摘要 以核桃枝枯病菌（Alternaria alternate）為對象，研究溫度、碳源、氮源、光照、培養(yǎng)基和pH等對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，pH 7和全黑暗有利于核桃枝枯病菌的菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)；25 ℃有利于菌絲生長，25～30 ℃有利于產(chǎn)孢，20～30 ℃有利于孢子萌發(fā)；最適生長的碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母浸粉、KNO3和蛋白胨，最適產(chǎn)孢的碳源和氮源分別為山梨醇和KNO3，最適孢子萌發(fā)的碳源和氮源分別為乳糖和NH4NO3；PSA、OA和PDA培養(yǎng)基適合菌絲生長，LB培養(yǎng)基適合產(chǎn)孢，OA培養(yǎng)基適合孢子萌發(fā)。該研究結(jié)果為明確核桃枝枯病的發(fā)生規(guī)律提供理論依據(jù)，也為綜合防治措施的制定提供參考。

關(guān)鍵詞 交鏈格孢菌；生物學(xué)特性；測定

中圖分類號 S436.621.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）17-0133-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.030

Biological Characteristics of Alternaria alternate Causing Walnut Branch Blight in Longnan City， Gansu Province

DENG Xiao-yun1， GAO Meng-chun2， YANG Cheng-de2

（1. Bailongjiang Forestry Management Bureau of Gansu Province， Lanzhou， Gansu 730000;2.College of Plant Protection of Gansu Agricultural University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract The effects of temperature， carbon source， nitrogen source， light， medium and pH on mycelial growth， sporulation and spore germination rate were studied. The results showed that pH 7 and total darkness were conducive to the mycelial growth， sporulation and spore germination of Alternaria alternata; 25 ℃ was optimum to mycelial growth， 25-30 ℃ was optimum to sporulation， and 20-30 ℃ was optimum to spore germination; the optimum carbon source for mycelial growth was soluble starch， the nitrogen source was yeast extract， KNO3 and peptone， the optimum carbon source and nitrogen source for sporulation were sorbitol and KNO3， respectively， and the optimum carbon source and nitrogen source for spore germination were lactose and NH4NO3， respectively; PSA， OA and PDA medium were suitable for mycelial growth， LB medium was suitable for sporulation， and OA medium was suitable for spore germination. The results provide a theoretical basis for clarifying the occurrence rules of walnut branch blight， and also provide a reference for the comprehensive control measures.

Key words Alternaria alternate;Biological characteristics；Determination

作者簡介 鄧小蕓（1975—），女，甘肅蘭州人，工程師，從事林業(yè)有害生物研究。

通信作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事植物病理學(xué)研究。

收稿日期 2023-10-12

核桃（Juglans regia），又名胡桃，為胡桃科胡桃屬落葉喬木，被譽(yù)為世界四大干果之一，其核桃仁含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，并含有人體必需的鈣、磷、鐵等多種微量元素和礦物質(zhì)，以及胡蘿卜素、核黃素等多種維生素。因其具有重要的食療、藥用、觀賞和生態(tài)等價值，分布和栽培遍及世界多個國家和地區(qū)，成為許多國家的重要栽培樹種，也是重要的用材樹種、生態(tài)樹種、經(jīng)濟(jì)樹種和生物質(zhì)能源樹種，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能。我國是世界上最大的核桃生產(chǎn)國和消費(fèi)國［1］，主要分布在甘肅、山西、陜西和四川等地。隨著核桃種植面積的大幅增加，核桃病害頻發(fā)，嚴(yán)重影響核桃的正常生長，核桃產(chǎn)量降低，給種植區(qū)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。核桃枝枯病是一種常見真菌性病害，主要危害枝干，造成枝干枯死，一般發(fā)病率20%左右，重者可達(dá)90%。核桃枝枯病的病原各地有差別，山東主要為Diaporthe nobilis［2］，河南為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）［3］，貴州為越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）［4］，四川為新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）［5］和遼寧為胡桃楸擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis juglandina）［6］等。前期對采自甘肅省隴南市的核桃枝枯病病原鑒定為交鏈格孢菌（A.alternate），為國內(nèi)首次報(bào)道引起核桃枝枯病。因此，筆者以核桃枝枯病的新病原交鏈隔孢菌為對象，測定其生物學(xué)特性，以期為明確甘肅省隴南市核桃枝枯病的發(fā)生規(guī)律提供理論依據(jù)，也為綜合防治措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料。核桃枝枯病菌（A.alternate），保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）；馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）；燕麥培養(yǎng)基（OMA）；玉米培養(yǎng)基（CMA）；查彼培養(yǎng)基（Czapek）；水瓊脂（WA）；察氏培養(yǎng)基（CZA）；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA）；理查培養(yǎng)基（RCM）；胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）［7］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對菌絲生長、產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)的影響。

病原菌培養(yǎng)7 d后，打取直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于溫度為5、15、20、25、30、35和40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，十字交叉法測量菌落直徑；培養(yǎng)12 d后，每個培養(yǎng)皿中加入無菌水10 mL，用軟毛筆刷輕輕洗刷菌落孢子，用移液槍混勻并滴于血球計(jì)數(shù)板上，測定1 mL菌液的產(chǎn)孢量，懸滴法測定孢子萌發(fā)情況并計(jì)算孢子萌發(fā)率［8-10］；3次重復(fù)。

1.2.2 碳源、氮源對菌絲生長、產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)的影響。

以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以NH4NO3、蛋白胨、尿素、酵母浸粉、NH4Cl、（NH4）2SO4、（NH4）2CO3和KNO3為氮源，以山梨醇、麥芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、肌醇、可溶性淀粉和木糖為碳源，制備不同碳源和氮源培養(yǎng)基。將直徑5 mm的菌餅分別接種于不同碳源、氮源培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)［9］，其他方法同“1.2.1”。

1.2.3 光照時間對菌絲生長、產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)的影響。

將直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于完全光照（200 lx）、完全黑暗（0 lx）和光暗交替（200 lx 12 h/0 lx 12 h）的25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)［11-12］。其他方法同“1.2.1”。

1.2.4 培養(yǎng)基對菌絲生長、產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)的影響。

將直徑5 mm的菌餅分別接種于PDA、PSA、WA、CZA、OMA、CMA、MEA、CA、RCM和Czapek培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)［7］，其他方法同“1.2.1”。

1.2.5 pH對菌絲生長、產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)的影響。

用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10和11。接種直徑為5 mm的菌餅于不同pH的培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)［13］，其他方法同“1.2.1”。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理及圖表的制作采用Excel 2013和IBM SPSS Statistics。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

由圖1可知，在5～40 ℃菌絲均能生長，在25 ℃時生長速度最快，菌落直徑達(dá)4.92 cm，顯著高于其他溫度（P<0.05），表明菌絲生長的最適溫度為25 ℃；在5～40 ℃下均能產(chǎn)孢，在25 ℃時產(chǎn)孢量最高，達(dá)2.01×107 CFU/mL，顯著高于其他溫度（P<0.05）；在40 ℃時，產(chǎn)孢量最少，僅為1.25×105 CFU/mL（圖2），表明25 ℃最適產(chǎn)孢；在5～40 ℃下孢子均可萌發(fā)，在20、25和30 ℃時，萌發(fā)率分別為80.33%、88.33%和82.33%，顯著高于其他溫度（P<0.05），但三者間差異不顯著；在40 ℃時，萌發(fā)率最低，僅為51.33%（圖3），表明20～30 ℃最適孢子萌發(fā)。

2.2 碳源對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

由圖4可知，在可溶性淀粉培養(yǎng)基上菌絲生長最快，UemhWjK9vd5nKSfp/96j4w==菌落直徑最大，達(dá)5.12 cm，顯著高于其他碳源（P<0.05）；在木糖培養(yǎng)基上生長最慢，直徑僅為2.83 cm，表明可溶性淀粉為菌絲生長的最適碳源；在以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上，產(chǎn)孢量最高，達(dá)2.91×107 CFU/mL，顯著高于其他碳源（P<0.05）（圖5），表明以山梨醇為碳源最適產(chǎn)孢；在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上，孢子萌發(fā)最快，萌發(fā)率達(dá)91%，顯著高于其他碳源（P<0.05）（圖6），表明乳糖為碳源最適孢子萌發(fā)。

2.3 氮源對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

在以酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基上，病原菌生長速度最快，菌落直徑達(dá)3.18 cm，以KNO3和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上次之，三者間差異不顯著；在（NH4）2CO3培養(yǎng)基上生長最慢，菌落直徑僅為0.62 cm（圖7），表明酵母浸粉、KNO3和蛋白胨是菌絲生長的最適氮源；在以KNO3為氮源的培養(yǎng)基上，產(chǎn)孢量最高，達(dá)1.34×107 CFU/mL，顯著高于其他氮源（P<0.05）（圖8），說明KNO3為最適產(chǎn)孢的氮源；在以NH4NO3為氮源的培養(yǎng)基上，孢子萌發(fā)最快，萌發(fā)率達(dá)91%，顯著高于其他氮源（P<0.05）（圖9），表明NH4NO3為最適孢子萌發(fā)的氮源。

2.4 光照時間對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

全黑暗條件下，菌絲生長最快，菌落直徑達(dá)5.63 cm，顯著高于其他條件（P<0.05）；全光照和12 h 光暗交替時，菌絲生長差異不顯著（圖10），表明全黑暗最適菌絲生長；全黑暗條件下產(chǎn)孢量最大，達(dá)3.58×107 CFU/mL；全光照和光暗交替條件下，病原菌產(chǎn)孢量較低，但差異顯著（圖11），說明全黑暗條件最適病原菌產(chǎn)孢；在全黑暗條件下，病原菌的孢子萌發(fā)最快，萌發(fā)率達(dá)92%，顯著高于其他條件（P<0.05）；在全光照條件下，病原菌孢子萌發(fā)最慢，萌發(fā)率僅為74.33%，顯著低于全黑暗條件（P<0.05）（圖12），說明全黑暗條件最適孢子萌發(fā)。

2.5 培養(yǎng)基對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

病原菌在PSA培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑達(dá)5.43 cm，在OA和PDA培養(yǎng)基上菌落直徑分別為4.85和4.76 cm，與PSA無顯著差異，在MEA培養(yǎng)基上生長最慢，菌落直徑僅為2.53 cm（圖13），表明PSA、OA和PDA培養(yǎng)基最適菌絲生長；在LB培養(yǎng)基上，病原菌產(chǎn)孢量達(dá)7.50×106 CFU/mL，顯著高于其他培養(yǎng)基（P<0.05）（圖14），說明LB培養(yǎng)基最適病原菌產(chǎn)孢；在OA培養(yǎng)基上，孢子萌發(fā)率達(dá)93%，顯著高于其他培養(yǎng)基（P<0.05）（圖15），說明OA培養(yǎng)基最適病原菌的孢子萌發(fā)。

2.6 pH對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

在pH為 4～11下病原菌均能生長，當(dāng)pH為7時，菌絲生長最快，產(chǎn)孢量最高，孢子萌發(fā)最快，菌落直徑、產(chǎn)孢量和萌發(fā)率分別為4.30 cm、1.14×107 CFU/mL和91%，顯著高于其他pH（P<0.05）（圖16～18），表明菌絲生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)的最適pH為7。

3 結(jié)論與討論

枝枯病是植物上的常見病害之一，在蘋果樹［13］、桃樹［14］和欒樹［15］等植物上均有報(bào)道，核桃枝枯病是核桃樹的主要病害之一。該試驗(yàn)主要測定了核桃枝枯病的新病原交鏈格孢菌的生物學(xué)特性。該病菌的菌絲最適生長溫度為25 ℃，與桃樹枝枯病菌桃擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis amygdali）的最適生長溫度一致［14］，但低于蘋果樹枝枯病菌可可毛色二孢（Lasiodoplidia pseudotheobromae）的最適溫度30 ℃［13］，其最適產(chǎn)孢溫度與欒樹枝枯病菌小新殼梭孢（Neofusicocuum parvrm）一致，均為25 ～30 ℃［15］。交鏈格孢菌的最適萌發(fā)溫度為20～30 ℃，與麻風(fēng)樹枝枯病菌（Lasiodoplidia theobromae）一致［16］，在pH 4～11均能生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)，且最適生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)pH為7，與麻風(fēng)樹枝枯病菌［16］和小新殼梭孢［15］相比更適宜在中性環(huán)境。全黑暗條件有利于交鏈格孢菌的菌絲生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)，但桃擬莖點(diǎn)霉［14］、可可毛色二孢［13］和麻風(fēng)樹枝枯病菌［16］等均在全光照條件下適合菌絲生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)。該試驗(yàn)研究了核桃枝枯病病菌的生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)等生物學(xué)特性，為明確其發(fā)生規(guī)律提供了理論依據(jù)，但該病害在田間具體發(fā)生規(guī)律還需進(jìn)一步研究RjTuc0TFJgOazhZue413Fv+BZ5Tn94CSguBkcwsSJRc=。

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