摘 要：為探究不同品種高粱的代謝物差異及其對白酒釀造過程和白酒品質(zhì)的潛在影響，本文通過非靶向代謝組學(xué)對川粱紅9號和東北粳高粱籽粒的代謝物差異進(jìn)行分析。結(jié)果表明，兩種高粱中萜類、黃酮類、脂類及氨基化合物的含量和種類存在明顯的差異。這些差異可能通過調(diào)控發(fā)酵微生物的代謝活動，進(jìn)而影響高粱白酒的發(fā)酵進(jìn)程和風(fēng)味物質(zhì)的生成，最終導(dǎo)致其風(fēng)味及品質(zhì)的差異化。

關(guān)鍵詞：高粱品種；非靶向代謝組學(xué)；白酒釀造；風(fēng)味

Non-Targeted Metabolomics Analysis of Non-Glutinous and Glutinous Sorghum

LI Qiang， ZHU Hui， WANG Ning*

（Sichuan Engineering Technology Research Center for Liquor-Making Grains，

Sichuan University of Science & Engineering， Yibin 644000， China）

Abstract： In order to investigate the metabolite differences of sorghum varieties and their potential effects on liquor brewing process and liquor quality， the metabolites of Chuanlianghong No.9 sorghum and northeast japonica sorghum were analyzed by non-targeted metabolomics. The results showed that there were significant differences in contents and types of terpenoids， flavonoids， lipids and amino compounds in two kinds of sorghum. These differences may affect the fermentation process and the production of flavor substances by regulating the metabolic activities of fermentation microorganisms， and ultimately lead to the difference of flavor and quality of sorghum liquor.

Keywords： sorghum variety; non-targeted metabolomictjLqSQZgMfB+KHYCBp5nCA==s; Baijiu brewing; flavour

高粱是釀造白酒的核心原料，其品種的變化與白酒的風(fēng)味及整體品質(zhì)的優(yōu)劣密切相關(guān)。當(dāng)前，主要的高粱品種包括糯高粱和粳高粱，在淀粉結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量以及單寧含量等方面存在顯著差異，從而影響著白酒的發(fā)酵過程和最終品質(zhì)[1]。

目前，已有研究報(bào)道高粱品種對白酒品質(zhì)的影響，并利用氣相色譜等技術(shù)手段分析不同品種高粱釀造白酒的揮發(fā)性風(fēng)味化合物和原糧蒸煮風(fēng)味的差異[2]。但是，相關(guān)研究多集中于高粱品種的淀粉結(jié)構(gòu)、單寧含量、釀造性能的變化及其對出酒率和感官質(zhì)量的影響[3]，而對于高粱的代謝物差異及其對釀造白酒品質(zhì)影響的系統(tǒng)性研究還相對不足。本文通過分析不同高粱品種代謝物的差異，探討其對白酒發(fā)酵過程及品質(zhì)的影響，以期為白酒釀造工藝的優(yōu)化及品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川粱紅9號高粱、東北粳高粱，由四川輕工化大學(xué)釀酒專用糧工程技術(shù)研究中心提供。

丙酮，天津市康科德科技有限公司；乙腈、96D30q4lTm4WhUJSxjtHqg==甲酸、甲酸銨、甲醇，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 前處理方法

將100 mg高粱樣品用液氮研磨，隨后在80%甲醇中進(jìn)行渦旋混合再懸浮。將樣品在冰上孵育5 min，在15 000×g、4 ℃條件下離心20 min。用超純水將上清液稀釋至甲醇濃度為53%。將樣品轉(zhuǎn)移到干凈的EP管中，在15 000×g、4 ℃條件下離心20 min，備用待測。

1.3 超高效液相色譜質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL·min-1。流動相A：0.1%甲酸；流動相B：甲醇；溶劑梯度洗脫程序：0～3 min，2%B；3～10 min，2%→85%B；10～10.1 min，85%B；10.1～11 min，85%→2%B；11～12 min，2%B。

（2）質(zhì)譜條件。掃描范圍：m/z 100～1 500；ESI噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣流速：35 psi；輔助氣流速：10 L·min-1；離子傳輸管溫度：320 ℃；離子導(dǎo)入射頻電平：60；輔助氣加熱器溫度：350 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用CD3.3搜庫軟件處理原始數(shù)據(jù)，對代謝物進(jìn)行峰提取、峰對齊和定量?；贛etaX平臺對代謝物執(zhí)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA），篩選變量重要性投影（Variable Important in Projection，VIP）。使用t檢驗(yàn)對兩組樣本的代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P值）和差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）進(jìn)行分析。利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/）對鑒定得到的代謝物的代謝途徑進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種高粱的超高效液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

超高效液相色譜-質(zhì)譜因其靈敏性高和分析范圍廣而在代謝組學(xué)中廣泛使用。使用超高效液相色譜-質(zhì)譜儀獲取的不同品種高粱的總離子流圖如圖1所示（每個(gè)樣品分別測定3次）。由圖1可知，兩種樣品的出峰時(shí)間和范圍基本一致，但在峰形和峰值上存在差別，表明兩種高粱的代謝物成分存在差別。

為初步比較兩種高粱的代謝物差異，對其代謝物進(jìn)行PCA分析和分類，結(jié)果如圖2所示。由PCA 3D評分可知[圖2（a）]，川粱紅9號組和東北粳高粱組的組間樣本較為分散，整體差異大，而組內(nèi)樣本較為聚集，差異小，樣本穩(wěn)定性較好。說明兩種高粱的代謝物具有明顯差異。代謝物類型主要包括脂類和類脂分子（32.12%）、苯基丙烷類和聚酮類（15.91%）、有機(jī)酸及其衍生物（13.58%）等[圖2（b）]，表明淀粉是高粱組分中占比最高的物質(zhì)，而脂類化合物是高粱中種類最多的物質(zhì)[4]。

2.2 不同品種高粱中的代謝物差異性比較

對PCA模型進(jìn)行初步分析，模型穩(wěn)定、可靠且組間差異明顯，為進(jìn)一步明確兩種高粱中的差異代謝物，采用PLS-DA模型分析數(shù)據(jù)。根據(jù)PLS-DA結(jié)果[圖3（a）]進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)從縱向來看，兩組的樣本聚集，組內(nèi)重復(fù)性好；橫向來看，兩組樣本間隔較遠(yuǎn)，組間代謝物具有明顯差異。圖3（a）中R2Y=1.00，表示所建模型對Y軸矩陣的解釋率為100%；Q2Y=0.93，表示模型對Y軸矩陣的預(yù)測能力為93%。通常，R2、Q2數(shù)值越接近1，說明模型對觀測數(shù)據(jù)的擬合程度和預(yù)測能力越好，越能反映不同品種高粱中代謝物的真實(shí)情況。為避免過度擬合而影響模型的可靠性，進(jìn)一步對PLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)[圖3（b）]。由置換檢驗(yàn)結(jié)果可知，擬合值R2截距=0.94，預(yù)測值Q2截距=-0.86。其中，Q2截距＜0.05，表明預(yù)測的偶然性很小，具有較好的預(yù)測能力，且R2總是＞Q2，說明該模型可靠。

2.3 差異代謝物的篩選與表征

采用VIP＞1.0，F(xiàn)C＞1.5或FC＜0.667且P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步鑒定兩種高粱中的差異代謝物。其中，上調(diào)表示在川粱紅9號中差異代謝物含量相對更高（在東北粳高粱中差異代謝物含量相對更低），下調(diào)反之。在代謝物中篩選出148種上調(diào)、135種下調(diào)的顯著差異代謝物[圖4（a）]。差異代謝物在兩組中的分布如圖4（b）所示，川粱紅9號高粱中洋川芎內(nèi)酯A、酯蟾毒配基、冬凌草乙素、長春胺、靈芝酸H、甘草內(nèi)酯、脂類（維生素D、8-異前列腺素）以及氨基酸化合物（L-同型半胱氨酸）等物質(zhì)含量較高。而東北粳高粱中橙皮苷、表兒茶素、齊墩果酸、番麻皂素、五味子酚、血清素、氨基酸化合物（D-谷氨酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸、L-谷胱甘肽）、脂類化合物（二十二碳六烯酸）等物質(zhì)含量較高。兩種高粱的差異代謝物主要集中在脂類化合物、萜類、類黃酮、氨基化合物中。而代謝物成分的差異對白酒發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要影響，部分代謝物或作為風(fēng)味貢獻(xiàn)成分影響產(chǎn)品感官，或作為功能活性成分發(fā)揮健康調(diào)節(jié)功效。在發(fā)酵期間，高粱中脂類物質(zhì)經(jīng)微生物和生物酶的共同作用后，發(fā)生降解而溶出，賦予酒體豐富的脂肪酸。此外，少量的脂肪酸與乙醇在酶的催化作用下合成酯類化合物，經(jīng)分解可產(chǎn)生一些醇、酸類物質(zhì)，再經(jīng)氧化還原生成醛類和酮類物質(zhì)，從而使得白酒中的風(fēng)味更加豐富[5]。ZHANG等[6]曾報(bào)道萜類物質(zhì)（冬凌草乙素）對結(jié)直腸癌以及其他癌癥具有抗癌活性。在發(fā)酵過程中，氨基化合物既可作為氮源為微生物提供營養(yǎng)，也可以在多種微生物酶的作用下分解生成氨基酸，再轉(zhuǎn)化為高級醇、醛酮類、內(nèi)酯類等獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)[7]。在發(fā)酵過程的高溫環(huán)節(jié)，氨基酸還可以與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成呋喃類、吡嗪類等多元雜環(huán)化合物，賦予白酒更多的焦香、堅(jiān)果香等風(fēng)味。這些風(fēng)味化合物對于白酒，特別是醬香型白酒的風(fēng)味有著重要的作用。

2.4 差異代謝物的代謝途徑分析

為確定差異代謝物所參與的代謝途徑，對篩選出的283個(gè)代謝物進(jìn)行KEGG代謝途徑分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5（a）可知，代謝物參與的主要途徑中，除全局和概覽地圖以外，占比最高的為氨基酸代謝（16.06%），其次為脂代謝（14.6%）。途徑散點(diǎn)圖表明[圖5（b）]，較多代謝物注釋的代謝途徑包括苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、硫胺素代謝、亞油酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、花生四烯酸、脂肪酸生物合成以及不飽和脂肪酸生物合成等。這些途徑主要涉及氨基酸生物合成和脂肪酸代謝，表明川粱紅9號與東北粳高粱中主要氨基酸和脂類物質(zhì)存在顯著差異。

3 結(jié)論

本文通過對川粱紅9號、東北粳高粱兩種不同品種高粱籽粒中的代謝物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩種品種高粱代謝物的組成、含量均存在一定的差異。川粱紅9號與東北粳高粱中所含的萜類、黃酮類化合物、脂類化合物、氨基化合物的含量和種類存在明顯差異。這些差異可能導(dǎo)致白酒釀造過程中糟醅的發(fā)酵進(jìn)度和風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生變化，最終造成白酒整體品質(zhì)的不同。但白酒品質(zhì)還可能與原料、環(huán)境等多種因素相關(guān)，不同品種高粱在釀造過程中對釀造特性、白酒品質(zhì)的香氣成分和功能成分的影響有待進(jìn)一步研究。

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[7]羅惠波，茍?jiān)茰R，葉光斌，等.影響白酒中高級醇生成的工藝條件研究[J].中國釀造，2011，30（8）：87-90.

基金項(xiàng)目：四川省釀酒專用糧工程技術(shù)研究中心（2022-04）；中國輕工業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“釀酒生物技術(shù)與智能制造”（2023-02）。

作者簡介：李強(qiáng)（1997—），男，四川巴中人，碩士在讀。研究方向：釀酒專用糧對白酒風(fēng)味及品質(zhì)的調(diào)控機(jī)制。

通信作者：王凝（1988—），女，四川成都人，博士，副教授。研究方向：釀酒專用糧對白酒風(fēng)味及品質(zhì)的調(diào)控機(jī)制。E-mail： wangningzhuhui@hotmail.com。