摘 要：目的：建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測海參中硝基呋喃類代謝物殘留量的方法。方法：采用40 ℃水浴中超聲1 h，45 ℃氣浴中衍生5 h，pH值7.0～7.5條件進(jìn)行樣品前處理，以2 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。結(jié)果：4種硝基呋喃類代謝物在0.5～20.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，加標(biāo)平均回收率在97.3%～103.6%，方法檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。結(jié)論：該方法可用于市售海參中硝基呋喃類代謝物殘留量的快速檢測。

關(guān)鍵詞：海參；硝基呋喃類代謝物；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

Determination of Nitrofuran Metabolites in Sea Cucumber by Ultra-high Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

NING Chen

（Ningde Quality Inspection Institute of Product， Ningde 352100， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid， accurate， and efficient method for detecting residual nitrofuran metabolites in sea cucumber using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Method： Sample pretreatment was carried out using ultrasound for 1 hour in a 40 ℃ water bath， derivatization for 5 hours in a 45 ℃ gas bath， and pH values ranging from 7.0 to 7.5. Gradient elution was performed using a mobile phase of 2 mmol·L-1ammonium acetate in 0.1% formic acid aqueous solution acetonitrile， and ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used for determination. Result： The four nitrofuran metabolites showed a good linear relationship in the range of 0.5 ng·mL-1 to 20.0 ng·mL-1， with an average recovery rate of 97.3% to 103.6%. The detection limit of the method was 0.5 μg·kg-1， and the quantification limit was 1.0 μg·kg-1. Conclusion： This method can be used for rapid detection of residual nitrofuran metabolites in commercially available sea cucumbers.

Keywords： sea cucumber; nitrofuran metabolites; ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

海參作為一種富含多種人體必需營養(yǎng)成分的海洋產(chǎn)品[1-2]，隨著人們生活水平的提高，已逐漸成為普通家庭餐桌上的常見美食。然而，在海參養(yǎng)殖過程中，為防止出現(xiàn)病害，常使用全池潑灑法進(jìn)行水體消毒[3]。硝基呋喃類藥物是常用的一種殺菌劑，其具有抗菌譜廣、效果明顯且價格便宜等優(yōu)勢，被海參養(yǎng)殖戶廣泛用于預(yù)防在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的病害[4-5]。

硝基呋喃藥物的殘留物可能通過食物鏈進(jìn)入人體，對健康構(gòu)成潛在風(fēng)險[6-7]。目前，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號（食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單）規(guī)定，硝基呋喃類藥物屬于禁用獸藥，在海參等水產(chǎn)品中不得檢出。因此，加強對硝基呋喃類代謝物等獸藥殘留的檢測，是保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要措施。

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)在檢測海參中的硝基呋喃類代謝物時，通常采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，包括進(jìn)行酸解、衍生、凈化等前處理步驟，檢測周期較長，通常需要1～2 d[8-10]。而快檢方法又存在假陽性的風(fēng)險，難以滿足海參交易中的檢測需求[11-12]。因此，建立一種可快速出具結(jié)果的檢測方法，顯得至關(guān)重要。本文旨在研究一種快速、準(zhǔn)確、高效檢測海參中硝基呋喃類代謝物的方法，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全與行業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸乙酯、乙腈、甲醇和乙酸銨，均為色譜純；2-硝基苯甲醛為優(yōu)級純；濃鹽酸、無水磷酸氫二鉀，均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品：3-氨基-2-惡唑烷基酮（AOZ，純度99.14%，CAS NO.80-65-9）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ，純度99.19%，CAS NO.43056-63-9）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲鹽酸鹽（AHD·HCl，純度99.90%，CAS NO.2827-56-7）和氨基脲鹽酸鹽（SEM·HCl，純度99.77%，CAS NO.563-41-7），均購自Dr.Ehrenstorfer公司。

內(nèi)標(biāo)：AOZ-D4（純度99.7%，CAS NO.1188331-23-8）、AMOZ-D5（純度98.0%，CAS NO.1017793-94-0）、AHD-13C3（純度98%，CAS NO.957509-31-8）和SEM·HCl-13C，15N2（不確定度±3%，k=2，CAS NO.1173020-16-0），均購自BePure公司。

以日常檢測積累的海參陽性樣品作為測試樣，選取了3個陽性樣品（樣品1、樣品2、樣品3）。其中，樣品1為含AOZ和AHD的海參陽性樣品，AOZ和AHD的含量分別為10.2 μg·kg-1和4.1 μg·kg-1；樣品2為含SEM的海參陽性樣品，SEM的含量為19.9 μg·kg-1；樣品3為含AMOZ的海參陽性樣品，AMOZ的含量為3.5 μg·kg-1。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent LC1290-G6460A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）；VORTEX-5渦旋振蕩器，海門其林貝爾；JZQ-Ⅱ均質(zhì)器，天津津德；TGL-15B高速離心機，上海安亭；ZD-85氣浴恒溫振蕩器，常州國華電器；SE812氮吹儀，北京帥恩；KQ-500DE超聲波清洗器，昆山超聲儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg·mL-1）：精確稱量AOZ、AMOZ、AHD和SEM標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g于10 mL容量瓶中，加1 mL純水溶解，用乙腈定容。

混合內(nèi)標(biāo)儲備液（10.0 μg·mL-1）：精確移取AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C，15N2內(nèi)標(biāo)物各100 μL，加900 μL乙腈。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：空白海參樣品按照樣品前處理步驟進(jìn)行衍生、萃取得下清液，準(zhǔn)確移取適量4種硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100 ng·mL-1），用下清液稀釋得到濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。同時，準(zhǔn)確移取適量的100.0 ng·mL-1硝基呋喃內(nèi)標(biāo)工作溶液，使得標(biāo)樣中最終內(nèi)標(biāo)濃度為5.0 ng·mL-1。

1.3.2 樣品前處理

稱取已均質(zhì)的海參樣品2.0 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液（100.0 ng·mL-1），加入0.5 mol·L-1的鹽酸溶液5.0 mL和0.1 mol·L-1的2-硝基苯甲醛溶液200 μL，渦旋混合10 min，于超聲波清洗器中40 ℃水浴超聲1 h，然后置于氣浴恒溫振蕩器中，45 ℃避光衍生5 h。

取出已衍生的樣品，冷卻至室溫，緩慢加入1.0 mol·L-1的K2HPO4溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0～7.5，加入乙酸乙酯20.0 mL萃取，低速渦旋混合30 s，平行振蕩10 min后，于高速離心機中10 000 r·min-1離心5 min。取上清液至氮吹管中，放入氮吹儀40 ℃水浴中氮氣吹干（在氮吹過程中，應(yīng)留意提取液是否被吹干，若已干應(yīng)及時取出氮吹管，否則會影響測定結(jié)果）。移取2.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（1+9，V+V）加入已干的氮吹管中，再加入2.0 mL乙腈飽和的正己烷，低速渦旋溶解殘留物，以10 000 r·min-1離心10 min，下清液過有機系尼龍過濾器（0.22 μm，13 mm）至進(jìn)樣瓶，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.3.3 液相色譜和質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.3 mL·min-1；流動相A：含2 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，B：乙腈。洗脫條件：0～0.6 min，10%→20%B；0.6～3.0 min，20%B；3.0～6.0 min，20%→25%B；6.0～7.0 min，25%→60%B；7.0～8.0 min，60%→95%B；8.0～10.0 min，95%B；10.0～10.1 min，95%→10%B；10.1～12.0 min，10%B。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源類型：ESI+；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流量：10 L·min-1；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L·min-1；霧化器壓力：45 psi；毛細(xì)管電壓：4 500 V。4種硝基呋喃類代謝物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 超聲時間優(yōu)化

超聲提取是一種在較低溫度下進(jìn)行的高效、適用性廣的前處理技術(shù)[13-14]。為進(jìn)一步優(yōu)化超聲時間，本研究固定1.3.2的樣品前處理條件，探究超聲時間0 h、0.5 h、1.0 h和2.0 h對4種硝基呋喃類代謝物回收率的影響。由圖1可知，超聲時間1 h時，4種硝基呋喃類代謝物的回收率達(dá)到100%，而當(dāng)超聲時間超過1 h時，AOZ、AHD提取效率不受影響，SEM、AMOZ提取效率呈下降趨勢，因此，本研究選擇最佳超聲時間為1 h。

2.1.2 衍生時間優(yōu)化

固定1.3.2的樣品前處理條件，探究衍生時間0 h、2 h、3 h、4 h和5 h對4種硝基呋喃類代謝物回收率的影響。由圖2可知，隨著衍生時間的延長，4種硝基呋喃類代謝物的回收率均呈上升趨勢，當(dāng)衍生時間為5 h時，AOZ、AHD、SEM和AMOZ的回收率均達(dá)到100%。因此，本研究選擇最佳衍生時間為5 h。

2.1.3 衍生溫度優(yōu)化

固定1.3.2的樣品前處理條件，探究衍生溫度37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和60 ℃對4種硝基呋喃類代謝物回收率的影響。由圖3可知，衍生溫度在45 ℃時，AOZ、AHD、SEM和AMOZ的回收率均達(dá)到100%，但當(dāng)衍生溫度繼續(xù)升高時，SEM、AMOZ的回收率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于溫度升高會引起SEM、AMOZ這2種代謝物的降解。因此，本研究選擇最佳衍生溫度為45 ℃。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本研究采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，探究了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、2 mmol·L-1乙酸銨水溶液-乙腈、2 mmol·L-1乙酸銨水溶液-甲醇、含2 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液-乙腈和含2 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液-甲醇這6種流動相的分離及出峰效果。結(jié)果表明，含乙酸胺的流動相使得4種硝基呋喃類代謝物及內(nèi)標(biāo)的色譜峰型更加的穩(wěn)定，特別是AOZ不會再出現(xiàn)裂峰；而含甲酸流動相的目標(biāo)物分離效果更好，出峰時間間隔較長；甲醇體系的流動相雖然色譜峰更尖銳，但會導(dǎo)致質(zhì)譜系統(tǒng)的壓力比使用乙腈時高出約100 bar，對設(shè)備和色譜柱的損耗較大。因此，本研究選擇含2 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相。

2.3 方法驗證

2.3.1 線性方程和檢出限

取通過1.3.1方法得到的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.3.3液質(zhì)條件進(jìn)行測定，以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，經(jīng)過衍生的樣品質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)R，以3倍信噪比計算方法檢出限，10倍信噪比計算方法定量限。由表2可知，4種硝基呋喃類代謝物在0.5～20.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999，檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.3.2 回收率和精密度

稱取海參陰性樣品2.00 g（精確至±0.01 g），加標(biāo)水平濃度分別為1.0 μg·kg-1、3.0 μg·kg-1、8.0 μg·kg-1，每個水平濃度平行測定6次，按1.3.2和1.3.3進(jìn)行樣品前處理和測定。依據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，AOZ、AMOZ、AHD和SEM的平均回收率在97.3%～103.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.94%～3.15%，表明該方法回收率和精密度良好。

2.4 實際樣品測定

采用本文建立的方法檢測在養(yǎng)殖海域采集的100批次海參樣品，結(jié)果表明，海參樣品共檢測出呋喃唑酮類代謝物11批次，其中，有4批次檢測出AHD，2批次檢測出SEM。說明目前海參中仍存在硝基呋喃類藥物的污染，養(yǎng)殖戶仍有違規(guī)使用禁用藥物硝基呋喃的情況，這一情況需要引起相關(guān)部門的高度重視，并采取相應(yīng)措施。

3 結(jié)論

本文通過對樣品前處理中超聲時間、衍生時間、衍生溫度，以及儀器條件中流動相的優(yōu)化，建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速、準(zhǔn)確測定海參中硝基呋喃類代謝物的檢測方法，通過方法學(xué)驗證評估，該方法具有準(zhǔn)確度高、回收率和精密度良好的優(yōu)勢，同時可將檢測時間縮短至7～9 h，且操作簡便，無須昂貴的前處理設(shè)備，滿足海參交易市場的檢測需求，有助于保障海參產(chǎn)品的質(zhì)量安全和促進(jìn)水產(chǎn)品行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]韋豪華，張紅玲，李興太.海參化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2017，8（6）：2054-2061.

[2]王婧媛，王聯(lián)珠，孫曉杰，等.海參加工工藝、營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（11）：2749-2755.

[3]胡軍娜，馬娟，余煒.水產(chǎn)養(yǎng)殖病害特點及防治技術(shù)[J].河南水產(chǎn)，2019（4）：13-15.

[4]戴欣，李改娟.水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留的危害、影響以及控制措施[J].吉林水利，2011（9）：61-62.

[5]郭添榮，韓世鶴，吳文林，等.UPLC-MS/MS法快速檢測人工養(yǎng)殖淡水魚中硝基呋喃類代謝物[J].環(huán)境化學(xué)，2022，41（11）：3534-3543.

[6]王群，呂海燕，宋懌.硝基呋喃類在水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境中的消解規(guī)律研究進(jìn)展[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2014，4（6）：16-21.

[7]胡家勇，柳鑫，張莉，等.食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2024，15（4）：148-159.

[8]邢麗紅，李兆新，孫偉紅，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的殘留量[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2017，8（4）：1233-1239.

[9]張秀妍，馬琳，王慧龍.海參和海參苗種中硝基呋喃類代謝物殘留的液質(zhì)聯(lián)用檢測法[J].口岸衛(wèi)生控制，2012，17（6）：24-28.

[10]楊鵬.水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物及其代謝物的LC-MS/MS檢測方法研究和應(yīng)用[D].衡陽：南華大學(xué)，2019.

[11]于丁一，嚴(yán)忠雍，朱敬萍，等.四合一膠體金試紙條快速檢測水產(chǎn)品中的硝基呋喃代謝物[J].理化檢驗（化學(xué)分冊），2019，55（3）：364-367.

[12]胡金春，張曉輝.水產(chǎn)品中氯霉素及四種硝基呋喃代謝物殘留快速檢測方法研究[J].福建分析測試，2016，25（6）：1-4.

[13]王猛，王康康，楊雪麗，等.超聲輔助衍生—液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測魚肉中4種硝基呋喃類代謝物殘留[J].疾病預(yù)防控制通報，2020，35（3）：28-31.

[14]李招，李劍，徐巧.UPLC-MS/MS法測定雞肉中5種硝基呋喃代謝物[J].食品工業(yè)，2023，44（9）：282-286.