【摘要】 目的：評估改良抗酸染色法結(jié)合GeneXpert法在提高疑似肺結(jié)核患者痰中結(jié)核分枝桿菌檢出率的有效性。方法：選取2022年1月—2023年1月贛州市第五人民醫(yī)院收治的100例疑似肺結(jié)核患者作為研究對象。采用改良抗酸染色法和GeneXpert法檢測結(jié)核分枝桿菌含量，以病理學聯(lián)合臨床檢查診斷結(jié)果為金標準，使用受試者操作特征（ROC）曲線分析兩種方法單獨及聯(lián)合檢測的診斷效能。結(jié)果：兩種方法對不同濃度結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。改良抗酸染色法對結(jié)核分枝桿菌陽性診斷的一致性中等（Kappa=0.500）；GeneXpert法及聯(lián)合檢測對結(jié)核分枝桿菌陽性診斷的一致性較好（Kappa=0.822、0.950）。ROC曲線分析顯示，聯(lián)合檢測的曲線下面積（AUC）為0.986，高于改良抗酸染色法、GeneXpert法的0.792、0.933。結(jié)論：改良抗酸染色法結(jié)合GeneXpert法能顯著提高疑似肺結(jié)核患者痰中結(jié)核分枝桿菌的檢出率，減少漏診，對于提早診斷和切斷肺結(jié)核的傳播鏈具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 肺結(jié)核 結(jié)核分枝桿菌 抗酸染色

Application of Modified Acid-Fast Staining Combined with GeneXpert Method in Enhancing the Detection of Mycobacterium Tuberculosis in Sputum of Suspected Pulmonary Tuberculosis Patients/YANG Liu， WANG Peixing， LAI Xiang， ZHANG Xin， LAI Xiaoju. //Medical Innovation of China， 2024， 21（24）： -133

[Abstract] Objective： To evaluate the effectiveness of modified acid-fast staining combined with GeneXpert method in enhancing the detection rate of mycobacterium tuberculosis in sputum of patients with suspected pulmonary tuberculosis. Method： A total of 100 suspected pulmonary tuberculosis patients admitted to the Fifth People's Hospital of Ganzhou from January 2022 to January 2023 were selected as the study objects. Modified acid-fast staining and GeneXpert method were used to detect the content of mycobacterium tuberculosis. The diagnostic results of combined pathological and clinical examination were taken as the gold standard， and the diagnostic efficiency of the two methods was analyzed by receiver operating characteristic （ROC） curve. Result： The results of different concentration of mycobacterium tuberculosis detected by two methods were compared， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The positive diagnosis of mycobacterium tuberculosis by modified acid-fast staining was moderately consistent （Kappa=0.500）. GeneXpert method and combined detection showed good consistency in positive diagnosis of mycobacterium tuberculosis （Kappa=0.822， 0.950）. ROC curve analysis showed that area under curve （AUC） of combined detection was 0.986， which was higher than 0.792 and 0.933 of modified acid-fast staining and GeneXpert method. Conclusion： Modified acid-fast staining combined with GeneXpert method can significantly improve the detection rate of mycobacterium tuberculosis in sputum of patients with suspected pulmonary tuberculosis， reduce missed diagnosis， and have important significance for early diagnosis and cutting off the transmission chain of tuberculosis.

[Key words] Pulmonary tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Acid-fast staining

First-author's address： Department of Clinical Laboratory， the Fifth People's Hospital of Ganzhou， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.24.029

結(jié)核病是一種慢性的呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，主要由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，不僅影響肺部（肺結(jié)核是最常見的形式），還可能侵犯身體的其他多個器官組織[1-2]。早期準確診斷對于有效控制肺結(jié)核的傳播至關(guān)重要，但由于結(jié)核分枝桿菌在臨床樣本中的低濃度及其生長緩慢的特性，使得早期診斷成為一大挑戰(zhàn)。改良抗酸染色法簡單、快速、易行和較可靠，但欠敏感，通常菌量≥10條/mL方能檢測陽性，尤其在病原體含量較低的樣本中，傳統(tǒng)的檢測方法已不能滿足臨床快速診斷的需求[3-4]。近年來，分子生物學技術(shù)的發(fā)展為結(jié)核病的診斷提供了新的方法。GeneXpert MTB/RIF檢測作為一種快速分子診斷技術(shù)，能夠在短時間內(nèi)同時檢測結(jié)核分枝桿菌和對利福平耐藥性的存在。鑒于此，本研究評估改良涂片抗酸桿菌鏡檢法聯(lián)合GeneXpert法檢測在提高疑似肺結(jié)核患者痰中結(jié)核分枝桿菌檢出率中的有效性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年1月—2023年1月贛州市第五人民醫(yī)院收治的100例疑似肺結(jié)核患者作為研究對象。納入標準：（1）臨床癥狀和體征符合文獻[5]《肺結(jié)核基層合理用藥指南（2020）》中疑似病例診斷標準；（2）胸部X光或CT檢查提示肺結(jié)核可能；（3）未接受過抗結(jié)核治療或抗結(jié)核治療未超過1周。排除標準：（1）同時患有其他類型的肺部感染，如肺炎、肺癌等；（2）免疫系統(tǒng)功能嚴重受損，如HIV感染、長期使用免疫抑制劑；（3）過去1個月內(nèi)接受過其他試驗性藥物治療。其中男55例，女45例；年齡33～80歲，平均（47.8±7.5）歲；持續(xù)性咳嗽和咳痰80例，發(fā)熱、盜汗40例；有既往結(jié)核病史或接觸史20例；婚姻狀況：已婚72例，未婚18例，離異或喪偶10例；吸煙史45例，飲酒史30例。本研究經(jīng)贛州市第五人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或家屬知情同意本研究。

1.2 方法

1.2.1 實驗儀器 （1）儀器：顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司，WM710R枝晶顯微鏡）、離心機[賽默飛世爾科技（中國），Sorvall ST8]、電熱板（力辰科技，DB-XGW）、GeneXpert儀器（Cepheid公司，GX-I）、生物安全柜（上海貝茵生物，A2生物安全柜）。（2）試劑：5%次氯酸鈉溶液（中鼎生物，ZDSW 250 mL/瓶）、卡爾柏氏紅染料（曉柚生物科技，X11155）、甲基藍（邁瑞爾，M38055）、GeneXpert檢測盒（Cepheid公司，MTB/RIF）。

1.2.2 檢測方法 （1）樣本收集和處理：所有疑似肺結(jié)核患者均在早晨空腹時收集痰液樣本。確保第一份清晨痰和第二份即時痰或者不同時間的2份即時合格痰，且最好在24 h內(nèi)收集和數(shù)小時內(nèi)檢測，無痰患者可采取誘導痰[6]。（2）改良抗酸染色法：樣本離心濃縮，提高結(jié)核分枝桿菌在玻片上的濃度，加入5%次氯酸鈉溶液處理痰液，取20～50 μL濃縮后的樣本涂抹在多個玻片上，確保每個玻片上有足夠的細胞和細菌量，將玻片在火焰上加熱固定，使用卡爾巴寧染液染色，使用甲醇洗滌劑去除多余染料，涂片封片，并在顯微鏡下檢查染色的玻片，過觀察粉紅色染色的酸性桿菌確定結(jié)核分枝桿菌的存在和數(shù)量，從而確立檢測結(jié)果。（3）GeneXpert法：①樣本準備，按照GeneXpert系統(tǒng)的使用說明書，將離心15 min后分離上清液的樣本加入沉淀兩倍處理液，置于檢測盒中。②儀器分析，將檢測盒放入GeneXpert儀器中，按照制造商的程序運行。③結(jié)果解讀，儀器自動分析樣本，并輸出是否檢測到結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性。

1.2.3 判定標準 （1）金標準診斷：所有痰樣本的最終診斷結(jié)果以病理學檢查和臨床檢查的綜合判斷為準。包括胸部X光或CT檢查、癥狀評估及必要時的組織病理學檢查。（2）改良抗酸染色法判定標準：通過肉眼觀察在培養(yǎng)基上沒有發(fā)現(xiàn)斜面細菌菌落，并且在涂片經(jīng)過抗酸染色后，在顯微鏡下觀察不到抗酸菌，判定為陰性。相反，如果肉眼能在培養(yǎng)基上觀察到細菌菌落生長，并且涂片在經(jīng)過抗酸染色后，在100個高倍鏡視野中發(fā)現(xiàn)1根及以上結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果為陽性。（3）GeneXpert法判定標準：GeneXpert的檢測結(jié)果通過GeneXpert系統(tǒng)測量熒光信號和應用內(nèi)置算法來確定，結(jié)果由系統(tǒng)自動報告并展示在“預覽結(jié)果”界面上。較低的CT（循環(huán)閾值）值表示DNA模板的初始濃度較高，而較高的CT值則意味著DNA模板的初始濃度較低。（4）聯(lián)合檢測判定：如果在兩種檢測方法中的任何一種呈陽性，那么聯(lián)合檢測的結(jié)果將被判定為陽性。

1.3 觀察指標及評價標準

（1）結(jié)核分枝桿菌含量檢測：統(tǒng)計兩種方法檢測不同濃度級別結(jié)核分枝桿菌含量的效能，按照世界衛(wèi)生組織（WHO）和國際防癆聯(lián)盟（IUATLD）推薦的標準[7]，將其分為陰性（在至少100個高倍鏡視野中未見到結(jié)核分枝桿菌）、稀疏（在100個高倍鏡視野中發(fā)現(xiàn)1～9根結(jié)核分枝桿菌）、1+（在100個高倍鏡視野中發(fā)現(xiàn)10～99根結(jié)核分枝桿菌）、2+（在至少一個視野中平均發(fā)現(xiàn)1～10根結(jié)核分枝桿菌）、3+（在至少一個視野中平均發(fā)現(xiàn)超過10根結(jié)核分枝桿菌）。（2）效能評估：比較兩種方法的敏感度、特異度。（3）受試者操作特征（ROC）曲線分析：使用SPSS軟件，對兩種方法的ROC曲線進行分析，計算各種方法的曲線下面積（AUC），評估其效能。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，Kappa值用于評估分診結(jié)果一致性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對結(jié)核分枝桿菌不同濃度含量的檢測結(jié)果比較

兩種方法對不同濃度結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=1.978，P=0.048），見表1。

2.2 兩種方法單獨及聯(lián)合檢測結(jié)核分枝桿菌的診斷結(jié)果比較

以病理學檢查和臨床檢查的綜合判斷作為金標準，共檢測了100例患者，其中檢出陰性31例，陽性69例；改良抗酸染色法檢出陰性50例，陽性50例，一致性中等（Kappa=0.500）；GeneXpert法檢出陰性37例，陽性63例，一致性較好（Kappa=0.822）；聯(lián)合檢出陰性33例，陽性67例，一致性較好（Kappa=0.950）。見表2。

2.3 兩種方法單獨及聯(lián)合檢測的診斷效能比較

ROC曲線分析顯示，聯(lián)合檢測的AUC為0.986，高于改良抗酸染色法、GeneXpert法的0.792、0.933，見表3、圖1。

3 討論

肺結(jié)核是指發(fā)生在肺組織、氣管、支氣管和胸膜的結(jié)核病變，占各器官結(jié)核病總數(shù)的80%～90%，肺結(jié)核類型包括原發(fā)性肺結(jié)核、血行播散性肺結(jié)核、繼發(fā)性肺結(jié)核、氣管支氣管結(jié)核和結(jié)核性胸膜炎[8-9]。由于耐藥菌株的產(chǎn)生和社會流動人口的增多等生物學和社會學因素，結(jié)核病已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題[10]。丁運生等[11]提出，患者的間歇性排放細菌和樣本中較低的細菌含量都將導致檢測結(jié)果不準確，如標本的儲存條件和操作人員的技術(shù)水平，都可能導致培養(yǎng)結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性。改良抗酸染色比傳統(tǒng)方法具有顯著優(yōu)勢，是臨床上早期快速診斷首選技術(shù)，GeneXpert是WHO推薦的結(jié)核病實驗室診斷中重要診斷試驗[12-13]。本研究通過對100例疑似肺結(jié)核患者的痰樣本進行分析，本研究旨在驗證改良抗酸染色法聯(lián)合GeneXpert法在提高結(jié)核分枝桿菌檢出率方面的優(yōu)勢，并與傳統(tǒng)的直接涂片染色法進行比較。

本研究結(jié)果顯示，改良抗酸染色法聯(lián)合GeneXpert法在敏感度、特異度方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的改良抗酸染色法。這說明該聯(lián)合方法在識別肺結(jié)核病原體方面更為有效，特別是在早期低濃度肺結(jié)核患者檢測中表現(xiàn)出更高的敏感性。這一點對于肺結(jié)核的早期發(fā)現(xiàn)和及時治療尤為重要，因為早期診斷和治療是切斷傳播鏈、控制疾病流行的關(guān)鍵。GeneXpert是一種基于半嵌套式實時熒光定量PCR技術(shù)的全自動核酸檢測方法，采用的是商業(yè)化的盒式檢測技術(shù)通過識別結(jié)核分枝桿菌特有的rpoB基因序列，能在2 h內(nèi)快速檢測出結(jié)核分枝桿菌的存在[14]。在臨床上診斷肺結(jié)核或耐藥肺結(jié)核時，常面臨無痰、少痰或痰涂片陰性等挑戰(zhàn)，這增加了診斷和治療的難度，不同級別醫(yī)療機構(gòu)在檢測能力上也存在較大差異，GeneXpert技術(shù)不僅可以快速檢測結(jié)核分枝桿菌，還能同時鑒定耐多藥結(jié)核菌株，能夠迅速實時地監(jiān)控含有不同耐藥基因的耐藥腸桿菌科細菌（CRE）的分布趨勢和流行特征，這意味著使用改良抗酸染色法聯(lián)合GeneXpert法不僅提高了檢測效率，還能為臨床醫(yī)生提供重要信息，幫助他們根據(jù)不同的耐藥基因表型制定更合理的用藥策略[15-16]。肺結(jié)核確診主要依賴于痰涂片的抗酸染色和痰中結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)，但這兩種方法都有其明顯的限制，傳統(tǒng)的抗酸染色技術(shù)中使用酒精燈加熱，這會帶來一些問題，如火焰加熱可能導致液體飛濺和快速干涸，染液使用量大，及在加熱過程中苯酚不斷揮發(fā)等，而結(jié)核分枝桿菌進行培養(yǎng)的方法，其檢測周期過長，操作繁瑣且技術(shù)復雜，因此在推廣上仍存在困難[17-18]。GeneXpert法能夠在胸腹水、腦脊液、尿、糞等多種樣本中進行，且有效縮短患者的診斷時間，提高診斷效率，優(yōu)于抗酸桿菌涂片和結(jié)核菌培養(yǎng)傳統(tǒng)診斷方法，然而也應當注意到改良抗酸染色法聯(lián)合GeneXpert法的實施成本和技術(shù)要求[19-20]。李靜等[21]在其研究中認為，由于設(shè)備昂貴，針對我國結(jié)核病高負擔的現(xiàn)狀，認為其不利于進行推廣應用在資源有限的地區(qū)，高成本可能成為限制其廣泛應用的一個因素。因此，未來的研究應著重于簡化檢測流程、降低成本，并探索如何在不同資源環(huán)境下有效地應用這一技術(shù)。這兩種方法的檢驗標準旨在確保實驗操作的標準化和規(guī)范化，從而保證實驗結(jié)果的準確性和重復性。直接涂片抗酸染色法作為傳統(tǒng)方法，其操作簡便、成本低廉，但敏感度有限；而改良抗酸染色法聯(lián)合GeneXpert法則結(jié)合了傳統(tǒng)方法的優(yōu)點和分子診斷技術(shù)的高敏感度，有望提高檢出率。通過對比這兩種方法，本研究旨在評估改良方法在臨床應用中的潛在價值。為進一步提高肺結(jié)核的檢出率和診斷準確性，未來研究可考慮結(jié)合更多的生物標志物檢測和分子生物學技術(shù)。例如，通過分析患者痰液中的特定蛋白質(zhì)或RNA分子，可能進一步提高對肺結(jié)核的診斷敏感度和特異度。

綜上所述，本研究強調(diào)了改良抗酸染色法聯(lián)合GeneXpert法在肺結(jié)核早期診斷中的重要性，對于進一步的臨床應用和公共衛(wèi)生策略制定提供了有價值的參考。未來研究應關(guān)注該技術(shù)在不同環(huán)境下的可行性、成本效益比及與其他生物標志物檢測方法的結(jié)合應用。

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（收稿日期：2024-01-30） （本文編輯：馬嬌）

*基金項目：贛州市衛(wèi)生健康委市級科研計劃項目（2022-2-131）

①贛州市第五人民醫(yī)院檢驗科 江西 贛州 341000

通信作者：楊柳