關鍵詞：立枯絲核菌；Rhi-milR9829-5p；水稻；大豆

立枯絲核菌（RhizoctoniasolaniKühn）可侵染水稻、大豆、玉米等260多種植物，引起水稻紋枯病、玉米紋枯病和大豆紋枯、根腐等病害，特別是在高溫、高濕或氮肥過量條件下發(fā)病尤為嚴重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失［1-4］。根據(jù)菌絲的融合特征，立枯絲核菌可劃分為14個融合群（AG-1～AG-13和AG-BI），其中AG-1又劃分為AG1ⅠA、AG1ⅠB、AG1ⅠC、AG1ⅠD四個亞群。不同融合群的致病力因寄主植物、地理位置等的不同而呈現(xiàn)一定的差異，AG1ⅠA是水稻紋枯病的主要致病菌，也是玉米紋枯病、大豆紋枯病、大豆根腐病的優(yōu)勢致病融合群［5］。通常，立枯絲核菌的主要致病因子為毒素和細胞壁降解酶，通過影響酶活性和膜通透性等導致細胞死亡，但其具體作用機制尚不清楚［6，7］。目前，對紋枯病的防治主要是化學藥劑防治，但該防治方法存在嚴重的環(huán)境污染和病原菌抗藥性問題。因此，優(yōu)化植物自身防御機制，提高其抗病能力，不僅可降低對化學藥劑的依賴，也有助于減少環(huán)境風險和保護生態(tài)平衡，是一種經(jīng)濟、環(huán)保的解決方案。

microRNA（miRNA）是一類短小的非編碼RNA分子，通常由約20～25個核苷酸組成［8］，通過轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的抑制從而負調(diào)控靶基因的表達水平，在各種生物過程中發(fā)揮重要作用［9］。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，miRNA在植物抗病過程中的功能及其分子機制，特別是miRNA在病原菌和植物間的相互跨界調(diào)控功能作用備受關注。已有報道表明，在病原菌侵染植物的過程中，真菌miRNA可以轉(zhuǎn)移到植物中，通過調(diào)控植物靶基因的表達來增強自身致病力［10］；同時，植物miRNA也可以轉(zhuǎn)移到真菌中，通過對病原菌相關基因的調(diào)控增強自身抗病性［11］。雖然目前已經(jīng)報道了多個miRNA能夠參與植物抗病性調(diào)控的過程［12，13］，但是miRNA參與調(diào)控水稻、大豆與立枯絲核菌相互作用的分子機制仍不清楚。另外，miRNA能夠同時調(diào)控多個靶基因的表達，能夠在一定程度上避免免疫逃避現(xiàn)象，因此，揭示miRNA對水稻、大豆抗病性的調(diào)控功能及分子機制，能夠為培育持久抗病性的水稻和大豆品種提供理論基礎。

在前期研究中，我們通過對立枯絲核菌進行全基因組小RNA測序，鑒定了171個micro-likeRNAs（milRNAs），其中18個milRNAs可能參與立枯絲核菌和玉米的互作。在立枯絲核菌侵染玉米的過程中，Rhi-milR9829-5p的表達量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在侵染3d時達到最高值，約為正常培養(yǎng)的病原菌中的16倍，推測RhimilR9829-5p極有可能參與了立枯絲核菌與玉米互作的過程。通過功能注釋、表達量分析、突變體接種等，驗證了Rhi-milR9829-5p通過調(diào)控玉米Kelch樣家族基因GRMZM2G412674的表達參與了玉米紋枯病的調(diào)控過程［14］。由于miRNA在進化過程中具有高度的保守性，因此，本研究試圖進一步探究Rhi-milR9829-5p對水稻紋枯病抗性的調(diào)控作用。我們構建了Rhi-milR9829-5p成熟體的超量表達載體并在水稻中進行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了過表達Rhi-milR9829-5p的水稻轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)其對紋枯病的抗性明顯變?nèi)酢４送?，我們利用生物信息學方法分別預測了RhimilR9829-5p在水稻和大豆中的靶基因，發(fā)現(xiàn)Rhi-milR9829-5p可通過多種途徑調(diào)節(jié)作物對紋枯病的抗性，且在水稻和大豆中具有顯著區(qū)別，推測立枯絲核菌對單、雙子葉植物的致病機理存在差異。

1 材料與方法

1.1 真菌菌株和植物材料

接種用立枯絲核菌YWK196為紋枯病菌AG1-IA融合群菌株，培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA；20%馬鈴薯，2%葡萄糖和2%瓊脂，w/v）上，28℃黑暗培養(yǎng)。

水稻品種為中花11（ZH11），種植于山東農(nóng)業(yè)大學岱宗校區(qū)溫室中，溫度28℃，相對濕度70%，光暗循環(huán)為16h/8h。

1.2 Rhi-milR9829-5p超量表達載體的構建

參考前人研究［15］，以pNW55載體為模板，利用PCR引物OE9829F/primerⅡ、PrimerⅠ/primerⅣ、PrimerⅢ/OE9829R（見表1）分別擴增三段PCR產(chǎn)物，再用引物OE9829F/OE9829R通過融合PCR擴增得到555bp片段，用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI進行雙酶切，酶切好的片段連接到pNW55載體上，獲得過表達載體pNW55：：Rhi-milR9829-5p。

1.3 立枯絲核菌接種及病斑統(tǒng)計

活化的立枯絲核菌置于馬鈴薯培養(yǎng)基（200g馬鈴薯，20g蔗糖，20g瓊脂粉，加水至1L）平板上，于28℃培養(yǎng)3d后用打孔器在平板上打出直徑為4mm的菌餅。取水稻孕穗期葉片，將葉片平鋪在接種盤內(nèi)，將菌餅有菌絲的一面接觸水稻葉片，平鋪在水稻葉片上，在接種部位噴水保濕，以利于紋枯病菌的侵染。接種3d后調(diào)查病斑長度，依據(jù)病斑長度衡量病情，調(diào)查數(shù)據(jù)進行t檢驗分析其顯著性（Plt;0.05）。

1.4 實時熒光定量PCR檢測Rhi-milR9829-5p的表達量

取Rhi-milR9829-5p成熟體過量表達的水稻轉(zhuǎn)基因植株葉片，TRIzol法提取總RNA后利用試劑盒合成cDNA（康為世紀，CW2141S）。合成Rhi-milR9829-5p成熟體特異性引物并利用miRNA定量PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR分析（康為世紀，CW2141S），。以立枯絲核菌的18SrRNA基因為內(nèi)參基因，每個實驗重復3次，利用ΔΔCt方法計算相對表達量。所用定量PCR儀為德國AnalytikJenaAG公司的qTOWER3。引物序列見表2。

1.5 實時熒光定量PCR檢測真菌生物量

取接種紋枯病菌3天后的Rhi-milR9829-5p過量表達水稻葉片的發(fā)病部位，以接種后的中花11葉片病斑為對照，分別提取總RNA并利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，利用Rhi-18SrRNA特異性引物和基因定量PCR試劑盒進行擴增（康為世紀，CW0718M）。每個實驗重復3次，利用ΔΔCt方法計算相對表達量。所用定量PCR儀為德國AnalytikJenaAG公司的qTOWER3。引物序列見表2。

1.6 Rhi-milR9829-5p靶基因預測

利用psRNA-Target網(wǎng)站（https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/）預測Rhi-milR9829-5p在水稻和大豆中的靶基因［16］，參數(shù)設置為：目標基因數(shù)量為30個，目標片段長度為10～15NT，其余參數(shù)為psRNA-Target網(wǎng)站默認參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 Rhi-milR9829-5p負調(diào)控水稻對紋枯病的抗性

為了分析Rhi-milR9829-5p在水稻與立枯絲核菌互作中的功能，我們獲得了Rhi-milR9829-5p成熟體過量表達的水稻轉(zhuǎn)基因植株，實時熒光定量PCR分析表明，在過量表達植株中RhimilR9829-5p的表達量顯著升高（圖1A）。在孕穗期對T1代轉(zhuǎn)基因植株接種YWK196，接種3d后觀察過量表達植株和野生型ZH11的病斑面積，發(fā)現(xiàn)過量表達植株發(fā)病面積更大（圖1B）；進一步進行病斑長度的測量和統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，超量表達株系病斑長度增加了4～7cm（圖1C），顯著降低了水稻對紋枯病菌的抗性（Plt;0.05）。此外，在接種3天后取病斑部位檢測真菌生物量，結果顯示Rhi-milR9829-5p過量表達的水稻植株真菌生物量顯著高于對照，推測過量表達水稻的葉片細胞壞死程度會更加嚴重。以上結果表明立枯絲核菌Rhi-milR9829-5p負調(diào)控水稻對紋枯病的抗性。

2.2 Rhi-milR9829-5p在水稻中的靶基因預測

為了深入研究Rhi-milR9829-5p參與水稻—立枯絲核菌互作的分子機制，我們利用生物信息學方法對Rhi-milR9829-5p在水稻中的靶基因進行了預測。通過分析，在水稻中共預測到了25個具有Rhi-milR9829-5p結合位點的靶基因，均為100%匹配（表2）。

2.3 Rhi-milR9829-5p在水稻中靶基因的功能注釋

為了明確Rhi-milR9829-5p負調(diào)控水稻紋枯病抗性的分子機制，對預測的靶基因進行了功能注釋。GO富集分析顯示，水稻中的25個靶基因被富集在不同的生物學過程、分子功能和細胞組分中。生物學過程主要被劃分為核苷酸生物合成過程（GO：0009165）、核糖核苷酸代謝過程（GO：0009259）、雜環(huán)代謝過程（GO：0046483）、小分子代謝過程（GO：0044281）、運輸過程（GO：0006810）、嘌呤核苷酸代謝過程（GO：0046040）六個過程。分子功能主要包括：酶活性（GO：0016829）、碳-碳裂解酶活性（GO：0016830）、羧基裂解酶活性（GO：0016831）和轉(zhuǎn)運活性（GO：0005215）四個功能。細胞組分富集在細胞質(zhì)（GO：0005737）、薄膜（GO：0016020）和蛋白質(zhì)復合物（GO：0043234）三個部分（圖2）。其中，靶基因LOC_Os08g43680編碼一個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，已有研究表明，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可以增強小麥對白粉病的抗性［17］，并且谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶能夠介導紋枯病對新型農(nóng)藥雙苯菌胺的代謝抗性和多重抗藥性［18］。此外，另一個靶基因LOC_Os12g40510編碼的鈣調(diào)磷酸酶亞基B蛋白（OsCBL2）是能夠感知細胞內(nèi)Ca2+濃度變化，參與植物對外界逆境的應答、生長發(fā)育調(diào)節(jié)和信號傳導等重要過程。并且前人研究發(fā)現(xiàn)CBL與CBL互作激酶（CIPK）形成CBL-CIPK復合體，從而影響白粉菌對小麥的侵染作用［19］。這些結果表明，立枯絲核菌Rhi-milR9829-5p可能通過靶向調(diào)控水稻的靶基因進而調(diào)控自身致病力。

2.4 Rhi-milR9829-5p在大豆中的靶基因預測

立枯絲核菌能夠侵染大豆引起大豆立枯病、根腐病等。由于真菌miRNA對作物抗病性的調(diào)控具有高度保守性，因此，為了了解RhimilR9829-5p在立枯絲核菌—大豆互作過程中的調(diào)控作用，我們對Rhi-milR9829-5p在雙子葉植物大豆中的靶基因進行了生物信息學預測并鑒定到29個潛在的靶基因，均為100%匹配（表3）。

2.5 Rhi-milR9829-5p在大豆中靶基因的功能注釋

為了進一步確定Rhi-milR9829-5p參與立枯絲核菌—大豆的互作過程，我們對Rhi-milR9829-5p在大豆中預測得到的靶基因進行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)只有Glyma.01g137500和Glyma.03g241200兩個基因可被富集到GO的生物學過程，分別為運輸過程和細胞器發(fā)育。靶基因的分子功能被富集在轉(zhuǎn)運活性（GO：0005215）、核苷酸結合（GO：0000166）和DNA結合（GO：0003677）三個部分。根據(jù)GO富集分析的結果發(fā)現(xiàn)，富集到的靶基因在細胞核（GO：0005634）、線粒體（GO：0005739）、薄膜（GO：0016020）和液泡（GO：0005773）中發(fā)揮功能（圖3）。

在已有研究表明，Rhi-milR9829-5p在大豆中的靶基因Glyma.06G046000編碼一個質(zhì)膜Ca2+-ATP酶（SCA2），有研究表明鈣信號可以協(xié)調(diào)植物-微生物相互作用，鈣（Ca2+）作為重要的第二信使，將微生物信號的感知與植物中建立免疫和共生反應之間的聯(lián)系，植物通過質(zhì)膜定位的模式識別受體來區(qū)分不同的微生物，被不同的細胞內(nèi)結合蛋白感知，促進下游防御相關基因的表達，參與調(diào)控植物免疫［20］。靶基因Glyma.13G207700編碼一個核因子Y轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白（NF-YC）。在水稻中，NF-YC轉(zhuǎn)錄因子家族成員OsHAP2E能夠提高水稻對稻瘟病的抗性［21］，推測NF-YC轉(zhuǎn)錄因子能夠在單、雙子葉植物的抗病過程中均發(fā)揮作用。

3 討論

miRNA是一段短小的非編碼RNA，對生物體內(nèi)各個生物學過程的調(diào)控發(fā)揮著至關重要的作用。近年來，miRNA的跨物種調(diào)控功能已被廣泛研究和認可。在病原菌與植物互作過程中，miRNA可通過多種方式實現(xiàn)跨物種調(diào)控［22］。一方面，叢枝菌根真菌可釋放miRNA或其他RNA到寄主植物細胞中，干擾植物基因表達，促進病原菌對植物的侵染［23］。另一方面，植物也可產(chǎn)生miRNA來調(diào)節(jié)其對病原真菌的響應［24］。這種miRNA介導的跨物種調(diào)控可通過靶向病原菌基因表達進而抑制其生長，或通過調(diào)控植物靶基因來影響植物的抗病反應以增強免疫能力。本研究通過將立枯絲核菌Rhi-milR9829-5p成熟體在水稻中進行過量表達，發(fā)現(xiàn)Rhi-milR9829-5p能夠負調(diào)控水稻的抗病性，并且Rhi-milR9829-5p能夠跨界調(diào)控水稻和大豆的靶基因，進一步證實了miRNA在病原菌—植物互作中的跨界調(diào)控功能，為理解病原菌侵染機制和植物抗病機制提供了新的視角和研究方向。

miRNA在不同層次的免疫中起作用，包括病原體相關的模式觸發(fā)的效應器觸發(fā)的免疫［25］。課題組在之前的研究中，鑒定到一個參與植物-微生物互作的立枯絲核菌milRNA，命名為RhimilR9829-5p。本研究的結果表明，在水稻品種ZH11中過量表達Rhi-milR9829-5p時，水稻對紋枯病的抗性顯著減弱。已有研究表明，抑制水稻Osa-miR444.2的表達可通過植物激素途徑提高水稻對紋枯病的抗性［8］，這與我們的結論相似，說明多數(shù)miRNA參與植物-微生物互作的途徑，并且負調(diào)控水稻對紋枯病的抗性。

立枯絲核菌對單、雙子葉植物的致病機理存在顯著差異。在單子葉植物水稻中，RhimilR9829-5p被預測能夠靶向LOC_Os08g43680基因，該基因編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。而在雙子葉植物大豆中，Rhi-milR9829-5p的靶基因包括Glyma.06G046000，該基因編碼質(zhì)膜Ca2+-ATP酶（SCA2）。這些靶點的差異可能反映了立枯絲核菌在不同植物類型中的致病機理是不同的。在水稻中，由于靶向的部分基因編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，可能會影響水稻細胞內(nèi)的氧化還原平衡或細胞信號傳導途徑，從而增加植物對立枯絲核菌侵染的敏感性［26］。而在大豆中，靶向的基因編碼質(zhì)膜Ca2+-ATP酶，可能與鈣離子信號傳導有關，進一步調(diào)節(jié)了植物對立枯絲核菌的抗性或感受性［24］。這種差異性的靶向機制揭示了立枯絲核菌在不同植物宿主中致病的復雜性，為理解其病原性與宿主互作提供了重要線索。

miRNA是與靶向mRNA結合并影響結合mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率的調(diào)節(jié)性RNA分子［27］。因此，我們通過生物信息學分析預測RhimilR9829-5p在水稻和大豆中的靶基因，值得注意的是，對這些靶基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)其中多個基因被注釋為與植物免疫密切相關，并且通過核苷酸生物合成過程、小分子代謝過程、運輸和多細胞生物發(fā)育等多個途徑參與調(diào)節(jié)植物免疫，說明Rhi-milR9829-5p在生物脅迫中起著至關重要的作用，Rhi-milR9829-5p是一個廣譜抗性的調(diào)節(jié)因子。然而，Rhi-milR9829-5p如何調(diào)節(jié)靶基因來激活植物免疫應答的機理需要進一步的研究。

4 結論

針對課題組前期鑒定到的參與調(diào)控紋枯病抗性的立枯絲核菌Rhi-milR9829-5p，構建了RhimilR9829-5p成熟體的過量表達載體并在水稻ZH11中進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了Rhi-milR9829-5p過量表達的轉(zhuǎn)基因水稻植株，接種紋枯病菌后發(fā)現(xiàn)過表達植株對紋枯病菌的抗性顯著降低。通過生物信息學方法預測了Rhi-milR9829-5p在水稻和大豆中的靶基因，其中水稻中共有25個靶基因，大豆中共得到29個靶基因，通過基因功能注釋和GO富集分析將這些靶基因富集在核苷酸生物合成過程、小分子代謝過程、運輸和多細胞生物發(fā)育等多個途徑中，說明Rhi-milR9829-5p在立枯絲核菌侵染水稻和大豆時可以通過調(diào)控多種生物學過程參與激活植物免疫反應。同時，RhimilR9829-5p在水稻和大豆中的靶基因也參與了不同的生物學過程，推測其在水稻中可能通過細胞內(nèi)的氧化還原反應而影響抗病性，而在大豆中更可能通過鈣離子信號轉(zhuǎn)導來影響抗病性。總之，本研究為揭示miRNA了在立枯絲核菌與水稻、大豆互作過程中的調(diào)控作用，為解析紋枯病的致病機制、提高植物抗病性提供了新的見解。