摘 要：采用含手性識(shí)別劑的乙醇/硫酸銨雙水相體系對(duì)馬尼地平對(duì)映體進(jìn)行手性識(shí)別研究。采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了手性識(shí)別劑的選擇、識(shí)別劑的濃度、待分離組分的濃度、pH等幾個(gè)方面的影響，確定了最佳分離條件：體系pH為3.0，HP-β-CD濃度為0.4mmol·L-1，馬尼地平濃度為0.4mmoL·L-1，以乙腈-0.2%三乙胺溶液（25∶75）為流動(dòng)相對(duì)馬尼地平對(duì)映體分離效果較好，精密度和重現(xiàn)性好，能滿足馬尼地平對(duì)映體的分離。

關(guān) 鍵 詞：雙水相體系；手性識(shí)別；馬尼地平

中圖分類號(hào)：TQ201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004-0935（2024）08-1164-03

馬尼地平是1，4-二氫吡啶類抗高血壓藥物，通過(guò)抑制細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流，松弛血管平滑肌而起到降壓作用，相比于其他類型鈣拮抗劑類藥物療效顯著，擴(kuò)血管作用強(qiáng)，且副作用小。馬尼地平4位C為不對(duì)稱碳原子，存在兩個(gè)對(duì)映體，人體中的酶和受體一般都是手性的，當(dāng)手性藥物進(jìn)入人體后，其藥理作用是通過(guò)與體內(nèi)大分子之間的嚴(yán)格手性匹配和手性識(shí)別而實(shí)現(xiàn)的，研究表明馬尼地平S構(gòu)型的治療作用強(qiáng)于R構(gòu)型，因此對(duì)其對(duì)映體的拆分是獲得單一對(duì)映體重要途徑之一，這對(duì)于深入研究其對(duì)映體藥理、生理、毒理學(xué)具有重要的意義[1-4]。

雙水相萃取技術(shù)是通過(guò)在水相中加入成相物而自發(fā)形成的互不相溶的雙水相。將雙水相技術(shù)用于手性藥物對(duì)映體的拆分，不僅保持了傳質(zhì)速度快、萃取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、易于放大等優(yōu)點(diǎn)，而且有機(jī)溶劑使用和殘留少，甚至可完全不使用有毒試劑，符合綠色化學(xué)的發(fā)展要求，特別適合臨床用途的手性藥物分離，具有較好的應(yīng)用前景[5-12]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

島津高效液相色譜儀，日本島津公司；RE5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，河南儀源儀器有限公司；pHS-3C數(shù)顯酸度計(jì)，上海雷磁有限公司；分析天平（萬(wàn)分之一），日本島津公司；SB25-12DTDN超聲清洗器，寧波新芝儀器有限公司。

鹽酸馬尼地平對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)樣品（日本Daicel公司，批號(hào)： 2021052102） ; S-鹽酸馬尼地平標(biāo)準(zhǔn)品 （日本Daicel公司，批號(hào)： 20210715，純度： 100% ） ; Ｒ-鹽酸馬尼地平標(biāo)準(zhǔn)品 （日本 Daicel 公司，批號(hào)： 2021715，純度： 100% ） ；β-CD、羧甲基-β-CD、甲基-β-CD、羥丙基-β-CD（湖北常奧藥業(yè)）；L-苯丙氨酸，L-甘氨酸，L-色氨酸；L-谷氨酸（深圳金福源生物科技）；硫酸銨（廊坊鵬彩精細(xì)化工）；無(wú)水乙醇、甲醇（分析純，鄭州化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純，默克公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1  雙水相的配制

雙水相體系配制：稱取一定量的（NH4）2SO4，加水超聲溶解，加入50%的乙醇，混勻放置備用。

1.2.2 雙水相法分離對(duì)映體

在試管中加入一定濃度的馬尼地平溶液和手性識(shí)別劑，另外再加入1.2.1配制好的雙水相體系，加入pH緩沖液調(diào)節(jié)體系的pH為3.0，待溶液完全溶解，轉(zhuǎn)至恒溫振動(dòng)器上在一定溫度下振蕩2h，待其溶液穩(wěn)定后在刻度試管上讀取上下相的體積并計(jì)算相比，分離上下相溶液，分取上下相溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，并計(jì)算馬尼地平的分配系數(shù)K和分離因子α。

1.2.3 HPLC分析

本文采用高效液相色譜法對(duì)馬尼地平對(duì)映體進(jìn)行檢測(cè)，其色譜條件為：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%三乙胺溶液（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1mL·min-1，進(jìn)樣量10μL；柱溫：室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的篩選及對(duì)映體分離條件的優(yōu)化

影響雙水相萃取的因素較多，溶質(zhì)在雙水相中分配的差異主要取決于溶質(zhì)與雙水相體系中成相組分間的各種相互作用。實(shí)驗(yàn)篩選合適的雙水相體系，并采用單因素實(shí)驗(yàn)方法考察了手性識(shí)別劑的選擇、識(shí)別劑的濃度、待分離組分的濃度、pH等幾個(gè)方面的影響。

2.1.1 雙水相體系的選擇

將無(wú)水乙醇與不同的無(wú)機(jī)鹽按一定比例混合，初步篩選雙水相的成相物。結(jié)果只有無(wú)水乙醇/（NH4）2SO4與無(wú)水乙醇/K2HPO4·3H2O雙水相體系較穩(wěn)定，故以這兩種體系做進(jìn)一步的篩選。

雙水相體系的相圖是選擇雙水相體系的重要依據(jù)之一，相圖直接反映了體系形成雙水相的難易程度、穩(wěn)定性、成相區(qū)域等信息，可依據(jù)相圖選擇體系的組成及其比例。由相圖可知乙醇/（NH4）2SO4體系穩(wěn)定性較好，易調(diào)節(jié)，分相迅速，上下相的黏度適中。

2.1.2 手性識(shí)別劑種類對(duì)馬尼地平萃取拆分的影響

按1.2.1根據(jù)上述選取的雙水相體系中分別加入不同種類的手性識(shí)別劑（β-環(huán)糊精、氨基酸類及其衍生物），以考察不同手性識(shí)別劑對(duì)馬尼地平對(duì)映體萃取拆分行為的影響，結(jié)果見(jiàn)表1至表2。

由表1數(shù)據(jù)可知，ME-β-CD，SBE-β-CD，β-CD這三種環(huán)糊精的KS、KR的差異性很小，分離因子α均接近1，說(shuō)明這三類環(huán)糊精類手性識(shí)別劑對(duì)馬尼地平的識(shí)別作用很弱，這主要是和β-環(huán)糊精類手性識(shí)別劑的主客體識(shí)別機(jī)理有關(guān)，即β-環(huán)糊精疏水的空腔決定。其中HP-β-CD的分離因子α最大，這是因?yàn)镠P-β-CD對(duì)許多化合物具有優(yōu)良的包絡(luò)作用，提高被包絡(luò)物質(zhì)的溶解性和穩(wěn)定性。由表2可知：以這4種氨基酸作手性識(shí)別劑時(shí)，KR與KS接近，α接近1，說(shuō)明氨基酸對(duì)馬尼地平對(duì)映體拆分能力較弱；故不適宜選用4種氨基酸類物質(zhì)作為手性識(shí)別劑。故實(shí)驗(yàn)最終選擇HP-β-CD作為手性識(shí)別劑。

2.1.3 HP-β-CD環(huán)糊精濃度對(duì)馬尼地平拆分的影響

固定馬尼地平對(duì)映體濃度為0.40mmol·L-1，溫度為25℃，溶液pH3.0的條件下，改變不同初始濃度HP-β-CD對(duì)馬尼地平對(duì)映體K和α的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，KR與KS的變化隨著HP-β-CD的濃度先增大后減小，α的變化與 HP-β-CD的識(shí)別能力成正比，當(dāng)HP-β-CD的濃度為0.4mmol·L-1時(shí)，α最大，故選擇HP-β-CD濃度為0.4mmol·L-1。

2.1.4 pH對(duì)馬尼地平分配行為的影響

pH變化對(duì)手性藥物對(duì)映體的分離影響很大，主要由于氫鍵作用影響藥物在上相和下相的分配比。本文固定馬尼地平對(duì)映體濃度為0.40mmol·L-1，固定HP-β-CD的濃度為0.4 mmol·L-1，溫度為25℃，考察不同pH條件下對(duì)馬尼地平對(duì)映體K和α的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，馬尼地平的α隨著pH增大先增加后減小，在pH 3.0時(shí)達(dá)到最佳分離度，α為2.31，隨后α隨pH增大而減小，主要是由于馬尼地平顯堿性，在酸性的環(huán)境下，更有利于馬尼地平和手性識(shí)別劑的結(jié)合，在酸性條件下對(duì)映體在上相、下相的分配更完全，但當(dāng)pH小于3時(shí)，酸性增強(qiáng)，一方面給雙相的形成帶來(lái)了困難，另一方面與手性識(shí)別劑間的氫鍵作用力減弱，從而影響馬尼地平對(duì)映體的分離。

2.1.5 馬尼地平濃度對(duì)手性萃取拆分的影響

在乙醇/硫酸銨雙水相體系中，HP-β-CD為0.4 mmoL·L-1，pH=3.0條件下，分別考察不同濃度的馬尼地平對(duì)拆分的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，馬尼地平的α隨著馬尼地平溶液濃度的增大先增大后減小，在此過(guò)程中，因?yàn)樵诘蜐舛葧r(shí)，馬尼地平和手性識(shí)別劑的結(jié)合較少，致使α較小，當(dāng)濃度增大后達(dá)到，馬尼地平對(duì)映體濃度為0.4mmoL·L-1時(shí)，其對(duì)映體有很好的分離，分離因子α高達(dá)2.29。

2.2 &nc5561d9a6d0f5eeb6c555e50a143b38cbsp;馬尼地平中對(duì)映體的含量測(cè)定

本文采用乙腈、甲醇與不同濃度二乙胺、三乙胺、氨水的不同配比作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，以乙腈-0.2%三乙胺溶液（25∶75）系統(tǒng)為流動(dòng)相對(duì)馬尼地平對(duì)映體分離效果較好。經(jīng)過(guò)雙水相萃取后，兩種對(duì)映體成分得到良好的分離，分離度R都大于1.5。所以，本文選擇以乙腈-0.2%三乙胺（25∶75）作為流動(dòng)相，色譜峰峰形好、對(duì)稱，柱效更高，精密度和重現(xiàn)性好，能滿足馬尼地平對(duì)映體的分離。

3結(jié)論

以乙醇/硫酸銨的雙水相體系，分別選擇不同種類的手性識(shí)別劑（如環(huán)糊精及其衍生物、天然氨基酸等），在雙水相體系中分別考察其拆分效果，根據(jù)拆分效果考察識(shí)別劑濃度、pH、待測(cè)物濃度等因素對(duì)手性分離因子的影響，得到相應(yīng)的手性識(shí)別分離最佳體系。雙水相分離萃取可連續(xù)操作，容易放大，操作簡(jiǎn)便，且溶劑可以循環(huán)利用，為馬尼地平對(duì)映體的分離純化提供一種方便有效方法，具有工業(yè)化生產(chǎn)開發(fā)的前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］馬美玲，劉玉海，陳東，等.馬尼地平對(duì)映異構(gòu)體的手性拆分及其鹽酸鹽的藥效學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2018，53（11）：888-893.

［2］王寶瑩，李鶴芳，郭艷敏.鹽酸馬尼地平對(duì)輕中度老年高血壓患者動(dòng)脈順應(yīng)性和微量白蛋白尿的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2019，27（10）：78-80.

［3］賀順龍，李飛，陳運(yùn)榮.二氫吡啶酮的不對(duì)稱催化合成進(jìn)展[J].石油化工高等學(xué)校學(xué)報(bào)，2021，34（2）：1-8.

［4］魏加莉，周靜，李寧，等.二氫吡啶類鈣拮抗劑藥物基因組學(xué)的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究，2020，39（01）：41-43.

［5］ALBERTSSONP A. Partition of Cell Particles and Macromolecules[M]. NY： Wiley，1986.

［6］KULA M R，KRONE K H，HUSTEDT.Advances in Biochemical Engineering[M]. NY： Fiedhte A，1982：73-118.

［7］張璟，邢娜，韓楊.雙水相萃取技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用[J].山西化工，2023，43（10）：112-114.

［8］王世云，馮金華，黃思玉，等.乙醇—硫酸銨雙水相體系萃取蝦青素的研究[J].河北漁業(yè)，2023（10）：1-7.

［9］王云穎，尚彥文，高燦，等.乙醇/硫酸銨雙水相體系萃取純化紫甘薯色素[J].煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與工程版），2023，36（2）：248-252.

［10］孟祥瑞. 鹽析及雙水相萃取法分離尼古丁水溶液的研究[D].西安：西北大學(xué)，2023.

［11］俞耀文，戴國(guó)慶，華浩立，等.乙醇-硫酸銨雙水相體系提取桃花總黃酮及其抗氧化性能[J].食品工業(yè)科技，2022，43（04）：187-195.

［12］楊輝，王治寶.乙醇-硫酸銨雙水相體系提取牛膝菊中總黃酮及其抗氧化活性研究[J].飼料研究，2022，45（13）：88-92.