摘 要：2023年3—5月，廣東省惠州市一方海（廣東）海洋牧場有限公司所繁育的黃唇魚（Bahaba taipingensis）出現(xiàn)發(fā)病和死亡的現(xiàn)象，癥狀主要為食欲下降，凸眼，尾鰭和背鰭出現(xiàn)出血，且腹腔有腹水，內(nèi)臟部位附近出現(xiàn)充血，此外其他部位均正常，無其他明顯病癥。為確定其病因，采集死亡病魚的心臟、脾臟、肝臟、頭腎、中腎等組織樣品，通過對分離純化的優(yōu)勢菌株的形態(tài)特征、16S rRNA基因序列進(jìn)行綜合分析，大部分組織樣品均發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌，由此初步確定此次引發(fā)黃唇魚死亡的菌株為哈維氏弧菌。

關(guān)鍵詞：黃唇魚；哈維弧菌；細(xì)菌分離鑒定

中圖分類號：S943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）07–000-03

黃唇魚（Bahaba taipingensis），又稱白花魚、金錢鮸、黃甘等，屬硬骨魚綱鱸形目石首魚科，系近海底層暖溫性魚類，屬于我國特有魚種，其分布地主要在廣東省珠江口岸。2021年，黃唇魚被列為國家一級重點(diǎn)保護(hù)水生野生動物[1]。因此，開展黃唇魚生物學(xué)和病害防控等相關(guān)研究，對恢復(fù)黃唇魚資源、保護(hù)生物多樣性及海洋生態(tài)環(huán)境具有重大意義。

弧菌是海洋環(huán)境中常見的細(xì)菌種群之一，廣泛分布于海灣、近岸、河口等海域[2]?；【鷮俜N類繁多，主要致病弧菌有哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、霍亂弧菌等[3]。其中，哈維氏弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中較為常見的致病菌，其引起的癥狀主要有腸炎病、潰爛病、出血病、癤瘡病、敗血病、腹水病、潰爛病等[4]。例如，2015年山東省某地混合養(yǎng)殖的石斑魚中曾被報道因感染哈維氏弧菌而暴發(fā)石斑魚皮膚潰瘍病，出現(xiàn)厭食、眼球突出、體表出血的癥狀[5]。

隨著海水養(yǎng)殖的規(guī)模不斷擴(kuò)大和密度的增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病頻發(fā)，甚至整個水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)疾病發(fā)生規(guī)模呈逐年上漲的態(tài)勢?；诖?，以廣東省惠州市一方海（廣東）海洋牧場有限公司為例，研究2023年入夏以來其所繁育的黃唇魚出現(xiàn)的發(fā)病和死亡的情況，發(fā)病黃唇魚的尾鰭和背鰭均有出血的癥狀，腹腔存在腹水，這與哈維弧菌感染的出血癥狀極其相似。通過對其進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，并利用現(xiàn)代分子學(xué)手段進(jìn)行檢測，以期確認(rèn)具體的致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2023年3—5月，采集發(fā)病黃唇魚樣本共20尾，解剖后發(fā)現(xiàn)，其魚體尾鰭和背鰭出現(xiàn)出血癥狀、腹腔有腹水、內(nèi)臟部位沒有明顯病癥。并將一小部分魚組織用95%無水乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化

首先，將剪刀、鑷子、接種環(huán)等工具進(jìn)行消毒滅菌，待病魚解剖后，使用接種環(huán)在其腦、肝、脾、腎等組織內(nèi)蘸取少量組織液，并將組織液放在固體LB培養(yǎng)基（鹽度為2%）中進(jìn)行劃線接種，溫度保持在37 ℃，培養(yǎng)12 h。

其次，將培養(yǎng)后的菌落形態(tài)進(jìn)行對比，挑選出不同形態(tài)的菌落，且挑選的菌落必須在培養(yǎng)基中數(shù)量較多（數(shù)量較多的為優(yōu)勢菌落）。然后用接種環(huán)蘸取一小部分優(yōu)勢菌落移入至0.9%的生理鹽水中稀釋10 000倍，并采取三線法進(jìn)行平板劃線，隨后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

最后，用接種環(huán)蘸取純化培養(yǎng)后的細(xì)菌，并置于LB液體培養(yǎng)基，搖菌12 h，直至出現(xiàn)明顯渾濁。其中一部分用于后續(xù)提取DNA，剩余部分用30%甘油進(jìn)行保種，并置于80 ℃的環(huán)境中備用。

1.2.2 細(xì)菌DNA提取

用無菌剪刀和鑷子分離病魚組織樣品，使用DNA提取試劑盒提取組織樣品總DNA。運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測，采用細(xì)菌16S通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括1 μL模板DNA，12.5 μL PCR Mix（東盛，廣州），上、下游引物各1 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5個循環(huán)：預(yù)變性95 ℃，4 min；變性95 ℃，1 min；退火53 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；72 ℃延伸7 min。隨后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將有條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，進(jìn)一步確定菌種所屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 疾病病癥和病原的形態(tài)觀察

測量黃唇魚所生存的水溫為29.7 ℃，鹽度為3.75 ng/L，pH值為7.35。

受到感染的黃唇魚表現(xiàn)癥狀為凸眼、尾鰭和背鰭均出現(xiàn)出血癥狀并伴有輕微的皮膚潰爛，魚體表面有輕微褪色，魚鱗脫落，眼球突出。其腹腔有腹水，內(nèi)臟部位附近出現(xiàn)充血，腎臟、脾臟有明顯出血，腸道內(nèi)有黃色液體流出。除此之外其他部分均正常，并無其他明顯病癥。

在12 h內(nèi)，菌株會形成外表圓球形、邊緣整齊、表面光滑且略帶凸起的白色不透明菌落（圖1）。

2.2 細(xì)菌的PCR鑒定

通過16S細(xì)菌通用引物對不同菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其條帶片段大小為800 bp左右（圖2）。

進(jìn)行PCR測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)ITS序列的相似度高達(dá)98%以上，由此來確定具體菌株名稱。

2.3 菌株的分子學(xué)鑒定

魚體的優(yōu)勢菌株為玄武巖希瓦氏菌和哈維氏弧菌，感染鰓的優(yōu)勢菌株為哈維氏弧菌，感染胃組織的優(yōu)勢菌株為阿爾法克弧菌，感染腸道組織的優(yōu)勢菌株為黑?；【?、美人魚發(fā)光弧菌、哈維氏弧菌，感染肝組織的優(yōu)勢菌株為哈維氏弧菌、黑?；【?，感染脾組織的優(yōu)勢菌株為哈維氏弧菌、美人魚發(fā)光桿菌、黑海弧菌，感染中腎組織的優(yōu)勢菌株為哈維氏弧菌、黑?；【?，感染頭腎組織的優(yōu)勢菌株為哈維氏弧菌。

根據(jù)結(jié)果可知，此次死亡的黃唇魚所感染的優(yōu)勢菌株為哈維氏弧菌。

3 討論

3.1 致病性弧菌

在海水養(yǎng)殖感染的病原菌中，弧菌屬細(xì)菌占比較大，致病性弧菌被認(rèn)為是海水魚類和貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的“災(zāi)禍之源”，其主要感染對象為大菱鲆、虹鱒、大西洋鮭、對蝦、黑石斑魚、牙鲆等[6]?；【鷮偈且活惛锾m氏陰性細(xì)菌，化能異養(yǎng)、兼性厭氧，細(xì)胞呈現(xiàn)短桿狀、彎曲狀、S形或螺旋形等多形態(tài)[7]。鑒于本次檢測，可以初步斷定此次引起黃唇魚死亡的主要致病菌為哈維氏弧菌，但為了進(jìn)一步確定，還需進(jìn)一步做感染回歸實(shí)驗(yàn)，再與此次發(fā)病的癥狀進(jìn)行對照，方可確定此次致病菌的真實(shí)性。

哈維弧菌是在自然界廣泛存在的弧菌科的重要成員，屬于變形細(xì)菌門，變形菌綱，弧菌目，弧菌科，弧菌屬。同時，該細(xì)菌在海洋中分布也廣泛，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，在20世紀(jì)末才被人們所熟知[8]。

哈維氏弧菌除了具有一定的運(yùn)動能力，還具有一定的嗜鹽性，因此該菌在鹽度較高的外海海域或在鹽度較高的近岸海域分布十分廣泛，其生存的最適溫度為25～28 ℃[9]。感染哈維氏弧菌主要集中在夏季，其侵染性極強(qiáng)，致死率也偏高，如果水生動物被該病菌侵染后，會出現(xiàn)如壞死性腸炎、爛鰓爛尾、口腔或皮膚表面局部出血性潰瘍、體色發(fā)黑、肛門紅腫、眼睛渾濁和厭食等現(xiàn)象，一般感染1周后會出現(xiàn)死亡[10-11]。

在不同地區(qū)、不同宿主間，哈維氏弧菌的耐藥性都存在著差異，有時差異較為明顯[12]。相關(guān)Shen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌對17種抗生素表現(xiàn)出明顯耐藥性，而僅對米諾環(huán)素、多西環(huán)素和頭孢曲松這三種抗生素表現(xiàn)出明顯敏感性。鑒于不同情況下得到的哈維氏弧菌的耐藥性存在較大差異，對哈維氏弧菌的分離株要進(jìn)行較廣的耐藥特性分析，這不僅為疾?。ㄓ晒S氏弧菌引發(fā)的疾病）提供用藥參考，而且可以有效地記錄當(dāng)?shù)赜盟幍姆N類和劑量，為以后用藥方向提供有效參考[13-16]。

3.2 水生動物防治技術(shù)

隨著社會的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖人員應(yīng)該積極采用先進(jìn)的防控手段，在保證水生動物存活率的同時，應(yīng)注意生態(tài)環(huán)境的保護(hù)。

在水生動物防治方面，養(yǎng)殖人員不能一直采用化學(xué)手段?；瘜W(xué)藥物不僅危害人類健康，還會對養(yǎng)殖環(huán)境乃至整個生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害防治方面，養(yǎng)殖人員應(yīng)采取更加健康、綠色的手段。

疫苗防治就是一種綠色防治手段，疫苗防治是針對特定的高發(fā)病或高致死率病菌，研發(fā)相應(yīng)疫苗，然后注射入宿主體內(nèi)。該手段可以替代傳統(tǒng)的高污染的化學(xué)藥物，進(jìn)一步減輕藥物對環(huán)境的影響，更為有效地抑制弧菌屬的侵染。

除了疫苗防治，噬菌體防治也是較為常見的病害防治手段。噬菌體防治針對特定的菌種研發(fā)對應(yīng)噬菌體，這些噬菌體可以有效殺滅細(xì)菌，但對宿主本身不會造成危害，最重要的是該噬菌體對環(huán)境的影響微乎其微[17-19]。

4 結(jié)論

以廣東省惠州市一方海（廣東）海洋牧場有限公司所繁育的黃唇魚為研究對象，從病魚中分離得到菌株，經(jīng)細(xì)菌純化培養(yǎng)和16S rRNA基因序列分析，確定致病菌為哈維氏弧菌。該菌為海水養(yǎng)殖中常見致病菌，具有較強(qiáng)毒力，一般在夏季為感染高發(fā)期。而在感染初期，魚體顏色會呈褪色狀，食欲缺乏，游動緩慢；中度感染時，魚鰭部、尾部、軀干部等發(fā)紅甚至?xí)霈F(xiàn)出血癥狀；隨著病癥的不斷發(fā)展，魚的腎、脾、肝等內(nèi)臟均出現(xiàn)出血或者瘀血的現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)血性潰瘍。

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