摘要：[目的]為明確紅葉楊品種全紅楊與其親本2025楊對葉銹病的抗性差異及其作用機(jī)制。[方法]通過在紅葉楊品種全紅楊和其親本2025楊上人工接種北美柵銹菌，對兩種楊樹的發(fā)病狀況、銹菌基因表達(dá)量、活性氧和抗氧化酶活性的動態(tài)變化進(jìn)行了測定。[結(jié)果]表明兩種楊樹對北美柵銹菌均表現(xiàn)為感病，其中全紅楊為中度感病，2025楊為高度感病。相比全紅楊，銹菌在2025楊葉片內(nèi)發(fā)育更快、潛育期更短、夏孢子堆更大更密。全紅楊的3種抗氧化酶活性（POD、CAT、SOD）均高于2025楊，而2025楊中的活性氧水平高于全紅楊。[結(jié)論]說明全紅楊應(yīng)對銹菌入侵較2025楊能更快的啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)，平衡活性氧水平，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性。

關(guān)鍵詞：紅葉楊；北美柵銹菌；抗銹性

中圖分類號：S763.15 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0178-08

楊樹（Populus spp.）是我國分布廣泛，具有重要經(jīng)濟(jì)價值的木材資源。美洲黑楊（Populusdeltoides W．Bartram ex Marshall）原產(chǎn)于北美洲，20世紀(jì)70年代我國引進(jìn)種植，現(xiàn)已成為我國商業(yè)化楊樹的主栽品種和雜交育種親本。紅葉楊品種“全紅楊”（P．deltoids cv.‘Quanhong’）是2000年春由1棵美洲黑楊“2025”（P.deltoides cv．‘Zhonglin 2025’）平茬苗上發(fā)現(xiàn)的一個紫紅色芽經(jīng)過兩次芽變育種而來，該品種的培育填補(bǔ)了楊樹彩葉品種的空白。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，許多與花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量的上調(diào)使全紅楊葉片呈現(xiàn)鮮艷的紫紅色，使該品種具備更高的觀賞價值，因此在園林綠化、景觀布局中發(fā)揮了重要作用。

由柵銹菌屬（Melampsora）真菌引起的楊樹葉銹病為楊樹重要病害之一。大量銹菌寄生于楊樹葉部，嚴(yán)重影響楊樹光合作用，導(dǎo)致寄主樹勢衰弱，進(jìn)而誘發(fā)其他病蟲害侵染，可造成楊樹干重減輕2g%～32%，材積損失31 %～42%。美洲黑楊及其歐美楊雜交種對國內(nèi)普遍流行的楊樹葉銹病菌（M. larici-populina Kleb.）分別表現(xiàn)為免疫和中抗?fàn)顟B(tài)，但近年來，北美柵銹菌（Melampsoramedusae Thum）入侵導(dǎo)致美州楊及其雜交種發(fā)病嚴(yán)重，并在國內(nèi)廣泛傳播，對楊樹產(chǎn)業(yè)和國土生態(tài)安全造成了不良影響。

相比2025楊，紅葉楊田間發(fā)病輕而且晚，大多出現(xiàn)在10月初期；而2025楊發(fā)病大多出現(xiàn)在9月初期，其幼葉也呈紫紅色，通常不發(fā)病。為分析二者抗銹性差異，本研究選擇廣泛栽培的紅葉楊品種“全紅楊”為研究對象，以其親本2025楊為對照，通過人工接種M. medusae后，統(tǒng)計銹菌發(fā)病率，采用化學(xué)組織染色法觀察葉肉組織內(nèi)銹菌的侵染進(jìn)程以及結(jié)合qRT-PCR技術(shù)測定銹菌的基因表達(dá)量，測定楊樹葉片的活性氧含量和防御酶活性等生理指標(biāo)的變化等方法，探究紅葉楊和2025楊對葉銹病的抗性差異和機(jī)制，以期為楊樹彩葉品種抗銹性育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

全紅楊（Populus. deltoids cv.‘Quanhong’，簡稱QHY）和2025楊（P．deltoides cv.‘Zhonglin 2025’，簡稱L2025）1年生苗木購自河南商丘中興苗木有限公司，培養(yǎng)于溫室，相對濕度50%～60%，溫度25℃。

北美柵銹菌（M. medusae，簡稱mmd）單孢子株系采自陜西省寶雞市麟游縣，由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林病理實驗室保存。

1.2 夏孢子接種和病情指數(shù)測定

參考沈闊型9）的方法進(jìn)行人工接種，利用太白楊（P．purdomii Rehd）擴(kuò)繁銹菌并收集夏孢子，制備終濃度為1 × 106 cfu·mL-1的孢子懸浮液，均勻噴施至健康生長的1年生全紅楊和2025楊的葉片上，至葉片有水滴流下，均選擇葉間隔期指數(shù)（LPI，leaf Plastochron index） 5～8的葉片，

以噴施等量無菌水為對照，每個樹種接種5株，每株接種3個葉片，置于黑暗條件下保濕24 h后解除黑暗，轉(zhuǎn)為常規(guī)培養(yǎng)，相對濕度50%～60%，溫度25℃。每天觀察葉片發(fā)病情況，接種8d后統(tǒng)計孢子堆密度，確定寄主反應(yīng)型，每個處理15個重復(fù)。寄主反應(yīng)型分級標(biāo)準(zhǔn)參考曹支敏等的方法，見表1。

1.3 侵染葉片的組織學(xué)染色

參考朱書生等的方法稍作改動：取接種銹菌的紅葉楊與2025楊葉片，剪成1 cm × 1 cm大小的15個方形葉盤置于50 mL離心管中。首先在離心管內(nèi)加入20 mL 100 g·L-1 KOH溶液至完全浸泡葉片，90℃水浴5 min，后用無菌水沖洗干凈；而后加入20 mL 30% H202溶液漂白5 min，后用無菌水沖洗葉表；最后加乳酸于室溫下酸化5 min。加入苯胺藍(lán)染液避光染色3～5 min，染色結(jié)束后用無菌水清洗葉片表面，清洗后將葉片浸泡人乳酸甘油（1：1）中，室溫脫色12 h。用顯微鏡觀察其菌落的染色情況并統(tǒng)計染色區(qū)域面積，計算銹菌侵入率：P=（m／M）×100%，式中：P為銹菌侵入率，m為視野內(nèi)深色區(qū)域面積，M為顯微鏡觀察時視野總面積。

1.4 小麥胚芽凝集素（WGA-Alexa 488）熒光染色

銹菌發(fā)育過程的染色參考莊華的方法稍作改動：采用1.2的方法對兩種楊樹接種銹菌夏孢子，在接種后24、48、96、168 h分別采集葉片樣本，放置于固定透明液（乙醇：冰醋酸體積比=1：1）進(jìn)行脫色，使葉盤綠色完全脫去；將透明過的葉盤用50%的乙醇沖洗1次后蒸餾水漂洗3次，棄去蒸餾水，加入1.5 mL 1 mol·L-1 KOH，高溫高壓處理（121℃，103.4 kPa）5 min使葉片纖維組織變軟，葉肉完全脫去；處理后的樣品用蒸餾水漂洗并轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入10 mL50 mmol·L-1 Tris-HCI（pH=7.0～7.4）緩沖液，浸泡30 min，棄去緩沖液；用20 μg·mL-1的WGA-Alexa 488熒光染料避光染色2h以上，用蒸餾水漂洗3次后用50%甘油保存。處理后樣品的在熒光顯微鏡（Olympus BX-53）下對病菌侵染結(jié)構(gòu)及生長狀況進(jìn)行觀察（激發(fā)光波長450～480 nm，發(fā)射光波長515 nm），每個處理15個重復(fù)。

1.5 葉肉中銹菌基因表達(dá)量測定

參考ZHENG等的方法，選取在銹菌中穩(wěn)定表達(dá)的ITS區(qū)域序列設(shè)計特異性引物，采用1.2的方法對兩種楊樹接種銹菌夏孢子，于Oh（未接種）、24、48、96、168 h采集葉片進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。使用Primer軟件設(shè)計兩對特異性引物：ITS-Mmd-F/ITS-Mmd-R（目的基因）和Q-TUB-Fla-TUB-R（內(nèi)參基因），引物序列見表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用2-△△CT法進(jìn)行相對表達(dá)量分析，每處理5個生物學(xué)重復(fù)I14l。

所用試劑有：植物總RNA提取試劑盒為Omega E.Z.N.A.Plant RNA Kit;反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hifair@V one-step RT-gDNA digestion SuperMixfor qRT-PCR、實時熒光定量試劑Hieff UNICONRUniversal Blue qRT-PCR SYBR Green MasterMix均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。微量核酸蛋白質(zhì)分析儀為NANODROP ONE；反應(yīng)所用儀器為美國伯樂CFX connect。

1.6 生理指標(biāo)測定

參考《植物生理學(xué)指導(dǎo)》。采用1.2的方法對兩種楊樹接種銹菌夏孢子，于Oh（未接種）、24、48、96、168 h采集葉片樣品，錫紙包裹后放入液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱待測。H202含量測定采用鈦復(fù)合物測定法、02-含量測定采用羥胺氧化法、過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法、過氧化氫酶（CAT）活性利用H202的減少量表示，每處理5個生物學(xué)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計整理，利用SPSS Statistics 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用一元方差分析（ANOVA）和Duncan’s多重范圍檢驗進(jìn)行組間的顯著差異分析（p＜0.05），最后用Origin 2021進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅葉楊與2025楊人工接種反應(yīng)比較

室內(nèi)接種后對兩種楊樹的潛育期、孢子堆密度和病情指數(shù)進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計，見表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種銹菌后，兩種楊樹均未出現(xiàn)褪綠或過敏性壞死反應(yīng)；全紅楊在第7天發(fā)病，而2025楊在第6天發(fā)病，全紅楊發(fā)病速度慢于2025楊；全紅楊產(chǎn)孢量較少，每平方厘米葉片上約12.6個孢子堆，夏孢子堆中等大小，多散生（圖1a）；而2025楊產(chǎn)孢量多，每平方厘米葉片上約29.2個孢子堆，夏孢子堆大而密（圖1b），常連接成片。參考表1的反應(yīng)型分級標(biāo)準(zhǔn)，全紅楊表現(xiàn)為中感反應(yīng)（4級），2025楊則表現(xiàn)為高感反應(yīng)（5級）。苯胺藍(lán)染色結(jié)果表明，接種7天后，全紅楊葉肉組織中藍(lán)色菌體結(jié)構(gòu)明顯少于2025楊。統(tǒng)計染色區(qū)域侵染率結(jié)果表明，全紅楊中銹菌侵染率（14.8%）低于2025楊（26.3%）。全紅楊比2025楊發(fā)病更輕，表現(xiàn)為推遲發(fā)病、孢子堆密度小以及侵染率低。

2.2 北美柵銹菌在紅葉楊和2025楊中侵染過程比較

為進(jìn)一步了解銹菌夏孢子侵染全紅楊和2025楊的過程和特征，對侵染不同階段的葉肉組織內(nèi)的銹菌菌體結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，顯微觀察如圖2所示，銹菌夏孢子在楊樹葉片表面萌發(fā)并產(chǎn)生芽管，并在接種1d （24h）后成功從葉片氣孔入侵（圖2a、e）；2d （48h）后銹菌開始在葉肉細(xì)胞內(nèi)發(fā)育產(chǎn)生大量侵染菌絲并侵染鄰近細(xì)胞（圖2b、f）；接種4d （96 h）后菌絲大量繁殖（圖2c、g）；2025楊在接種6d （144 h）后開始產(chǎn)孢，可以觀察到夏孢子堆（圖2d），而全紅楊在接種7d （168d）后開始產(chǎn)孢（圖2h）。銹菌在侵染前期在兩種楊樹中的侵染進(jìn)程基本保持一致，但在2025楊中能更快產(chǎn)孢，且在發(fā)育過程中形成的菌絲團(tuán)和孢子堆都較全紅楊大、產(chǎn)孢量多。

2.3 葉肉組織中銹菌基因表達(dá)量比較

圖3結(jié)果表明，接種銹菌后，隨著時間的推移，銹菌在兩種楊樹葉肉細(xì)胞中的基因表達(dá)量均逐漸升高，2025楊中銹菌的基因表達(dá)量高于全紅楊，且在接種銹菌后4 d（96 h）后到和第7d （168h）銹菌在2025楊中的表達(dá)量顯著高于全紅楊（p＜0.01），整體發(fā)育過程中，2025楊中表達(dá)量均高于全紅楊，說明銹菌在2025楊葉肉組織內(nèi)能夠更快的發(fā)育繁殖。

2.4 紅葉楊和2025楊對銹菌的抗氧化活性指標(biāo)比較

2.4.1 接種銹菌后兩種楊樹活性氧含量的比較

測定兩種楊樹接種銹菌后的H2O2和O2-含量如圖4所示，接種前（0h）健康植株中全紅楊的H2O2和O2-含量均低于2025楊，接種銹菌后24 h內(nèi)，全紅楊中的H2O2含量迅速升高，而后趨于平緩；2025楊中接種前期H2O2含量未發(fā)生明顯變化，24 h后開始升高，96 h達(dá)到峰值，而后開始下降。O2-含量在兩種楊樹感病過程中的變化趨勢呈相反狀態(tài)，全紅楊中O2-含量在接種銹菌后開始下降，48 h后開始逐漸上升，96 h后大幅增長，而2025楊在接種前期02-含量升高，48 h開始下降。

2.4.2 接種銹菌后兩種楊樹抗氧化酶活性動態(tài)變化比較

測定兩種楊樹接種銹菌后的抗氧化酶活性結(jié)果如圖5所示，接種前（0h）健康植株中全紅楊的POD酶活性高于2025楊，接種銹菌后兩種楊樹的POD酶活性變化一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但紅葉楊中的POD酶活性高于2025楊，接種病原24 h內(nèi)，全紅楊和2025楊POD酶活性均迅速升高，并在24 h達(dá)到峰值，24 h后開始下降，但全紅楊中POD酶活性始終處于較高水平。全紅楊中接種前（0 h） CAT酶活性低于2025楊，但二者的變化趨勢總體一致，接種銹菌后24 h內(nèi)兩種楊樹的CAT酶活性均開始上升，且全紅楊漲幅高，在接種后24 h達(dá)到峰值，而后開始下降，在病程中期紅葉楊中CAT酶活性高于2025楊。接種前（0h）健康植株中全紅楊的SOD酶活性高于2025楊，接種銹菌后兩種楊樹中SOD酶活性變化趨勢與POD酶相似，均呈現(xiàn)先升高后降低最后趨于平緩的趨勢，兩者均在接種后24 h達(dá)到峰值，而后開始下降，但全紅楊中SOD活性始終高于2025楊，且在發(fā)病初期增幅更大。在整個病程中，全紅楊的3種抗氧化酶活性總體水平均高于2025楊。

3 討論

抗病性鑒定是抗病育種與植物資源評價工作的重要依據(jù)。本研究采用孢子懸液噴施活體植株對全紅楊和2025楊的抗銹性進(jìn)行了鑒定，表明兩種楊樹均為感病品種，但全紅楊發(fā)病較輕，二者在表型上的差異主要表現(xiàn)在孢子堆密度、孢子堆大小方面，全紅楊較2025楊發(fā)病更遲、夏孢子堆密度更小。

本研究兩種染色結(jié)果顯示，銹菌在2025楊中相較全紅楊有更高的侵染率，成功入侵后能發(fā)育繁殖產(chǎn)生更多的侵染菌絲，產(chǎn)孢量也更高。對葉肉組織內(nèi)的銹菌的基因表達(dá)量進(jìn)行定量測定結(jié)果表明，銹菌入侵葉片后開始發(fā)育繁殖，在整體病程中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，而銹菌入侵后在2025楊葉肉組織內(nèi)發(fā)育繁殖速度比全紅楊中更快，這與Zheng等在太白楊中接種M. larici-populina的葉肉組織中菌體生物量變化趨勢一致。銹菌入侵植物細(xì)胞后發(fā)育繁殖需要吸收寄主大量營養(yǎng)，然而前期研究表明全紅楊中花青素含量遠(yuǎn)高于2025楊，而植物光合作用所需色素葉綠素a和葉綠素b均低于2025楊，這會嚴(yán)重影響全紅楊的光合速率和能量積累，高苗琴等的研究也證實了這一點(diǎn)，因此全紅楊中較低的營養(yǎng)水平可能也是制約銹菌在葉肉組織中發(fā)育繁殖速度的因素之一，這還有待進(jìn)一步研究。

ROS是一系列化學(xué)性質(zhì)活躍的氧化合物小分子的統(tǒng)稱，其不僅是簡單的毒性代謝產(chǎn)物，還可以作為信號分子參與植物體內(nèi)的代謝活動，在植物免疫防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，全紅楊在接種初期H2O2含量增加，在侵染24 h后積累速度逐漸達(dá)到穩(wěn)態(tài)；2025楊在病程中O2-含量始終保持較高水平，而全紅楊中在接種初期就呈現(xiàn)下降趨勢，與陳祖靜等在美洲黑楊接種松-楊柵銹菌的抗性反應(yīng)一致。在植物防衛(wèi)病原物侵染的防御機(jī)制中，受病原菌的入侵寄主體內(nèi)的ROS被激發(fā)，且有研究表明楊樹品種的抗銹性越強(qiáng)，ROS升高幅度越大。銹菌入侵后，2025楊較全紅楊具有更強(qiáng)的ROS積累能力，但二者均未出現(xiàn)ROS爆發(fā)的現(xiàn)象，且ROS積累量不足以引發(fā)細(xì)胞程序性死亡，感病葉片未出現(xiàn)褪綠反應(yīng)。此外，正常狀態(tài)下植物體內(nèi)ROS水平處于穩(wěn)定狀態(tài)．受到病原菌侵染后，ROS大量積累，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化損傷。全紅楊感病前后O2-水平保持穩(wěn)定，表明全紅楊的抗氧化酶系統(tǒng)及高含量花青素類物質(zhì)能更快平衡ROS水平，能防止細(xì)胞膜過氧化損傷，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，因此，ROS水平不同可能也是造成全紅楊與2025楊對銹菌感染出現(xiàn)差異的重要原因之一。

抗氧化系統(tǒng)是植物在長期進(jìn)化過程中形成的活性氧平衡機(jī)制，SOD、POD和CAT等抗氧化酶可以清除病原物入侵后植物體內(nèi)過多的ROS，有效防止細(xì)胞膜過氧化損傷，在抗病反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。本研究中接種銹菌后，全紅楊和2025楊的POD酶活性在整個病程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且全紅楊在整個病程中的POD酶活性比2025楊高，這與抗、感種源青錢柳對炭疽病的抗性響應(yīng)結(jié)果一致。且有研究表明，POD可以催化植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的氧化，從而對病原菌產(chǎn)生毒害作用，抑制其生長繁殖，證明POD活性與植物抗病性呈現(xiàn)正相關(guān)。而SOD酶活性在病程中的變化趨勢與POD酶活性基本一致，均隨著銹菌侵染先上升后下降，SOD可以催化超氧陰離子對H2O2和O2的歧化，代表了植物防御ROS超標(biāo)造成細(xì)胞膜過氧化的第一道防線。CAT活性在接種前2025楊較高，而接種病原后全紅楊中CAT酶活性迅速升高，而后降低，這與抗性獼猴桃品種“徐香”對潰瘍病的抗性響應(yīng)結(jié)果一致，此外，在甘蔗感染黑穗病菌后的生理響應(yīng)測定中發(fā)現(xiàn)，抗病基因型的CAT活性在接種前期漲幅高，而后期酶活性變化低于感病基因型，這說明CAT在對病原物的早期防御中發(fā)揮了一定的作用。綜上，全紅楊能在應(yīng)對銹菌侵染時保持較高的抗氧化酶活性，且感病初期全紅楊中抗氧化酶活性增長速率更快，這說明全紅楊相較2025楊能夠更快啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)，可有效防止ROS含量過高對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。

4 結(jié)論

本研究從表型鑒定、組織化學(xué)染色以及生理生化指標(biāo)等方面比較了全紅楊和2025楊對北美柵銹菌的抗性差異，并對二者的抗病機(jī)制進(jìn)行了測定、分析和討論，發(fā)現(xiàn)二者產(chǎn)生抗性差異的主要原因可能有以下幾點(diǎn)：全紅楊較低的營養(yǎng)水平制約了銹菌在全紅楊葉肉組織內(nèi)的發(fā)育速度；全紅楊能夠在銹菌入侵后更快平衡ROS水平，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；此外全紅楊較2025楊有更高水平的抗氧化酶活性使其在應(yīng)對銹菌入侵時能快啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)。但紅葉楊抗病的分子機(jī)制及其與生理調(diào)控的內(nèi)在聯(lián)系尚未可知，這還有待進(jìn)一步研究。未來可以采用轉(zhuǎn)錄組加代謝組的多組學(xué)聯(lián)合分析手段，進(jìn)一步明晰紅葉楊抗銹病的內(nèi)在機(jī)制，為病害防控和彩葉楊抗病育種提供參考。

（責(zé)任編輯：崔貝）

基金項目：國家自然科學(xué)基金（No.31670650）