[摘要]目的探討蝮蛇咬傷后中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophilextracellulartraps，NETs）標(biāo)志物嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）以及細(xì)胞游離DNA（cellfreeDNA，cf-DNA）變化和與炎癥標(biāo)志物及組織損傷標(biāo)志物的相關(guān)性。方法選取2021年9月—2022年12月杭州市中醫(yī)院皮膚科收治的蝮蛇咬傷患者作為研究對(duì)象，研究包括36例蝮蛇咬傷患者，20例健康體檢者；比較兩組中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）、細(xì)胞游離DNA（cellfreeDNA，cf-DNA）、血清淀粉樣蛋白A（serumamyloidA，SAA）、C反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-to-lymphocyteratio，NLR）、肌酸激酶（creatinekinase，CK）、肌酸肌酶同工酶（creatinekinase-MB，CKMB）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartictransaminase，AST）和乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）水平，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)并利用Python軟件編寫代碼繪制熱力圖、箱線圖，分析中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與NETs標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物和組織損傷標(biāo)志物之間的相關(guān)性。結(jié)果蝮蛇咬傷后中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，NETs標(biāo)志物NE、cf-DNA升高，CRP、SAA、NLR、AST升高，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低。蝮蛇咬傷后中性粒細(xì)胞數(shù)值與NE酶、cf-DNA血清含量呈正相關(guān)，而與炎標(biāo)志物CRP和SAA之間沒(méi)有明顯相關(guān)性；而CRP與SAA、CKMB與LDH強(qiáng)正相關(guān)，CK與NE、SAA與NE之間呈正相關(guān)，淋巴細(xì)胞數(shù)與NLR呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論蝮蛇咬傷可能引起NETs水平上升，促進(jìn)炎癥加重和組織損傷。

[關(guān)鍵詞]蝮蛇咬傷；中性粒細(xì)胞；中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)；血清淀粉樣蛋白A

[中圖分類號(hào)]R459.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.20.004

Clinicalstudyontheeffectsofsnakebitesonneutrophiltraps（NETs）andinflammatorydamage

YUTao，YUANChenda，YANGMin

DepartmentofDermatology，HangzhouHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310007，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethechangesinneutrophilsandtheirextracellulartrap（NETs）markers，includingneutrophilelastase（NE）andcell-freeDNA（cf-DNA），afterGloydiusbrevicaudusbitenandtheircorrelationwithinflammatoryandtissuedamagemarkers.MethodsAtotalof36patientsbitenbyGloydiusbrevicaudusand20healthyindividualswereincludedinthestudyfromSeptember2021toDecember2022atHangzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine.Neutrophilcount，lymphocytecount，neutrophil-to-lymphocyteratio（NLR），C-reactiveprotein（CRP），serumamyloidA（SAA），aspartateaminotransferase（AST），lactatedehydrogenase（LDH），creatinekinase（CK），creatinekinase-MB（CKMB），cf-DNA，andNElevelswerecomparedbetweenthetwogroups.Pearsoncorrelationcoefficientswerecalculated，andaheatmapandboxplotweregeneratedusingPythonsoftwaretoanalyzethecorrelationbetweenneutrophilcountandNETsmarkers，inflammatorymarkers，andtissuedamagemarkers.ResultsAfterGloydiusbrevicaudusbiten，Neutrophilcount，NE，cf-DNA，CRP，SAA，NLR，andASTwereelevated，whilelymphocytecountwasdecreased.TherewasageneralpositivecorrelationbetweenNeutrophilcountandNE，aswellascf-DNA/NETsserumlevels.However，therewasnosignificantcorrelationbetweenNeutrophilcountandinflammatorymarkersCRPandSAA.CRPwasstronglypositivelycorrelatedwithSAA，andCKMBwasstronglypositivelycorrelatedwithLDH.CKwashighlypositivelycorrelatedwithNEandSAAwashighlypositivelycorrelatedwithNE.LymphocytecounthadastrongnegativecorrelationwithNLR.ConclusionGloydiusbrevicaudusbitenmayresultinanincreaseinNETslevelsinneutrophils，promotinginflammationexacerbationandtissuedamage.

[Keywords]Gloydiusbrevicaudusbites;Neutrophils;Neutrophilextracellulartrap;SerumamyloidA

蝮蛇作為我國(guó)主要蛇種之一，其毒液可直接損害皮膚和肌肉組織細(xì)胞，促進(jìn)多種炎癥因子釋放，從而引起炎癥反應(yīng)和組織損傷。雖然盡早使用抗蛇毒血清免疫球蛋白中和體內(nèi)游離性蛇毒是國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的唯一特效救治方案[1]。由于抗蛇毒血清對(duì)于已與組織結(jié)合的蛇毒無(wú)中和效應(yīng)，蛇毒引起的組織器官損傷無(wú)法通過(guò)抗蛇毒血清進(jìn)行治療，并且抗蛇毒血清無(wú)法抑制毒蛇咬傷引起的組織破壞[2-3]。前期研究已發(fā)現(xiàn)蝮蛇咬傷后肢體腫脹發(fā)生率高[4]。因此，探索蝮蛇咬傷后肢體腫脹發(fā)生機(jī)制，減輕炎癥和外周肌肉組織損傷是蝮蛇咬傷救治面臨的難點(diǎn)。

中性粒細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的重要成分，其參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫防御。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophilextracellulartraps，NETs）是中性粒細(xì)胞釋放的一種細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)中性粒細(xì)胞可以俘獲病原微生物并清除?，F(xiàn)有的少量研究表明NETs的這種網(wǎng)狀捕獲結(jié)構(gòu)可能引起毒蛇咬傷后蛇毒毒液在局部的蓄積，從而參與炎癥反應(yīng)和組織損傷[5-6]。然而，目前對(duì)于蝮蛇咬傷后的水平變化和與炎癥及組織損傷相關(guān)性的研究還較少。因此本研究擬通過(guò)檢測(cè)蝮蛇咬傷后NETs標(biāo)志物和炎癥損傷標(biāo)志物血清水平，分析兩者的相關(guān)性，明確NETs對(duì)蝮蛇咬傷后炎癥和組織損傷的影響，探討蝮蛇咬傷后肢體腫脹和功能異常中的NETs機(jī)制，為蝮蛇咬傷引起炎癥和組織損傷的治療策略提供新思路。

本研究主要檢測(cè)蝮蛇咬傷患者外周血中NETs標(biāo)志物嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）以及細(xì)胞游離DNA（cellfreeDNA，cf-DNA）濃度，炎癥指標(biāo)血清淀粉樣蛋白A（serumamyloidA，SAA）和C反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）濃度、中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和比值（neutrophil-to-lymphocyteratio，NLR）等，組織損傷標(biāo)志物肌酸激酶（creatinekinase，CK）、肌酸肌酶同工酶（creatinekinase-MB，CKMB）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartictransaminase，AST）和乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）濃度，分析NETs在蝮蛇咬傷后的變化和與炎癥反應(yīng)以及組織損傷標(biāo)志物之間的相關(guān)性。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取筆者醫(yī)院皮膚科2021年9月至2022年12月蝮蛇咬傷患者36例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合毒蛇咬傷診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者能夠識(shí)別毒蛇種類且與標(biāo)準(zhǔn)江浙蝮蛇圖片比對(duì)一致，或患者將毒蛇（活體或死體）帶至門診，經(jīng)首診醫(yī)生辨別為蝮蛇而明確為蝮蛇咬傷，咬傷后未接受任何藥物治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者入院前接受藥物治療者，包括口服、外用和靜脈、肌肉注射藥物等；②近期有急性感染史。蝮蛇咬傷組36例患者中男22例，女14例，年齡8～75歲，平均（53.27±16.34）歲。對(duì)照組選擇同期接受健康檢查的志愿者共20名，其中男性11名，女性9名，年齡33～75歲，平均（50.00±14.13）歲。患者均充分知情并同意。兩組研究對(duì)象的性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：2020KY111）。

1.2檢測(cè)方法

蝮蛇咬傷組患者及對(duì)照組入組后即刻抽取肘靜脈血液，使用血細(xì)胞分析儀和生化分析儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)、CRP、SAA、AST、LDH、CK、CKMB濃度。

另備份蝮蛇咬傷患者和健康者肘靜脈血離心后取血漿放置于–80℃冰箱中保存。檢測(cè)時(shí)將100μl血漿樣本與PicoGreen熒光染料混合，避光孵育后采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以此計(jì)算標(biāo)本血漿中cf-DNA/NETs濃度。使用人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶ELISA試劑盒檢測(cè)NE濃度水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，使用Python3.9軟件和Pandas、Numpy、Plotly等庫(kù)進(jìn)行分析和繪圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1外周血中NETs標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物和組織損傷標(biāo)志物水平比較

蝮蛇咬傷患者外周血中NETs標(biāo)志物NE和cf-DNA、中性粒細(xì)胞數(shù)值、CRP、SAA和NLR明顯升高，淋巴細(xì)胞數(shù)值與對(duì)照組比較顯著降低，AST與對(duì)照組比較顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2外周血中NETs標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物和組織損傷標(biāo)志物水平之間的相關(guān)性

蝮蛇咬傷后中性粒細(xì)胞數(shù)值與NE酶、cf-DNA/nets血清含量呈正相關(guān)，而與CRP和SAA無(wú)相關(guān)性，而CRP與SAA、CKMB與LDH呈正相關(guān)，CK與NE、SAA與NE之間呈正相關(guān)，淋巴細(xì)胞數(shù)與NLR呈負(fù)相關(guān)（圖1）。

2.3不同中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)下蝮蛇咬傷患者上述標(biāo)志物之間相關(guān)性的變化

以中性粒細(xì)胞數(shù)作為分層控制變量，NE與cf-DNA血清含量、淋巴細(xì)胞數(shù)與NLR、NE與SAA之間相關(guān)性增強(qiáng)，而SAA與CRP、LDH與CKMB、NE與CK之間相關(guān)性明顯下降。

3討論

全球每年因毒蛇咬傷繼發(fā)嚴(yán)重疾病人數(shù)為180萬(wàn)～270萬(wàn)，因毒蛇咬傷致死人數(shù)高達(dá)約9.5萬(wàn)，致殘致畸人數(shù)高達(dá)30萬(wàn)[5]。毒蛇咬傷是我國(guó)南方地區(qū)夏秋季節(jié)常見的急危重癥，每年毒蛇咬傷達(dá)10萬(wàn)人次，其中73%為中青年；蛇傷致喪失勞動(dòng)能力者約為25%～30%，蛇傷致殘率可達(dá)6.85%，是危害我國(guó)農(nóng)民健康的主要災(zāi)害性疾病之一[6]。

蝮蛇屬于混合毒類蛇，蛇毒成分主要為出血毒素、凝血毒素、細(xì)胞毒素、肌肉毒素和少量的神經(jīng)毒素，咬傷后主要表現(xiàn)為局部肢體腫脹，而皮膚創(chuàng)面壞死和內(nèi)臟主要器官的損害發(fā)生率不高。蝮蛇咬傷引起的感染和炎癥反應(yīng)以及蛇毒對(duì)機(jī)體組織的破壞在臨床上主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞和常規(guī)的炎癥標(biāo)志物如CRP等以及組織損傷標(biāo)志物CK等升高。此外，NLR是中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞數(shù)量之比，越來(lái)越多研究中被用作炎癥狀態(tài)的評(píng)估指標(biāo)。但在毒蛇咬傷中NLR的研究還太少，有限的臨床研究發(fā)現(xiàn)毒蛇咬傷后隨著NLR升高其并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，因此可以作為預(yù)測(cè)臨床結(jié)局的重要指標(biāo)[7]。SAA是一種急性相蛋白，在炎癥反應(yīng)中迅速升高。與目前廣泛使用的C反應(yīng)蛋白相比，SAA通常是一種更敏感的炎癥標(biāo)志物[8]。

NETS在2004年被Brinkmann等[9]發(fā)現(xiàn)，是一種中性粒細(xì)胞有別于傳統(tǒng)凋亡和壞死的胞外捕獲和殺滅病原體的方式，又稱為NETs的形成（NETosis）。在該種方式中，中性粒細(xì)胞可以在一定刺激條件下被激活，經(jīng)歷細(xì)胞核脫顆粒、染色質(zhì)去凝集、核膜脫離、顆粒膜解體、核質(zhì)與胞質(zhì)混合，最后在細(xì)胞膜破裂后釋放出上述混合物構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以吸附和殺滅各種病原微生物[10]。該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成分主要為DNA和抗微生物蛋白及蛋白酶類，后者主要為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶NE和組蛋白。

NETs含量與功能變化主要依靠對(duì)NETs主要成分和形成關(guān)鍵蛋白進(jìn)行測(cè)定，包括cfDNA/NETs和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶NE。Meta分析提示NETs形成的過(guò)程可以造成節(jié)肢動(dòng)物毒液在咬傷部位積聚，導(dǎo)致明顯的局部壞死，推測(cè)可能是蜘蛛、蝎子、蜈蚣等咬傷引起局部組織損傷的最主要途徑之一[11]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛇毒可引起小鼠鼠尾微血管血栓，而通過(guò)抑制NETs形成關(guān)鍵酶可以減少蛇毒毒液積聚和血栓形成，推測(cè)引起毒素局部積聚的主要機(jī)制與NETs產(chǎn)生的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻塞局部微血管、阻止毒液進(jìn)入循環(huán)有關(guān)。這種局部毒素持續(xù)聚積，可降解細(xì)胞外基質(zhì)包括結(jié)構(gòu)蛋白（膠原蛋白、層黏連蛋白和纖維黏連蛋白分子）和結(jié)構(gòu)糖胺聚糖透明質(zhì)酸，細(xì)胞外基質(zhì)完整性的喪失會(huì)破壞組織和血管基底膜的穩(wěn)定性，從而引發(fā)局部組織持續(xù)性腫脹和功能異常[12]。

本研究中蝮蛇咬傷后患者外周靜脈血中性粒細(xì)胞數(shù)明顯上升，NETs的標(biāo)志物NE和cf-DNA水平表達(dá)增高，并且炎癥相關(guān)標(biāo)志物CRP、SAA和NLR同時(shí)上升，組織損傷標(biāo)志物AST升高。而通過(guò)相關(guān)性分析表明蝮蛇咬傷后NETs標(biāo)志物與上述炎癥和組織損傷標(biāo)志物之間有相關(guān)性，且相關(guān)性受中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)影響，有基于此本研究認(rèn)為NETs參與了蝮蛇咬傷后炎癥反應(yīng)和組織損傷。因此，筆者推測(cè)在蝮蛇咬傷的治療中，積極抑制NETs的形成對(duì)于減輕蝮蛇蛇毒引起的肢體腫脹具有可行性。由于本研究?jī)H通過(guò)檢測(cè)蝮蛇咬傷后部分炎癥和組織損傷標(biāo)志物的外周血清水平，初步分析出NETs和炎癥及組織損傷之間的關(guān)系，受臨床樣本量不足的限制，本次研究存在一定局限，后期還將通過(guò)臨床大樣本量觀察和動(dòng)物模型及細(xì)胞分子水平對(duì)其存在的機(jī)制進(jìn)行更深入研究，以期為蝮蛇咬傷的治療提供更優(yōu)化的方案。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–04–25）

（修回日期：2024–05–12）