[摘要]目的觀察甲基雙加氧酶（ten-eleventranslocation，TET2）表達(dá)量對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力、凋亡率、細(xì)胞周期、遷移和侵襲的影響。方法通過RT-PCR和Westernblot法檢測不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞TET2基因和蛋白的表達(dá)情況，對高表達(dá)TET2的細(xì)胞敲低其基因表達(dá)（shRNA1），對低表達(dá)TET2的細(xì)胞過表達(dá)其基因（OE-TET2）。通過CCK-8檢測TET2表達(dá)量對細(xì)胞增殖的影響，通過流式細(xì)胞術(shù)觀察TET2表達(dá)量對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，通過遷移實驗和侵襲實驗觀察TET2表達(dá)量對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果H1299細(xì)胞的TET2基因和蛋白表達(dá)量最高，A549的最低（P<0.05）。OE-TET2組細(xì)胞增殖能力顯著低于正常A549，shRNA1組細(xì)胞增殖能力顯著高于正常H1299細(xì)胞（P<0.05）。OE-TET2組細(xì)胞凋亡率顯著高于正常A549，shRNA1組細(xì)胞凋亡率顯著低于正常H1299細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。OE-TET2組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常A549，shRNA1組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞顯著高于正常H1299細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論TET2可降低非小細(xì)胞肺癌增殖能力，提高其凋亡率，減弱其遷移和侵襲能力。

[關(guān)鍵詞]甲基雙加氧酶；非小細(xì)胞肺癌；增殖；凋亡；遷移

[中圖分類號]R7.342[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.20.006

EffectofTET2ontheactivityandmotilityofnon-smallcelllungcancercells

YANGBilan1，ZHANGZixian2，OUYangxi1，LIUZhihua1，ZHONGJun1

1.DepartmentofChestTumorRadiotherapy，JiangxiCancerHospital，Nanchang330029，Jiangxi，China;2.DepartmentofBreastOncology，NanchangPeople’sHospital，Nanchang330000，Jiangxi，China

[Abstract]ObjectiveToobservetheeffectsofmethylenedioxygenase（TET2）expressionontheproliferationability，apoptosisrate，cellcycle，migration，andinvasionofnon-smallcelllungcancercells.MethodsDetecttheexpressionofTET2geneandproteinindifferentnon-smallcelllungcancercellsthroughRT-PCRandWesternblot.KnockdownthegeneexpressionofthehighestTET2expressingcells（shRNA1）andoverexpressthegeneinthemostlowTET2expr8q+uG0xaWbea7FnorpHPyw==essingcells（OE-TET2）.DetecttheeffectofTET2expressiononcellproliferationthroughCCK-8，observetheeffectofTET2expressiononcellapoptosisandcellcyclethroughflowcytometry，andobservetheeffectofTET2expressiononcellmigrationandinvasionabilitythroughmigrationandinvasionexperiments.ResultsTheexpressionlevelsofTET2geneandproteininH1299cellswerethehighest，whileA549cellshadthelowestexpressionlevels（P<0.05）.TheproliferationabilityofOE-TET2groupcellswassignificantlylowerthanthatofnormalA549，whiletheproliferationabilityofshRNA1groupcellswassignificantlyhigherthanthatofnormalH1299cells（P<0.05）.TheapoptosisrateofOE-TET2groupwassignificantlyhigherthanthatofnormalA549cells，whiletheapoptosisrateofshRNA1groupwassignificantlylowerthanthatofnormalH1299cells（P<0.05）.ThenumberofmigrationandinvasioncellsintheOE-TET2groupwassignificantlylowerthanthatofnormalA549cells，whilethemigrationandinvasioncellsintheshRNA1groupweresignificantlyhigherthanthoseinnormalH1299cells（P<0.05）.ConclusionTET2canreducetheproliferationability，increaseitsapoptosisrate，andslowdownitsmigrationandinvasionabilityofnon-smallcelllungcancercells.

[Keywords]Methyldioxygenase;Non-smallcelllungcancer;Proliferation;Apoptosis;Migration

非小細(xì)胞肺癌（non?smallcelllungcancer，NSCLC）是肺癌常見的類型，當(dāng)前NSCLC的早期治療主要是手術(shù)切除，但NSCLC的早期癥狀不明顯，經(jīng)常在中晚期才被發(fā)現(xiàn)，錯過最佳手術(shù)時機，需采用化療等其他方式治療，不僅療效無法保證且會引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及生命安全[1-4]。因此研發(fā)更為有效安全的NSCLC治療手段至關(guān)重要。研究顯示，DNA異常甲基化參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而甲基雙加氧酶（ten-eleventranslocation，TET2）主要參與DNA甲基化[5-7]。研究顯示，TET2的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8]。TET2在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少。本研究通過敲低或過表達(dá)NSCLC細(xì)胞的TET2基因，觀察其對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、運動能力的影響，以期為NSCLC的治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，H1299，H1975和HCC827均從中國上海中科院細(xì)胞庫/干細(xì)胞庫購買。RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Corning公司。CCK-8試劑盒購自北京索萊寶公司。TET2抗體購自美國Millipore公司。Transwell小室購自美國Corning公司。Matrigel購自美國BD公司。

1.2培養(yǎng)與檢測方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞分別于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加10%雙抗和10%胎牛血清。細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：待細(xì)胞在培養(yǎng)皿中融合至80%～90%時制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml并接種于6孔板中。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將全長人TET2cDNA（NM_001127208）插入pLVX-Ires-Puro載體（Clontech）中，構(gòu)建TET2過表達(dá)質(zhì)粒。siRNA合成序列分別為正向：3’-GUGGUGGUAUUUAGA-5’；反向：3’-UUUAUCUAAAUACCACCAC-5’。對于過表達(dá)TET2細(xì)胞，A549為正常未處理細(xì)胞（A549組），OE-NC為轉(zhuǎn)染對照（OE-TET2組），OE-TET2為轉(zhuǎn)染過表達(dá)細(xì)胞。對于敲低TET2細(xì)胞（OENC組），H1299為正常未處理細(xì)胞，shRNA-NC為轉(zhuǎn)染對照，shRNA1、shRNA2、shRNA3為不同程度轉(zhuǎn)染敲低細(xì)胞。

1.2.2RT-PCR法檢測使用Trizol對細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，隨后通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。使用熒光定量PCR儀96lightcycler進(jìn)行RT-PCR法檢測。在96孔光學(xué)反應(yīng)板中進(jìn)行40個循環(huán)進(jìn)行擴增，1個循環(huán)中94℃變性5s，63℃退火30s，72℃延伸60s。Bactin作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

1.2.3Westernblot法檢測使用RIPA緩沖液裂解所有細(xì)胞。將具有等量蛋白質(zhì)（20μg/孔）的樣品裝載在10%SDS-PAGE凝膠上，并按照說明書進(jìn)行免疫印跡。抗TET2抗體和β-肌動蛋白的一級抗體購自細(xì)胞信號技術(shù)公司。用增強化學(xué)發(fā)光（enhancedchemiluminescence，ECL）觀察免疫反應(yīng)帶，并使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)取各組對數(shù)期生長細(xì)胞消化后制備單細(xì)胞懸液，使得細(xì)胞懸液密度為1×106/ml，隨后在tube管中，分別根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒加入RNase5μl（10mg/ml），37℃溫浴1h，加入PI（10mg/ml）染液5μl，室溫避光染色30min，用流式細(xì)胞儀測定周期；根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒使用AnnexinV-FITC在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5細(xì)胞遷移與侵襲實驗將各組細(xì)胞分別置于Transwell小室中，下室加入600μl含20%血清培養(yǎng)基，上室加入150μl不含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后觀察小室地面細(xì)胞數(shù)量。使用培養(yǎng)基將Matrigel稀釋至1mg/ml，在Transwell小室的小室上室底部加入100μl稀釋好的Matrigel，待其干成膠狀后加入細(xì)胞，方法同細(xì)胞遷移實驗。24h后觀察Matrigel中細(xì)胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用單因素方差分析方法（one-wayANOVA），進(jìn)一步的多重比較則采用LSD方法。組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TET2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)

使用RT-PCR和Westernblot法分別檢測4種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H1299、H1975和HCC827中TET2的基因和蛋白表達(dá)情況。H1299的TET2基因表達(dá)量最高，其次為HCC827，H1975略高于A549（P<0.05）。H1299的TET2蛋白表達(dá)水平顯著高于其他3種細(xì)胞，而A549的TET2蛋白表達(dá)水平最低（圖1）。

2.2TET2基因干擾及過表達(dá)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的建立

H1299的TET2水平表達(dá)最高，A549的表達(dá)最低，因此分別構(gòu)建穩(wěn)定干擾的H1299非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和穩(wěn)定過表達(dá)的A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株用于后續(xù)研究。穩(wěn)定過表達(dá)的A549（OE-TET2）細(xì)胞中TET2的基因（P<0.05）和蛋白水平均出現(xiàn)顯著升高，穩(wěn)定干擾的H1299（shRNA1、shRNA2、shRNA3）細(xì)胞中TET2的基因（P<0.05）和蛋白水平均出現(xiàn)顯著降低（圖2）。干擾的H1299非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和穩(wěn)定過表達(dá)的A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株已成功構(gòu)建。

2.3TET2對細(xì)胞增殖的影響

三組A549和H1299細(xì)胞的起始濃度相同，隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞的濃度均出現(xiàn)顯著增加。正常A549細(xì)胞以及OE-NC細(xì)胞的濃度始終保持一致，然后在培養(yǎng)24h后，OE-TET2組細(xì)胞濃度低于A549和OE-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且這種

差異隨著培養(yǎng)時間的延長愈加明顯。正常H1299細(xì)胞以及shRNA-NC細(xì)胞的濃度始終保持一致，但是在培養(yǎng)24h后，shRNA1組細(xì)胞濃度顯著高于H1299和shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且這種差異隨著培養(yǎng)時間的延長愈加明顯（圖3）。

2.4TET2對細(xì)胞凋亡及周期的影響

過表達(dá)TET2的細(xì)胞凋亡率明顯上升（P<0.05），而敲低TET2表達(dá)后，細(xì)胞的凋亡率出現(xiàn)明顯下降（P<0.05）。TET2的表達(dá)對細(xì)胞S期的含量影響較小，過表達(dá)TET2后細(xì)胞G2期含量顯著上升（P<0.05），G1期含量顯著下降（P<0.05），而敲低TET2的表達(dá)則在G2期和G1期表現(xiàn)出相反的趨勢（P<0.05）。

2.5TET2對細(xì)胞遷移和侵襲的影響

過表達(dá)TET2后，Transwell小室上A549遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05），同時侵襲的細(xì)胞數(shù)量也出現(xiàn)顯著降低（P<0.05）。對于TET2基因敲低的H1299細(xì)胞，遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量均顯著上升（P<0.05），見圖4。

3討論

肺癌是一種發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率最高，約占肺癌80%～85%，深入研究非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制可為其治療提供新的思路[9-10]。TET2作為一種去甲基化蛋白，已被證實其表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如乳腺癌、白血病、黑色素瘤等[11-13]。同時，已有研究證實，TET2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后存在一定關(guān)系[14]。因此，深入探討TET2在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用或許可成為其有效的治療手段。

A.A549細(xì)胞及過表達(dá)TET2的A549細(xì)胞遷移和侵襲（結(jié)晶紫染色，×20）；B.H1299細(xì)胞及敲弱表達(dá)TET2的H1299細(xì)胞遷移和侵襲（結(jié)晶紫染色，×20）；C.過表達(dá)組遷移實驗統(tǒng)計結(jié)果；D.過表達(dá)組遷侵襲實驗統(tǒng)計結(jié)果；E.敲弱表達(dá)組遷移實驗統(tǒng)計結(jié)果；F.敲弱表達(dá)組遷侵襲實驗統(tǒng)計結(jié)果

TET2是雙加氧酶蛋白家族成員之一，主要參與DNA甲基化。研究發(fā)現(xiàn)5-mC能夠在TET蛋白的催化下生成5-羥甲基胞哺唆（5-hydroxvmethylcvtosine，5-hmC），從而導(dǎo)致DNA序列去甲基化。而TET2蛋白可催化氧轉(zhuǎn)移到5-mC的甲基，產(chǎn)生5-hmC[15-16]。DNA的異常甲基化會抑制抑癌基因的表達(dá)，激活原癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)TET2缺失導(dǎo)致5mC的積累，從而促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)育[18]。TET2缺失還促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化和M1巨噬細(xì)胞反應(yīng)，這可以調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞的活性。相反，攜帶TET2突變的癌癥細(xì)胞抵消了包括T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在內(nèi)的陽性免疫細(xì)胞反應(yīng)[19]。

本研究體外細(xì)胞學(xué)實驗，觀察非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H1299、H1975和HCC827中TET2的基因和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示A549細(xì)胞中TET2的基因和蛋白表達(dá)最低，而H1299的基因和蛋白表達(dá)最高。因此，分別上調(diào)A549細(xì)胞中TET2基因表達(dá)量和下調(diào)H1299細(xì)胞中TET2基因表達(dá)量，觀察其對腫瘤細(xì)胞的影響。

本研究過表達(dá)TET2基因的細(xì)胞，增殖能力降低，凋亡率增加，遷移和侵襲能力降低，而敲低TET2基因表達(dá)后表現(xiàn)出相反的趨勢。通過對細(xì)胞周期進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的肺癌細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)量減少，G2期升高，S期無明顯變化。G1期是DNA合成前期，G2期是DNA合成后期，過表達(dá)的肺癌細(xì)胞更多的停留在DNA合成后期，這進(jìn)一步說明TET2具有減弱腫瘤細(xì)胞增殖能力、增加細(xì)胞凋亡的作用。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤發(fā)展過程中重要的一環(huán)，遷移和侵襲能力越強，腫瘤越有可能長大且轉(zhuǎn)移。研究顯示，細(xì)胞遷移和侵襲能力受多種細(xì)胞因子影響[20-21]。如果TET2基因缺失，可能引起腫瘤周圍環(huán)境炎性因子表達(dá)升高，且部分DNA序列甲基化本身也會引起細(xì)胞運動能力增強。這可能是本研究中低表達(dá)TET2基因的肺癌細(xì)胞出現(xiàn)遷移和侵襲能力增加，高表達(dá)TET2基因的肺癌細(xì)胞出現(xiàn)遷移和侵襲能力降低的原因。

綜上所述，本研究通過篩選不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中TET2的表達(dá)情況構(gòu)建TET2的高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞系，并觀察其對腫瘤細(xì)胞的影響。研究結(jié)果顯示TET2表達(dá)上升后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖能力下降、凋亡率上升，同時其遷移和侵襲能力下降，起到減緩腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。本研究并未對TET2與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的更深的機制進(jìn)行探討，下一步應(yīng)針對DNA甲基化對其機制進(jìn)行深入討論。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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