantly higher than that in 3309C.Among the three chilling duration treatments，the relative expres-sion levels ofβ-1，3-glucanase gene VvGLU ABA synthesis key enzyme gene VvNCED GA20-oxidase gene VvGA20ox- key transcription factor gene responding to cold stress VvbHLH92 and flowering inhibitory gene VvSVP in 1103P buds were the highest at 304 h of chilling treatment.In 3309C which did not enter endodormancy，the relative ex-pression levels of VvCALLOSE SYNTHASE1 and VvSVP genes did not change significantly.The relative expression levels of VvGLU1 gene，ABA biosynthesis inducer VvXERICO gene and VvbHLH92 in 3309C buds were the highest without chilling treatment.The relative expression of VvSVP gene in 1103P buds was significantly higher than that in 3309C under all three chilling duration treatments.【Conclusion】The twelve grape rootstock varieties，including Bayda，SO4，101-14，110R，188-08，3309C，140R，Valliant，Shanhe No. BR No. Fercal and 5C，are identified as rootstock varieties notrequiring chilling requirement for germination.Grape germination is co-regulated by chilling requirement，nutrients and dormancy-related genes.

Key words：grape rootstock；chilling requirement；chilling treatment；dormancy release；gene expression

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31960572）；Guangxi Natural Science Foundation（2023GXNSFBA026047）；Guangxi Key Research and Development Project（Guike AB21196042）；Innovation and En-trepreneurship Project for Undergraduates of Guangxi（S202410593403）

0引言

【研究意義】葡萄為落葉果樹，落葉后芽進入自然休眠，休眠芽需要經(jīng)過一定時長的低溫春化作用才能萌芽整齊。解除自然休眠所需的有效低溫時數(shù)即為需冷量（Chilling requirement）。需冷量具有遺傳特性，不同葡萄品種的需冷量不同，國內(nèi)外應用較廣泛估算需冷量的3種模型分別為≤7.2℃模型、猶他模型和動力學模型（章鎮(zhèn)等，2002；張玉斌和王惠萍，2004；王海波等，2017；劉天華，2021；黃泳碧，2023）。近年來，我國熱區(qū)葡萄發(fā)展迅速，由于新模式、新技術、新設施的不斷完善，葡萄種植效益逐年提高，熱區(qū)葡萄產(chǎn)區(qū)已成為我國鮮食葡萄生產(chǎn)的重要力量。近20年來與全國增速相比，熱區(qū)葡萄種植面積及產(chǎn)量的增幅均超過全國平均水平（劉俊等，2020）。但由于熱區(qū)冬季溫暖的氣候難以滿足需冷量高的葡萄品種解除休眠的低溫需求，會導致春季萌芽難或萌芽不整齊、花芽發(fā)育不良等問題。目前熱區(qū)主栽葡萄品種如陽光玫瑰和巨峰等需冷量均較高（章鎮(zhèn)等，2002；劉天華，2021），因此，探究不同葡萄砧木品種需冷量及低溫時長對芽休眠相關基因表達的影響，對篩選熱區(qū)葡萄低需冷量砧木品種及探究葡萄萌芽進程調控機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】嫁接是葡萄生產(chǎn)上普遍采用的苗木繁殖方式，研究表明除葡萄（何愛華，2006；王海波等，2019）外，油桃（汪曉云和馬永柱，2005）、梨（李璇等，2011；趙丹丹等，2015）等落葉果樹的砧木也會影響砧、穗組合的需冷量。藤稔葡萄嫁接在高需冷量砧木品種DE上需冷量升高，嫁接在低需冷量砧木SO4上需冷量降低（何愛華，2006）；夏黑和87-1等2個葡萄品種嫁接在101-14M砧木上其需冷量均顯著低于嫁接在5C砧木上（王海波等，2019）。然而，目前有關葡萄砧木品種的需冷量的研究較少。葡萄的自然休眠為內(nèi)休眠，即為休眠芽本身因素（如冷溫需求和光周期影響）控制的生長停滯現(xiàn)象（Lang，1987），并受多種因素綜合調控，其形成、維持和解除不僅受到光照、溫度、水分等外界環(huán)境因素的影響，還受樹體內(nèi)激素、酶、糖類等內(nèi)部因素調控（王新超等，2011；李瑭等，2023）。糖作為信號分子調控植物生長發(fā)育進程（Gibson，2005），在芽休眠過程中，淀粉與脫落酸（ABA）協(xié)同調控芽休眠，而糖參與赤霉素（GA）合成對芽休眠進行調控的過程（Perata etal.，1997）。葡萄在休眠期間枝梢韌皮部的碳水化合物主要以淀粉為主，隨著休眠解除淀粉轉化為可溶性糖，可溶性糖含量上升而淀粉含量下降，芽恢復到活躍的生長狀態(tài)（Mohamed et al.，2010）。ABA促進芽的休眠誘導，芽休眠時ABA含量顯著上升（Li etal.，2018），Zheng等（2015）的研究結果表明，ABA誘導因子基因VvXERICO與ABA合成關鍵酶基因VvNCED1的表達下調，ABA含量降低，能促進葡萄芽休眠解除。在落葉果樹和楊樹中，開花抑制基因SVP受ABA調節(jié)，SVP蛋白為整合ABA信號、GA生物合成和分解代謝的轉錄因子，以此參與落葉果樹和楊樹的休眠過程（Yang et al.，2021）。ABA和GA在拮抗調節(jié)芽休眠誘導、維持和解除過程中發(fā)揮重要作用，高水平ABA是維持芽休眠的首要因素，而GA負責內(nèi)休眠解除（Yang et al.，2021）。GAs生物合成由多種酶共同調控，GA20-氧化酶（GA20ox）基因是GAs生物合成中的關鍵酶基因，可催化形成活性GAs（張加強等，2019）。由胼胝體沉積引起的胞間連絲閉合會導致植物休眠，胼胝體合成酶（CALLOSE SYNTHASE）促使胼胝質沉積，從而阻斷促進萌芽的植物信號，使細胞保持休眠狀態(tài)；CALLOSE SYNTHASE1能介導胞間連絲閉合以促進休眠（Singh etal.，2019）。β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）在休眠解除過程中參與胞間連絲運轉狀態(tài)的轉變（Rinne etal.，2011），VvGLU蛋白在葡萄芽的休眠解除過程中參與胞間連絲的打開，葡萄休眠芽GLU基因家族成員中受乙烯和HC顯著調控的VvGLU1基因在葡萄芽休眠解除過程中其相對表達量上升（施招婉，2019）。轉基因擬南芥響應低溫脅迫的重要轉錄因子基因LcbHLH92通過負調控花青素/原花青素的合成，從而抑制ABA合成，促使種子打破休眠（Zhao et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】砧木品種的選擇會影響葡萄接穗品種的需冷量，但目前有關不同葡萄砧木品種需冷量及低溫時長對芽休眠相關基因表達影響的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以貝達、5BB、SO4、101-14、110R、188-08、1103P、3309C、140R、Valliant、山河2號、BR No.2、Rupestris du Lot、Fercal和5C等15個葡萄砧木品種為試驗材料，對其冬季修剪枝梢進行不同時長低溫處理，用水培觀察萌芽率法調查其需冷量，并測定需冷量差異較大的2個砧木品種不同低溫處理下枝梢中可溶性總糖和淀粉含量及芽休眠相關基因的相對表達量，為篩選熱區(qū)葡萄低需冷量砧木品種及探究葡萄萌芽進程調控機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

以種植于廣西南寧東盟經(jīng)濟開發(fā)區(qū)廣西真誠農(nóng)業(yè)有限公司基地（23°12′2″N，108°9′9″E）的15個3年生葡萄砧木品種為試驗材料，分別為貝達、5BB、SO4、101-14、110R、188-08、1103P、3309C、140R、Val-liant、山河2號、BR No.2、Rupestris du Lot、Fercal和5C，鋼架大棚避雨栽培，樹勢健壯，管理良好。主要試劑：大生M45（80%代森錳鋅）可濕性粉劑購自先正達（蘇州）作物保護有限公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTM Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒和TB Green?Pre-mix E×TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1試驗設計于2024年1月15日冬季修剪時采樣，各葡萄砧木品種選取木質化的1年生枝梢，采集自基部起第2～8節(jié)位枝梢，用濃度為0.2%的大生M45（80%代森錳鋅）可濕性粉劑進行消毒，風干后將枝梢剪口兩端蠟封裝進自封袋中密封，放入（4±1）℃冷庫中進行低溫處理，預試驗結果表明，低溫處理216 h后，大部分砧木品種的枝段萌芽率顯著高于50%，因此將低溫時長處理分別設置為0、114、168、216、304、360、504、648、792和936 h，其中5BB、1103P、3309C和Repestris du Lot等4個砧木品種因枝梢數(shù)量較少，設置0、114seBr1ouzihKPgddqOhBCrA==、168和304 h等4個低溫時長處理。每時長處理每品種分別隨機選擇10個枝梢剪成單芽段用于萌芽狀態(tài)評估試驗。根據(jù)需冷量測定結果選擇需冷量差異較大的葡萄砧木品種測定休眠相關基因表達情況并測定淀粉和可溶性總糖含量。取10個枝梢，隨機切取15個芽迅速液氮冷凍處理后置于-80℃冰箱保存，用于休眠相關基因表達測定。用于取芽的10個枝梢經(jīng)烘箱干燥后磨成粉狀，常溫密封保存，用于測定淀粉和可溶性總糖含量，每處理每品種3個生物學重復。

1.2.2芽休眠狀態(tài)評估取15個葡萄砧木品種的枝梢剪成單芽段后隨機混合。去除壞芽和干癟芽，選擇完整、飽滿的芽進行水培。以10個單芽段為1個重復，每處理3個重復。放入人工氣候培養(yǎng)箱進行水培，培養(yǎng)條件如表1所示。每隔7 d統(tǒng)計1次萌芽率，3 d換水1次，連續(xù)4周觀察并根據(jù)公式計算貝達、5BB、SO4、101-14、110R、188-08、1103P、3309C、140R、Valliant、山河2號、BR No.2、Rupestris du Lot、Fercal和5C等15個葡萄砧木品種各低溫時長處理的萌芽率，以第4周萌芽率判斷芽休眠狀態(tài)，萌芽率保持在50%以上則說明休眠解除。芽萌發(fā)的判斷依據(jù)為芽鱗片裂開并露出綠色組織（Or etal.，2002）。

萌芽率（%）=萌芽數(shù)/總芽數(shù)×100

1.2.3不同葡萄砧木品種抽梢期萌芽情況調查

15個葡萄砧木品種各選取生長狀態(tài)一致的3株樹，每株樹隨機選取15個冬芽作為1個重復，每品種3個重復。于2024年3月28日（萌芽抽梢期）調查并記錄冬芽萌發(fā)情況及各萌發(fā)枝梢所處的發(fā)育階段，統(tǒng)計處于各階段冬芽所占比率。冬芽萌發(fā)枝梢的發(fā)育階段分為6個階段：休眠芽、絨毛期、初展葉、3葉、4葉和5葉，各階段判定標準見圖1。

1.2.4可溶性總糖和淀粉含量測定可溶性總糖和淀粉含量測定參考黃泳碧等（2023）的方法。

1.2.5 7個休眠相關基因的相對表達量測定從NCBI數(shù)據(jù)庫查詢獲得7個休眠解除相關基因序列，參考序列均來源于歐亞種葡萄，以葡萄VvActin作為內(nèi)參基因。部分基因（VvActin、VvCALLOSE SYNTHASE1、VvGLU1、VvNCED1和VvXERICO）的引物序列設計參考黃泳碧等（2023）的方法，其余基因在NCBI中采用Primer-BLAST設計引物，引物序列見表 進行實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明提取樣本的總RNA，以獲得樣品的總RNA為模板，采用PrimeScriptTM Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real time）反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。反應體系20.0μL：2×TB Green?Premix E×TaqTM II（Tli RNaseH Plus）10.0μL，10μmol/L上、下游引物各0.8μL，50×ROX Reference DyeⅡ0.4μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O 6.0μL。擴增程序：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，65～95℃60 min，進行40個循環(huán)。每樣品設3個生物學重復，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3統(tǒng)計分析

使用Excel 2019整理并分析數(shù)據(jù)，運用SPSS 27.0進行差異顯著性分析，采用Origin 2021作圖。

2結果與分析

2.1 15個葡萄砧木品種需冷量分析結果

為統(tǒng)計不同葡萄砧木的需冷量，基于前期預試驗結果設置0～936 h的不同低溫時長處理，以水培第4周萌芽率大于50%作為芽休眠解除的判斷標準。由圖2可知，貝達、SO4、101-14、110R、188-08、3309C、140R、Valliant、山河2號、BR No.2、Fercal和5C未經(jīng)低溫處理的單芽段水培第4周的萌芽率均高于50.00%，分別達56.67%，66.67%、70.83%、63.33%、100.00%、85.82%、83.33%、100.00%、100.00%、77.78%、90.48%和80.95%；1103P低溫處理168和304 h后的水培第4周的萌芽率均高于50.00%；Rupestris du Lot低溫處理304h后的水培第4周的萌芽率達59.39%；5BB低溫處理304 h，萌芽率仍低于50.00%。貝達、SO4、101-14、110R、188-08、3309C、140R、Valliant、山河2號、BR No.2、Fercal和5C不需要經(jīng)過低溫處理就能萌芽，因此這12個葡萄砧木品種需冷量為0h，1103P需冷量為168 h，Rupestris du Lot的需冷量為304 h，5BB的需冷量則大于304h。

綜合15種葡萄砧木品種的需冷量表現(xiàn)，選擇需冷量有差異的1103P（需冷量為168 h）和3309C（需冷量為0 h）2個葡萄砧木品種進行后續(xù)的可溶性總糖和淀粉含量測定以及休眠相關基因表達分析試驗。

2.2 15個葡萄砧木品種抽梢期萌芽比率分析結果

為了解15個葡萄砧木品種春季萌芽快慢的進程差異，在抽梢期（2024年3月28日）調查各品種處于不同萌芽抽梢進程的冬芽比例。由圖3知，15個品種中萌芽進程最快的是山河2號，調查時其冬芽均萌發(fā)抽梢，且枝梢均處于5葉期。其他萌芽進程較快的砧木品種依次是3309C、101-14、1103P、Val-liant、5C和貝達，均有超過80%冬芽抽出的新梢處于3葉期或以上。15個品種中萌芽進程最慢的是5BB，尚未有進入5葉期的新梢，188-08和SO4萌芽較慢，均有超過30%的冬芽還處于休眠芽和絨毛期。

2.3不同低溫時長對2個葡萄砧木品種枝梢中可溶性總糖及淀粉含量的影響

由圖4可知，葡萄砧木品種1103P枝梢中可溶性總糖含量隨著低溫時長處理增加呈顯著增加趨勢（P<0.05，下同），在低溫處理304h時，該品種處于休眠解除狀態(tài)，枝梢中可溶性總糖含量最高，達2.55μg/g。低需冷量砧木品種3309C在測定的3個時期均處于休眠解除狀態(tài)，可溶性總糖含量均在2.00～2.25μg/g范圍。在未低溫處理和低溫處理114h時，3309C枝梢中可溶性總糖含量均顯著高于1103P，低溫處理304h后，3309C枝梢中可溶性總糖含量顯著低于1103P，說明枝梢中可溶性總糖含量可以表征休眠解除。

由圖5可知，葡萄砧木品種1103P在未低溫處理和低溫處理114 h處于休眠狀態(tài)時淀粉含量均為0.10μg/g，低溫處理304 h，該砧木枝梢中淀粉含量顯著降低，僅0.06μg/g。低需冷量的3309C在3個低溫時長處理下均處于休眠解除狀態(tài)，淀粉含量在

3個低溫時長處理間無顯著差異（P>0.05，下同）。在3個低溫時長處理下3309C的淀粉含量均顯著高于1103P。

2.4不同低溫時長對2個葡萄砧木品種芽休眠相關基因表達的影響

2.4.1與胞間連絲結構相關基因的表達模式由圖6-A可知，葡萄砧木品種1103P隨著低溫時長處理的增加，VvCALLOSE SYNTHASE1基因的相對表達量顯著下降。3309C在3個低溫時長處理下均處于休眠解除狀態(tài)，VvCALLOSE SYNTHASE1基因的相對表達量無顯著變化。未低溫處理的處于休眠期的1103P冬芽中VvCALLOSE SYNTHASE1基因的相對表達量均顯著高于處于休眠解除狀態(tài)的3309C；在低溫處理114和304 h時，是需冷量為168 h的1103P休眠解除過程，VvCALLOSE SYNTHASE1基因的相對表達量均顯著低于3309C。說明隨著1103P芽休眠解除，芽中VvCALLOSE SYNTHASE1基因表達量下調，解除休眠的3309C芽VvCALLOSE SYNTHASE1基因表達量維持在一定水平。由圖6-B可知，1103P芽中VvGLU1基因在未低溫處理和低溫處理114 h處于休眠狀態(tài)時相對表達量較低，顯著低于在低溫處理304 h休眠解除時的相對表達量，說明1103P解除休眠過程中芽的VvGLU1基因的相對表達量升高。3309C芽中VvGLU1基因的相對表達量隨著低溫時長處理增加呈顯著降低趨勢。未經(jīng)低溫處理尚處于休眠期的1103P芽中VvGLU1基因的相對表達量顯著低于處于已休眠解除狀態(tài)的3309C，隨著1103P休眠逐漸解除，到低溫處理304h時，1103P芽中VvGLU1基因相對表達量顯著高于3309C。

2.4.2 ABA合成相關基因的表達模式由圖7-A可知，1103P砧木芽中VvXERICO基因的相對表達量在未低溫處理時最高，隨著休眠逐漸解除在低溫處理114和304 h時，該基因的相對表達量均顯著低于未低溫處理。3309C芽中VvXERICO基因的相對表達量的變化趨勢與1103P相似，即未低溫處理芽中VvXERICO基因的相對表達量最高，低溫處理114和304 h時VvXERICO基因的相對表達量無顯著差異。而1103P低溫處理114 h該基因的相對表達量顯著低于低溫處理304h。3個低溫時長處理下3309C芽中VvXERICO基因的相對表達量均顯著低于1103P。由圖7-B可知，1103P芽中VvNCED1基因的相對表達量受低溫時長增加的誘導顯著升高，而3309C芽中VvNCED1基因的相對表達量在未低溫處理和低溫處理304 h時差異不顯著，低溫處理114 h時該基因的相對表達量顯著低于其他2個低溫時長處理。低溫處理114和304 h時，1103P芽中VvNCED1基因的相對表達量均顯著高于3309C。

2.4.3 GA合成相關基因的表達模式由圖8可知，1103P葡萄砧木芽中VvGA20ox-2基因的相對表達量在低溫處理304h處于休眠解除狀態(tài)時，顯著高于處于休眠狀態(tài)時的未低溫處理和低溫處理114 h。說明VvGA20ox-2基因在1103P芽休眠解除后相對表達量升高。3309C芽中VvGA20ox-2基因的相對表達量隨著低溫時長的增加呈顯著上升趨勢，說明在解除休眠的3309C中隨低溫時長增加該基因的相對表達量也增加。除114 h低溫時長1103P芽中VvGA20ox-2基因的相對表達量顯著低于3309C外，未低溫處理和低溫處理304h 1103P芽中VvGA20ox-2基因的相對表達量均顯著高于3309C。

2.4.4其他休眠相關基因的表達模式由圖9-A可知，1103P砧木芽中VvbHLH92基因的相對表達量隨著低溫時長處理增加呈顯著上升趨勢，說明Vvb-HLH92基因在1103P芽休眠解除過程中相對表達量升高。3309C芽中VvbHLH92基因的相對表達量在未低溫處理時最高，顯著高于114和304h低溫時長處理。3個低溫時長處理下1103P芽中VvbHLH92基因的相對表達量均顯著高于3309C。由圖9-B可知，1103P砧木在3個低溫時長處理下，呈先顯著降低后顯著增加的變化趨勢，1103P芽中VvSVP基因的相對表達量在低溫處理114h最低，顯著低于未低溫處理和304 h時長處理，低溫處理304 h的芽中該基因的相對表達量顯著高于未經(jīng)低溫處理和低溫處理114 h。3309C芽中VvSVP基因的相對表達量在3個低溫時長處理間無顯著差異。3個低溫時長下1103P芽中VvSVP基因的相對表達量均顯著高于3309C。

3討論

油桃、梨和葡萄等果樹的研究表明砧木對嫁接后的砧穗組合需冷量影響明顯（汪曉云和馬永柱，2005；何愛華，2006；李璇等，2011；趙丹丹等，2015；王海波等，2019）。葡萄砧木的需冷量因品種的遺傳特性、根系活力不同而有所差異（王海波等，2019）。隨著全球氣溫的上升，亟需開展對葡萄砧木品種需冷量的篩選研究，尤其是南方熱區(qū)，低需冷量砧木是熱區(qū)葡萄的栽培成功的基礎。本研究中，貝達、SO4、101-14、110R、188-08、3309C、140R、Valliant、山河2號、BR No.2、Fercal和5C等12個砧木品種在不經(jīng)過低溫處理單芽段水培第4周萌芽率均在50%以上，1103P在低溫處理168 h后萌芽率高于50%，Rupestris du Lot在低溫處理304 h后萌芽率達到59.39%。由此可斷定葡萄砧木貝達、SO4、101-14、110R、188-08、3309C、140R、Valliant、山河2號、BRNo.2、Fercal和5C的需冷量為0 h，1103P需冷量為168 h，Rupestris du Lot的需冷量為304 h，5BB的需冷量則高于304 h。本研究設置的低溫時長處理未能預估出5BB砧木的需冷量，5BB是目前葡萄嫁接苗常用的砧木品種（韓曉等，2022），因此有關該砧木需冷量還有待進一步研究。本研究所用的葡萄砧木品種多為低需冷量品種，后續(xù)可進一步研究這些品種在熱區(qū)的推廣效果并作為資源進行低需冷量種質創(chuàng)制工作。

為觀察不同需冷量砧木品種春季萌芽情況，本研究跟蹤調查了各砧木春季萌芽情況，結果顯示需冷量為0 h的各砧木品種中，山河2號萌芽最快，其他萌芽進程較快的砧木品種依次是3309C、101-14、1103P、Valliant、5C和貝達，需冷量為168 h的1103P其萌芽進程與需冷量為0的101-14相差不大，而需冷量等于或高于304 h的Rupestris du Lot和5BB萌芽進程均較慢。由此可見需冷量會影響葡萄砧木品種的萌芽進程，而需冷量相近的低需冷量品種之間的萌芽進程也有較大差異，說明低需冷量葡萄品種的萌芽生長除受需冷量影響外還受其他因素調節(jié)。

淀粉和可溶性糖在植物解除休眠的過程中存在轉化關系，淀粉隨著休眠解除，可轉化為可溶性糖而其本身含量降低，可溶性糖含量隨之上升。桃樹在休眠結束時枝梢內(nèi)的可溶性糖含量迅速上升，而淀粉含量則迅速下降（高東升等，1999）；自然休眠解除期的甜櫻桃品種拉賓斯中葡萄糖和果糖含量升高，淀粉含量迅速降低（李勃，2011）。葡萄休眠解除過程中，淀粉轉化為可溶性糖，可溶性糖含量上升而淀粉含量下降（Mohamed et al.，2010）。本研究中葡萄砧木1103P和3309C在解除休眠過程中枝梢內(nèi)淀粉和可溶性總糖的含量變化趨勢與前人的研究結果一致，表明葡萄砧木在解除休眠過程中需要將淀粉轉化為可溶性總糖，為葡萄芽萌發(fā)提供能量。

ABA和GA是調控芽休眠，維持和解除休眠的2種最重要的激素，高水平ABA是維持芽休眠的主要因素，而GA則負責芽休眠的解除（Yang，et al.，2021）；在模式植物楊樹中，SVP-like（SVL）作為整合ABA信號、ABA合成、GA合成、GA分解代謝和細胞分裂的中心轉錄因子，維持芽休眠（Singhetal.，2018；Singhetal.，2019；Azeez etal.，2021）。Yang等（2021）總結了落葉果樹以DAM/SVP為中心的內(nèi)休眠調控網(wǎng)絡，結果表明ABA能促進SVP蛋白合成以維持芽休眠，SVP反過來也可以增強NCED蛋白的合成進而促進ABA的合成，同時SVP抑制GA20ox進行GA的生物合成。ABA會上調VvCALLOSE SYNTHASE1基因的表達，而VvCALLOSE SYNTHASE1促使胼胝質的沉積，從而阻斷促進萌芽的植物信號（Tyle-wiczetal.，2018；Singh，et al.，2019）。Zheng等（2015）的研究結果表明，基因VvXERICO與VvNCED1相對表達量下調會降低葡萄芽中ABA含量，促進葡萄芽休眠解除。本研究結果表明，1103P葡萄砧木在休眠解除過程中芽中VvSVP基因的相對表達量先顯著下降后顯著上升，且在114～304 h低溫范圍內(nèi)，是需冷量為168h的1103P休眠解除過程，此過程中，VvSVP基因受低溫誘導相對表達量升高幅度最大，且VvNCED1基因的相對表達量在1103P砧木芽的休眠解除過程中顯著上升，與Yang等（2021）的研究結果一致；VvGA20ox-2基因在1103P芽休眠解除后相對表達量升高，也與Yang等（2021）的研究結果一致。較未經(jīng)低溫處理，1103P芽VvXERICO基因相對表達量在低溫處理114 h時下調，與Zheng等（2015）的研究結果一致，不同的是VvNCED1基因的表達受低溫時長處理增加的誘導下顯著升高，原因可能是VvNCED1基因的表達受低溫時長增加誘導升高，與黃泳碧等（2023）對妮娜皇后葡萄低溫處理后芽VvNCED1基因在休眠解除過程中相對表達量上升的研究結果一致，其研究還發(fā)現(xiàn)在休眠解除后，葡萄芽中VvNCED1基因相對表達量開始下降。本研究發(fā)現(xiàn)VvCALLOSE SYNTHASE1基因在1103P葡萄芽休眠解除的過程中相對表達量顯著降低，與Singh等（2019）的研究結果一致。葡萄GLU家族成員中的VvGLU1基因在葡萄芽休眠解除的過程中起到重要的調節(jié)作用（施招婉，2019），本研究發(fā)現(xiàn)VvGLU1和VvbHLH92基因在1103P葡萄芽休眠解除的過程中相對表達量均升高，與Zhao等（2019）在轉基因擬南芥中發(fā)現(xiàn)LcbHLH92促進種子休眠解除的結果一致，但其具體調控機制有待進一步研究。

4結論

本研究篩選出貝達、SO4、101-14、110R、188-08、3309C、140R、Valliant、山河2號、BRNo.2、Fercal和5C等12個不需經(jīng)低溫處理即可萌芽的砧木品種，葡萄的萌芽受品種需冷量、營養(yǎng)和休眠相關基因的共同調控。

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（責任編輯李洪艷）