摘要：[目的]旨在研究不同NaCl脅迫條件下‘心文41號(hào)’（Juglans cordiformis ‘Xinwen No．41’）核桃幼苗的生理特性及離子轉(zhuǎn)運(yùn)、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)信號(hào)基因表達(dá)的響應(yīng)差異。[方法]采取盆栽控鹽的方法，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的‘心文41號(hào)’核桃幼苗作為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)置100、150、200 mmol．L-13個(gè)NaCl濃度進(jìn)行處理，同時(shí)以清水作為對(duì)照組（CK）。經(jīng)過20 d的脅迫處理，對(duì)幼苗的表型、光合等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，通過非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）評(píng)估了根系Na+、K+、H+通量。提取葉片和根部的RNA測(cè)定MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)。通過冗余分析（RDA）探究了生理指標(biāo)與基因表達(dá)之間的相關(guān)性，旨在揭示心形核桃幼苗對(duì)鹽脅迫調(diào)節(jié)機(jī)制的反應(yīng)特征。[結(jié)果]隨著NaCl濃度增加，心形核桃幼苗的根系體積和總生物量顯著減少，葉片出現(xiàn)枯黃和萎蔫現(xiàn)象。光合生理參數(shù)（凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度）呈下降趨勢(shì)，胞間C02濃度逐漸增加。葉片和根系中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，脯氨酸（Pro），丙二醛（MDA）和過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）含量均出現(xiàn)不同程度的增加，根系中Na、含量顯著積累，隨鹽濃度增加其外排趨勢(shì)明顯，葉片中K、外排和H、內(nèi)流以維持胞內(nèi)滲透勢(shì)的穩(wěn)態(tài)。耐鹽相關(guān)基因質(zhì)膜Na、／H、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Salt Overly Sensitive，SOS1）在葉片表達(dá)量高于根系，液泡膜Na、／H、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體1（NHXl）呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)，且液泡H+-ATPase c亞基（VHA-C1）在根系中顯著上調(diào)。在100 mmol·L-1NaCl濃度脅迫下，WRKY65（WRKY transcription factor 65）、MKK9（Mitogen-activated protein kinase kinase 9）和MPK3（Mitogen-activated protein kinase 3）基因的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，且葉片中的表達(dá)量顯著高于根系。[結(jié)論]NaCl脅迫條件下，心形核桃根系受脅迫影響大于葉片，JrSOS1、JrNHX1、JrNHX2與抗鹽能力密切相關(guān)，是作為抵御鹽脅迫的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：心形核桃；NaCl脅迫；基因表達(dá)；非損傷微測(cè)技術(shù)；冗余分析

中圖分類號(hào)：S722;S727.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2024）05-0105-11

土壤鹽漬化作為重要的非生物因素，影響了全球近20%的耕地和1/3的灌溉地區(qū)。我國(guó)鹽漬土主要集中于西北的干旱和半干旱地區(qū)、華北和東部沿海地區(qū)，嚴(yán)重制約著農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和可持續(xù)發(fā)展。NaCl脅迫初期通過滲透調(diào)節(jié)抑制植物生長(zhǎng)，隨后導(dǎo)致離子失衡和氧化壓力加劇，從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

為應(yīng)對(duì)NaCl脅迫，植物進(jìn)化出一系列適應(yīng)機(jī)制，包括離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。通常耐鹽品種的根中Na+濃度較低，K+高于鹽敏品種，且大量元素在葉和莖積累，證明耐鹽品種有更強(qiáng)的離子傳輸能力。Na+（K+）／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體分別是定位在質(zhì)膜和液泡膜的跨膜蛋白，其中質(zhì)膜定位的Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體鹽過度敏感蛋白（SOSl）屬于NHX型Na+（K+）／H+交換家族；NHXs作為液泡膜中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，將過量的Na、從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到液泡中貯存；VHA-c作為V-ATPase亞基與NHX2異位共表達(dá)可促進(jìn)K+的吸收，在棉花（Gossypium hirsutum L．）、香蕉（Musa nana L）中均發(fā)現(xiàn)SOS1、NHX1基因在鹽脅迫下顯著表達(dá)，有助于維持離子穩(wěn)態(tài)的內(nèi)部機(jī)制；向日葵（Helianthus annuus.L）中NHX2與VHA-c1基因在鹽脅迫下異位共表達(dá)可促進(jìn)水稻（Oryza sativa.L）的生長(zhǎng)。此外，通過積累Pro和可溶性蛋白（Soluble protein，sp）等物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)NaCl脅迫的滲透失衡。植物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶APX、POD、SOD作為線粒體和葉綠體的主要產(chǎn)物，能減輕ROS產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。MAPK級(jí)聯(lián)途徑在植物逆境響應(yīng)的調(diào)控方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，H2O2可作為信號(hào)分子觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高了抗氧化酶的活性。MAPK接收MAPKK磷酸化傳遞的信號(hào)，進(jìn)入細(xì)胞核與TFs相互作用可調(diào)控下游基因的表達(dá)，直接或間接調(diào)控WRKY轉(zhuǎn)錄因子，顯著增強(qiáng)了抗逆性并減輕氧化脅迫。在擬南芥（Arabidopsis thaliana.L）中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下MPK3和MKK9基因上調(diào)在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用；煙草（Nicotiana．L）中WRKY65基因過表達(dá)增強(qiáng)耐鹽性。冗余分析可用來(lái)探究生理參數(shù)與基因之間的相關(guān)性，從而對(duì)植株耐鹽性的主要調(diào)控基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，在桉樹（Eucalyptusspp.）中應(yīng)用了這一方法。

核桃是重要的堅(jiān)果和木本糧油樹種，是我國(guó)戰(zhàn)略經(jīng)濟(jì)林種，在山區(qū)農(nóng)民扶貧中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。但在鹽脅迫導(dǎo)致核桃生理病害，產(chǎn)量下降，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。因此，培育抗鹽堿能力強(qiáng)的核桃砧木品種是有效利用和改良鹽堿地資源的主要手段。心形核桃（Juglans cordiformis Max.）屬于胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans），于20世紀(jì)30年代引入我國(guó)，作為抗性砧木具有廣泛的應(yīng)用前景。然而目前研究多集中于核桃的抗旱和抗寒機(jī)制，對(duì)耐鹽機(jī)制研究較少，且心形核桃的研究未見報(bào)道。為改善中國(guó)核桃砧木單一的現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)選取心形核桃后代‘心文41號(hào)’（Juglans cordiformis‘Xinwen No.41’）作為試驗(yàn)材料，通過盆栽控鹽的方法探究幼苗響應(yīng)NaCl脅迫的生理機(jī)制，并結(jié)合耐鹽基因的表達(dá)分析，旨在為篩選核桃耐鹽砧木提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與鹽處理

‘心文41號(hào)’核桃選自遼寧特色經(jīng)濟(jì)林育種國(guó)家長(zhǎng)期科研基地。2022年4月中旬，經(jīng)過3個(gè)月層積催芽處理的種子播種在含有泥炭土：蛭石：珍珠巖混合物（v：v：v=3：1：1）的花盆中（直徑18 cm，高25 cm）。待幼苗長(zhǎng)至45 d時(shí)，即平均株高達(dá)30 cm、平均地徑4.7 mm、平均復(fù)葉4對(duì)時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分為4個(gè)NaCl濃度梯度0（CK）、100、150、200 mmol·L-1進(jìn)行處理，每個(gè)處理3組，每組6株。鹽溶液分3次添加：6月19日、6月21日和6月25日，每次澆300 mL，總計(jì)900 mL。在每個(gè)盆的底部放置一個(gè)托盤，將流出的溶液倒回盆中以保證鹽分固定。在處理后第20 d，采集植株中上部復(fù)葉第2對(duì)功能葉，進(jìn)行葉片形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)和熒光定量的測(cè)定，采集6條一級(jí)側(cè)根進(jìn)行除相對(duì)含水量和光合參數(shù)外的指標(biāo)測(cè)定，并于-80℃冰箱中保存。

1.2 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

總生物量（W總）的測(cè)定：采集植株的根系和葉片洗凈，于105℃殺青15 min，80℃烘干至質(zhì)量恒定，分別測(cè)定地上部干質(zhì)量（Stem dryweight，WS）和地下部干質(zhì)量（Root dry weight，WR）及根冠比（Root/Stem，R/S）；采用排水法測(cè)定根系體積（Root volume，VR）；最長(zhǎng)側(cè)根長(zhǎng)（Longest lateral root length，LLR）：在平整桌面放置托盤，倒入少量水保持淺水層，將根在水中拉直，記錄最長(zhǎng)側(cè)根的長(zhǎng)度。

W總＝WR+WS；根冠比（R/S）=WR/WS

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

相對(duì)含水量（Leaf Relative water content，LRWC）使用飽和稱重法測(cè)定；使用高分辨冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Regulus 8230，日本日立）參考楊國(guó)一的方法掃描葉片內(nèi)表皮氣孔，用ImageJ測(cè)量氣孔長(zhǎng)（SL） /μm、寬（SW）／μm、氣孔孔徑（SW/SL）。

采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定MDA；用索萊寶試劑盒（BC3595）測(cè)定H2O2含量；Pro含量測(cè)定參考酸性茚三酮比色法；采用氮藍(lán)四唑比色法（NBT法）測(cè)定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性；APX活性測(cè)定參考的方法，使用火焰分光光度計(jì)法測(cè)定葉片和根系中K+、Na+的含量。

使用Li-6400 XT（Ll-COR，Lincoln，NE）測(cè)量?jī)艄夂纤俾剩≒n）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和胞間CO2濃度（Ci）。所有測(cè)量均在晴天上午進(jìn)行（9：00-11：30）。

1.4 NMT測(cè)定根系中Na+、K+和H+流速

使用非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）檢測(cè)（BIO-OO1A3，美國(guó)揚(yáng)格科技公司）根尖部位的Na+、K+和H+流速，具體檢測(cè)參考Chen的方法，將幼苗的根系用蒸餾水清洗3次，每個(gè)根固定在小培養(yǎng)皿中間，在含有0.1 mmol·L-1 NaCl，0.5 mmol·L-1KCl， 0.2 mmol·L-1 CaC12和0.1 mmol·L-1 MgCl2，pH 5.7的測(cè)試液中平衡30 min，將電極靠近根表，測(cè)定距根尖500 μm的分生區(qū)流速變化，并記錄5 min內(nèi)離子的穩(wěn)定流速。

1.5 內(nèi)參基因篩選和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析

本研究使用的參考基因組版本為Juglans_regia．xhhuanglab_v1 .O.genome.fa，共篩選出8個(gè)基因，其中4個(gè)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的基因JrSOS1、JrNHX1、JrNHX2、JrVHA-c1，4個(gè)與MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)相關(guān)的基因JrWRKY48、JrWRKY65、JrMKK9、JrMPK3，探究其在根系和葉片中的表達(dá)情況。使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天源生物科技（北京）有限公司）提取RNA，用TaKaRa（RR037Q）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Primer3.0 Plus軟件為單個(gè)基因設(shè)計(jì)特異引物，以JrGADPH為內(nèi)參基因，計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)錄本的定量采用2-△△Cr法，每個(gè)處理4次重復(fù)，引物見表1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Graphpad Prism 8.0和Excel 2019繪制表格和數(shù)據(jù)。使用IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)生理指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，統(tǒng)計(jì)分析前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)不滿足的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換以滿足方差齊性的標(biāo)準(zhǔn)，p＜0.05被認(rèn)為是顯著，圖片編輯使用Adobe Photoshop2023軟件，使用Canoc05軟件進(jìn)行RDA圖的繪制。

2 結(jié)果

2.1 NaCl脅迫對(duì)心形核桃幼苗形態(tài)及生長(zhǎng)指標(biāo)的觀察和測(cè)定

在100 mmol·L-1鹽處理時(shí)幼苗下部葉片表現(xiàn)出黃化和邊緣焦枯，當(dāng)NaCl濃度為150 mmol·L-1時(shí)，其葉片黃化卷曲程度進(jìn)一步加深，200 mmol·L-1時(shí)有持續(xù)的脫落現(xiàn)象（圖1），說明不同NaCl濃度持續(xù)誘導(dǎo)了幼苗脅迫損傷，且隨著濃度的增加，其癥狀更為明顯。

隨著鹽濃度增加，幼苗的R/S呈下降的趨勢(shì)，與CK相比，150 mmol·L-1和200 mmol·L-1處理與CK相比降低了1.54%和10.77%。當(dāng)鹽濃度達(dá)到200 mmol·L-1時(shí)，與CK相比，其R/S、LRWC、/LR、VR、W總總分別降低了10.77%、19.72%、31 .06%、50.80%、71 .54%（表2）。

2.2 NaCl脅迫對(duì)心形核桃幼苗光合作用的影響

幼苗的氣孔整體呈現(xiàn)松散不規(guī)則排列，隨著脅迫濃度的增加，其表面氣孔結(jié)構(gòu)的破壞更嚴(yán)重（圖2A）。對(duì)氣孔形態(tài)定量分析，與CK相比，200 mmol·L-1時(shí)氣孔長(zhǎng)（SL）上升了20.96%，而氣孔寬（SW）顯著下降了19.15%（圖2B、C）。當(dāng)NaCl濃度大于100 mmol·L-1，氣孔孔徑（SW/SL）顯著下降，200 mmol·L-1時(shí)與CK相比降低了31 .33%（圖2D）。

隨著NaCl脅迫加劇，幼苗的Pn，Tr，Gs均呈下降的趨勢(shì)，在150 mmol·L-1鹽處理下與CK相比分別下降了50.89%、44.26%、50.00%（圖2E～G），而C；持續(xù)升高，200 mmol·L-1時(shí)較CK增加70.0%，差異顯著（圖2H）。與CK相比，鹽濃度顯著抑制了SPAD值，經(jīng)100、150、200 mmol·L-1鹽處理的SPAD值分別下降了23.35%、46.88%、62.62%（圖21）。

2.3 NaCl脅迫對(duì)心形核桃幼苗滲透調(diào)節(jié)物、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及抗氧化酶的影響

葉片Pro含量在100 mmol·L-1鹽處理時(shí)達(dá)到峰值，與CK相比增加了76.17%；根中Pro含量在200 mmol·L-1時(shí)與CK相比增加了129.92%．差異顯著（圖3A）。200 mmol·L-1鹽處理時(shí)葉片中MDA含量達(dá)到最大值，與CK相比增加了37.27%；100 mmol·L-1處理時(shí)根中MDA含量達(dá)到最大值，與CK相比增加了51 .43%（圖3B）；葉片中的H202含量在鹽濃度200 mmol·L-1時(shí)與CK相比增加了72.02%；在根中則隨鹽濃度增加顯著上升，100、150、200 mmol·L-1時(shí)增加了65.56%、93.8g%、138.86%（圖3C）。葉片中SOD活性在150 mmol·L-1時(shí)到達(dá)最大值，與CK相比增加了62.44%；而根中SOD活性在100、150、200 mmol·L-1鹽處理時(shí)較CK相比增加了23.05%、35.80%、39.51%（圖3D）；POD活性和APX活性在根中積累量均低于葉片（圖3E、F）。

2.4 NaCl脅迫對(duì)心形核桃幼苗根系Na+、K+、H+流速的影響

NaCl脅迫時(shí)Na、流向表現(xiàn)為外排，在100mmol·L-1鹽處理時(shí)Na、凈流量介于35.61～624.33nmol·m-2·s-1，隨鹽濃度增加，其凈流量呈上升趨勢(shì)（圖4A）。在200 mmol·L-1 NaCl脅迫時(shí)Na+平均凈流量達(dá)到1 007.98 nmol·m-2·s-1，較CK顯著增加了3 140.05%（圖4B）。K+流向表現(xiàn)為外排趨勢(shì)，隨鹽濃度增加，K+凈流量的上升趨勢(shì)低于Na+。在200 mmol·L-1時(shí)其凈流量達(dá)到最大，介于577.3～989.5 nmol·m-2·s-1（圖4C）；100、150、200 mmol·L-1鹽處理時(shí)K+平均凈流量較CK相比分別增加了228.62%、457.25%、685.87%（圖4D）。

隨著鹽濃度增加，H+內(nèi)流趨勢(shì)更加明顯。200 mmol·L-1時(shí)凈流量達(dá)到最大，介于-9.62～-7.19 nmol·m-2·s-1（圖4E），150、200 mmol·L-1時(shí)與CK相比分別增加了925.58%、1 532.25%（圖4F）。

2.5 NaCl脅迫對(duì)心形核桃幼苗根系和葉片中Na+，K+含量及分布的影響

隨著鹽濃度增加，Na+含量在根系中顯著增加，100、150、200 mmol·L-1時(shí)與CK相比分別增加了163.7g%、243.74%、475.70%；在葉片中呈先升高后下降的趨勢(shì)，150 mmol·L-1時(shí)達(dá)到峰值，較CK增加了345.80%（圖5A）。葉片中的K、含量顯著高于根系，葉片中K+含量在150 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，與CK相比增加了43.67%。而根系的K+含量變化幅度較小，100、150、200 mmol·L-1處理時(shí)與CK相比分別降低了4.46%，1.50%．3.00%（圖5B）。此外，NaCl脅迫下根系和葉片中K+/Na、比值顯著降低，葉片中100、150、200 mmol·L-1鹽處理時(shí)相較CK下降了55.89%、64.85%、53.41%，根系較CK分別降低了63.89%、75.08%、83.10%（圖5C）。綜上所述，根系中Na+積累量高于葉片，而K．和K+/Na+低于葉片。

2.6 NaCl脅迫下心形核桃幼苗生理指標(biāo)的相關(guān)性

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉片SW/SL與Gs、Tr呈顯著正相關(guān)；SPAD與POD呈顯著負(fù)相關(guān)；Pn與SOD、POD、APX活性、MDA呈負(fù)相關(guān)；K+/Na+與Na+含量、POD活性、Ci呈負(fù)相關(guān)（圖6A）。根中生理指標(biāo)的相關(guān)性得出，LLR、VR與Pro、MDA、H2O2含量呈顯著負(fù)相關(guān)；Na+平均速率與K+平均速率呈顯著正相關(guān)，H+平均速率與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6B）。

2.7 NaCl脅迫對(duì)心形核桃幼苗離子轉(zhuǎn)運(yùn)及MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)模式

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JrSOS1基因在葉片中表達(dá)量隨鹽濃度增加呈先升后降的趨勢(shì)，100 mmol·L-1處理時(shí)達(dá)到峰值，與CK相比增加了39.17%；根系中150mmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高，較CK增加了170.76%（圖7A）。Jr～HX1基因在根系中100 mmol·L-1鹽處理時(shí)差異顯著，與CK相比增加了499.30%（圖7B）。JrNHX2基因在100 mmol·L-1時(shí)葉片和根系中表達(dá)量均顯著增加，與CK相比分別增加了470.40%，70.19%（圖7C）。JrVHA-c1在報(bào)系中受到顯著誘導(dǎo)，100、150、200 mmol·L-1時(shí)較CK增加了465.83%，442.86%，131.87%（圖7D）。

根系中JrWRKY48基因在150 mmol·L-1時(shí)達(dá)到顯著水平，與CK相比增加了59.06%：葉片中表達(dá)量隨鹽濃度增加呈上升趨勢(shì)，200 mmol·L-1處理時(shí)較CK增加了101.13%（圖7E）。JrWRKY65基因在葉片中100 mmol·L-1時(shí)受到顯著誘導(dǎo)，與CK相比增加了78.24%；根中在150 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高，較CK增加了174.42%（圖7F）；葉片中JrMKK9基因在150 mmol·L-1處理時(shí)達(dá)到峰值，與CK相比增加了317.60%（圖7G）；JrMPK3基因在200 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量最大，較CK增加1478.32%（圖7H）。

2.8 MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)及離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控基因與生理指標(biāo)的冗余分析

利用冗余分析（RDA）探究基因與生理指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葉片中K+/Na+和JrVHA-c1基因顯著正相關(guān)，基因JrSOS1與SW/SL、Pn、Tr顯著正相關(guān)（圖8A）;繇中JrSOS1、JrMKK9和JrWRKY48基因是影響Na+和K+平均流速的主要基因（圖8B），且與H+平均流速、VR、R/S高度負(fù)相關(guān)。此外，JrVHA-c1和JrMPK3基因分別通過調(diào)控葉片的Gs和抗氧化系統(tǒng)來(lái)提高耐鹽性（圖8A），而JrWRKY65和JrMKK9基因調(diào)控根系的MDA和H2O2含量提高耐鹽性，以上基因分別在葉片和根中的RDA1軸有最長(zhǎng)的投影長(zhǎng)度。

3 討論

植物受到鹽脅迫時(shí)會(huì)造成植物失水，生物量可以直接反映植物受鹽脅迫的損傷程度，可作為鹽脅迫特征的可靠指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度增加，W總、LLR、 VR均顯著降低，表明鹽脅迫造成植株根系吸收水分受阻，抑制了根系的生長(zhǎng)發(fā)育。高鹽脅迫顯著降低了東部黑核桃（JuglansNigraL.）、接骨木（Sambucus canadensisL.的LRWC，而在本實(shí)驗(yàn)中，100 mmol·L-1處理下核桃幼苗的LRWC呈上升趨勢(shì)，隨后下降，植株葉片能承受一定的鹽濃度，增強(qiáng)吸收和儲(chǔ)存水分，然而可溶性鹽分的持續(xù)增加減少了對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，阻礙了植物與水分間的平衡關(guān)系。Pn的下降受氣孔和非氣孔因素的影響，低鹽脅迫下的氣孔特性作為Pn值下降的主導(dǎo)因素。本研究中，SW、SW/SL、Gs隨NaCl濃度增加顯著下降，而Ci顯著上升，表明鹽環(huán)境下氣孔的關(guān)閉減緩了水分的散失，但這一作用影響了CO2吸收和同化的效率，減慢了光合進(jìn)程從而抑制植株的生長(zhǎng)；相關(guān)性分析表明，Pn與Tr和Gs呈顯著正相關(guān)，可見鹽脅迫下氣孔因素是影響Pn下降的主要原因，在開心果砧木（Pistacia vera L．）中也證實(shí)了這一點(diǎn)。

鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致ROS的大量積累，阻礙電子傳遞導(dǎo)致氧化應(yīng)激，伴隨膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。本研究中，隨NaCl濃度的增加，幼苗根系中積累的MDA含量高于葉片，根系作為直接接觸鹽分的部位，產(chǎn)生過量的ROS使根系細(xì)胞膜的通透性增大，而葉片ROS的清除更為及時(shí)，在裸果木（Gymnocarpos przewalskii Maxim.）中也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)。鹽脅迫下植物體內(nèi)抗氧化酶活性的高低可反映植物抵御逆境的能力，SOD作為清除ROS的第一道防線，POD和APX共同作為清除ROS的第二道防線將H2O2維持在較低水平。本研究中，隨NaCl濃度的增加葉片中SOD、POD、APX活性均高于根系，葉片進(jìn)行光合作用等過程雖產(chǎn)生大量ROS，但仍具有較強(qiáng)的抗氧化性能，而根系長(zhǎng)期接觸土壤鹽分造成細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重，這與真紅樹種（True mangrove）的研究結(jié)果一致。

植物會(huì)啟動(dòng)多種防御反應(yīng)如將Na+從根中排出，以及Na+區(qū)隔化于液泡中等多個(gè)策略。本研究中，根系積累的Na+含量顯著高于葉片，表明幼苗的根系對(duì)Na+有一定的屏障作用，可以減少對(duì)地上部分的損害，保證葉片進(jìn)行正常的生理活動(dòng)和養(yǎng)分吸收，這與胡楊（Populus euphratica Oliv.）的研究結(jié)果一致。K+在維持陰陽(yáng)離子的平衡之間起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，葉片中K+含量隨NaCl濃度增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，而根系中K+外排速率增加，低鹽濃度幼苗根系仍具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)K+的能力；而隨著NaCl濃度的增加，幼苗轉(zhuǎn)運(yùn)K．能力減慢，這與白柳（Salix a/ba L．）中的研究結(jié)果一致。SOS1能將過量的Na+排出細(xì)胞，NHXs能將過量的Na+逆濃度梯度運(yùn)至液泡中，以維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下葉片中JrSOS1基因的表達(dá)量顯著增加且高于根系，表明JrSOS1基因?qū)⑷~片細(xì)胞質(zhì)膜中過量的Na+區(qū)隔化，減輕離子毒害。JrNHX1和JrNHX2基因在根系中顯著上調(diào)，表明NHXs基因主要在根系中發(fā)揮作用，將過量的Na+泵入到液泡中，誘發(fā)了外向型K+通道，引起K+外排，這與JIANG XY等人的研究結(jié)果一致。NaCI脅迫下JrWRKY65基因在葉片中高度表達(dá)，同時(shí)與葉片Pro含量和JrSOS1基因高度相關(guān)，這表明JrWRKY65基因可能通過滲透調(diào)節(jié)以及維持Na+、H+穩(wěn)態(tài)提高葉片的耐鹽性，在酸棗中WRKY65基因也發(fā)揮相似的功能。

4 結(jié)論

本研究以‘心文41號(hào)’核桃作為試驗(yàn)材料，對(duì)NaCl脅迫條件下不同組織部位的生理變化及耐鹽基因的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，鹽脅迫抑制了氣孔開度以及光合生理參數(shù)，從而減慢了光合進(jìn)程，同時(shí)顯著抑制了根系的生長(zhǎng)。這一過程加劇了氧化應(yīng)激，使細(xì)胞膜透性增大，產(chǎn)生過量的MDA和H2O2等過氧化產(chǎn)物。而葉片相較根系具有較強(qiáng)的抗氧化性能以維持ROS的清除過程。結(jié)合鹽脅迫后不同組織部位中調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)體及MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)根系主要通過介導(dǎo)液泡NHXs基因上調(diào)促進(jìn)Na+的外排和H+的內(nèi)流，而葉片主要通過介導(dǎo)質(zhì)膜SOS1基因促進(jìn)Na+外排，同時(shí)保證K+的吸收來(lái)提高幼苗的耐鹽性。這一結(jié)果為心形核桃NaCl脅迫調(diào)控機(jī)制解析和耐NaCl核桃砧木的篩選提供參考。

（責(zé)任編輯：張研）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2022YFD2200402）國(guó)家級(jí)