摘要 為了明確樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物（Inonotus obliquus fermentation product， IOFP）作為禽類疫苗佐劑的適用性，選擇商品化禽流感滅活疫苗和鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗分別免疫SPF雞和SPF鴨，并飼喂含0.8% IOFP的飼糧，同時設(shè)置飼喂商品化飼糧的對照組。在免疫后不同時間點采集雞和鴨的外周血，分離血清后分別測定禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）特異性血凝抑制（hemagglutinin inhibition，HI）抗體、鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）特異性抗體及二者中和抗體效價。使用統(tǒng)計學(xué)方法評價IOFP對機體體液免疫反應(yīng)的影響。鴨免疫后28 d使用DTMUV強毒株攻毒，持續(xù)檢測泄殖腔排毒量，以確定IOFP對DTMUV排毒量的影響。結(jié)果顯示，IOFP作為口服佐劑能夠顯著提升AIV、DTMUV疫苗抗體和中和抗體水平，特別是對免疫早期抗體的改善效果尤為顯著。此外，添加IOFP還能夠減少DTMUV的排毒量，縮短排毒時間。由此可見，IOFP是一種禽類病毒性疫苗普遍適用的口服佐劑，對于縮短免疫“空窗期”、提升疫苗保護效果具有較好的改善作用。

關(guān)鍵詞 樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物；禽流感病毒滅活疫苗；鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗；抗體；中和抗體

中圖分類號 S852.5 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）17-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.020

Study on the Enhancement Effect of Oral Adjuvant of Inonotus obliquus on the Humoral Immunity of Avian Vaccines

YANG Shuo1， FEI Zhi-guo1，2，3， GUO Meng-shuai2，3，4 et al

（1.College of Life Science and Food Engineering， Hebei Engineering University， Handan， Hebei 056038;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Disease Prevention and Breeding， Jinan， Shandong 250100;3. Key Laboratory of Livestock and Poultry Bioomics， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Jinan，Shandong 250100;4.College of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Agricultural University， Tai’an， Shandong 271018）

Abstract In order to clarify the applicability of Inonotus obliquus fermentation product （IOFP） as the adjuvants of avain vaccines， commercial avian influenza inactivated vaccine and duck Tembusu virus attenuated live vaccine were selected to immunize SPF chicken and ducks， respectively. SPF chicken in the experimental group were fed with the commercial diet containing 0.8% IOFP， SPF chicken in the control group were fed with the the commercial diet. The peripheral blood from the chicken and ducks was collected at different time points after immunization and the serum was separated to determine the specific hemagglutinin inhibition （HI） antibodies of avian influenza virus （AIV）， specific antibodies of duck Tembusu virus （DTMUV）， and their neutralizing antibody titer. The effects of IOFP on the humoral immune response were evaluated by using the statistical methods.After 28 days post immunization， the ducks were challenged with virulent DTMUV， and the cloacal detoxification volume was detected， so as to confirm the effects of IOFP on the detoxification volume of DTMUV. The results showed that IOFP as oral adjuvant could significantly improve the titers of specific and neutralizing antibodies against AIV and DTMUV， and especially the improvement effect on the antibodies at the early stage. In addition， adding IOFP could reduce the detoxification volume of DTMUV， and shorten the shedding time. Therefore， IOFP was a common oral adjuvant for avian viral vaccines， which had a great improvement effect on shortening the immune “gap period” and improving the protective effect of vaccines.

Key words Inonotus obliquus fermentation product;Avian influenza inactivated vaccine;Duck Tembusu virus attenuated vaccine;Antibody;Neutralizing antibody

基金項目 山東省重點研發(fā)計劃項目“鄉(xiāng)村振興科技創(chuàng)新提振行動計劃”（2022TZXD0041）；秦皇島市珍稀藥用真菌應(yīng)用創(chuàng)新平臺項目（202201B051）；山東省重點研發(fā)計劃項目（競爭性創(chuàng)新平臺）（2022CXPT005-02，2022CXPT010）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2023A21）。

作者簡介 楊碩（1992—），男，湖北潛江人，碩士研究生，研究方向：禽類疫病防控技術(shù)。

通信作者，教授，從事動物疫病防控技術(shù)研究。

收稿日期 2023-09-25

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是嚴(yán)重危害我國禽類養(yǎng)殖業(yè)的病毒之一，每年造成大量禽類死亡，經(jīng)濟損失巨大。由于病毒的變異和重組，禽流感病毒從禽類溢出而具備感染人類能力的事件偶有發(fā)生，對公共安全造成了極大危害［1-2］。鑒于此，我國起初采用疫苗免疫和物理撲殺相結(jié)合的措施來應(yīng)對高致病性禽流感的傳播。隨著病毒學(xué)和疫苗制備技術(shù)的進步，防疫工作又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾滦鸵呙缑庖吣Ｊ剑?-4］，該模式在實際應(yīng)用中取得成功且獲得了國際社會的認(rèn)可。鴨坦布蘇病毒病是自2010年以來嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的病毒性傳染病，主要引起蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降、肉鴨和育成鴨死亡，近年來它已成為水禽養(yǎng)殖業(yè)常見且頻繁流行的疫病之一［5-7］。隨著疫苗的成功研制和大規(guī)模應(yīng)用，鴨坦布蘇病毒的傳播逐漸由大規(guī)模暴發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫蚤g歇流行，加上流行病學(xué)監(jiān)測，其造成的經(jīng)濟損失逐年減少。因此，在禽流感和鴨坦布蘇病毒病的防控措施中，疫苗免疫起到了至關(guān)重要的作用。在實際生產(chǎn)中，經(jīng)常會出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象，其原因之一是免疫“空窗期”（免疫后至疫苗起效的時間段）的存在?！翱沾捌凇痹介L，感染的可能性就越高，加上免疫本身會對禽類產(chǎn)生一定程度的應(yīng)激，所以“空窗期”是病毒感染的高峰期。因此，促進疫苗特異性抗體的提前分泌、縮短起效的窗口期十分必要。

佐劑是提高疫苗免疫效果的有效工具，而綠色口服佐劑是集安全、高效、經(jīng)濟于一身的一種佐劑。研究表明，藥用真菌樺褐孔菌制劑具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、抗病毒、抗細菌、抗寄生蟲等多種功效［8-10］，將其應(yīng)用于禽類養(yǎng)殖能夠顯著提升機體的生產(chǎn)性能和免疫性能，它是一種效果優(yōu)良的飼料添加劑和免疫增強劑［11-12］。當(dāng)其以口服佐劑的形式配合新城疫（newcastle disease，ND）滅活疫苗使用時，可以顯著提升新城疫病毒特異性抗體、中和抗體的水平，有效改善機體的攻毒保護率，是一種經(jīng)濟、方便的佐劑［13］。迄今為止，樺褐孔菌作為口服佐劑改善疫苗免疫效果的研究僅此一項，尚不確定它是不是家禽/水禽常用疫苗普遍適用的佐劑。筆者選擇商品化的禽流感滅活疫苗和鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗，分別免疫SPF雞和SPF鴨，以口服形式飼喂樺褐孔菌制劑，對免疫后雞和鴨的抗體水平進行檢測，旨在明確IOFP對2種疫苗免疫效果的改善作用，為禽類廣泛適用的佐劑產(chǎn)品開發(fā)提供候選材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物、細胞、病毒。

9日齡SPF雞胚和鴨胚、7日齡SPF雞和鴨均購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司；非洲綠猴腎（Vero）細胞由筆者所在實驗室保存；鴨坦布蘇病毒DTMUV（TCID50為10-5.79/mL）由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑。

禽流感滅活疫苗（150252152）、鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗（2006012-2）為齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品；樺褐孔菌制劑由秦皇島高通生物科技有限公司制備，制備方法參照文獻［13］；鴨坦布蘇病毒ELISA抗體檢測試劑盒為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所研制產(chǎn)品 。

1.2 動物試驗

1.2.1 試驗1。

1.2.1.1 試驗分組。

SPF雞20只，隨機分為2組（試驗組與對照組），每組10只，分別飼養(yǎng)在隔離器中。7日齡，免疫禽流感滅活疫苗，劑量與免疫途徑參照疫苗說明書。對照組飼喂商品化日糧，試驗組則在商品化日糧的基礎(chǔ)上添加0.8%的IOFP（m/m），試驗期自由采食和飲水。

1.2.1.2 試驗方法。

分別于免疫后0、4、7、14、21、28、35和42 d采集外周血，進行抗體及中和和抗體的檢測。采集的外周血3 000 r/min離心10 min后分離血清，進行AIV特異性血凝抑制（HI）抗體滴度和中和抗體滴度的檢測，操作方法參考文獻［14］。

1.2.2 試驗2。

1.2.2.1 試驗分組。

SPF鴨20只，隨機分為2組（試驗組與對照組），每組10只，分別飼養(yǎng)在隔離器中。14日齡，進行鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗的免疫，14 d后加強免疫1次，劑量與免疫途徑參照疫苗說明書。對照組飼喂商品化日糧，試驗組則在商品化日糧的基礎(chǔ)上添加0.8%的IOFP，試驗期自由采食和飲水。

1.2.2.2 試驗方法。

分別于首免后0、4、7、14、21和28 d采集外周血，分離血清后進行抗體滴度及中和抗體滴度的檢測?？贵w滴度的測定按照ELISA抗體檢測試劑盒說明書進行，中和抗體滴度的測定采用固定病毒稀釋血清的方法。將病毒稀釋為200 TCID50，與系列倍比稀釋的血清混勻，置于5% CO2培養(yǎng)箱（37 ℃）中孵育2 h；取等量的混合液接種于單層Vero細胞上，每個稀釋度4個重復(fù)；在37 ℃、5% CO2的條件下作用2 h后，吸棄混合液并加入維持液；在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每天觀察細胞病變數(shù)，按照Reed-Muench法計算血清中和抗體的效價。2組鴨子在加強免疫后14 d，使用DTMUV強毒株攻毒，攻毒方式為滴鼻點眼，攻毒劑量為10-5.79/mL；攻毒后每隔1 d采集2組鴨子的肛拭子，使用熒光定量方法進行排毒量的檢測，檢測方法與李海燕等［15］的方法相一致。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 8.0 軟件中 student’s t-test 進行分析，并進行差異顯著性檢驗（P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 IOFP對AIV抗體滴度的影響

對不同時間點的AIV HI特異性抗體滴度進行測定，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，試驗組和對照組雞的HI抗體滴度變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)為4 d檢測到抗體的產(chǎn)生，28 d達到峰值，此后緩慢下降。試驗組每個時間點的抗體滴度與對照組相比均提高1～2個滴度左右且差異顯著（P<0.05），免疫早期（4和7 d）2組間差異極顯著（P<0.01）。

2.2 IOFP對AIV中和抗體滴度的影響

對不同時間點AIV的中和抗體滴度進行測定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，IOFP對中和抗體效價的提升比HI抗體更為明顯。除了21、35 d中和抗體滴度顯著高于對照組外（P＜0.05），其余時間點2組間差異均極顯著（P＜0.01）；從中和抗體出現(xiàn)時間來看，試驗組4 d即可檢測到抗體效價，而對照組7 d才能檢測到。

2.3 IOFP對DTMUV抗體滴度的影響

對不同時間點DTMUV特異性抗體滴度進行測定，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，在2次免疫的情況下，2組鴨坦布蘇病毒抗體滴度隨著時間的變化而逐漸升高，28 d時達到峰值。與對照組相比，試驗組在口服IOFP后每個時間點均有1～2個抗體滴度的提升（P＜0.05），同時試驗組抗體出現(xiàn)時間上也比對照組提前3 d左右。

2.4 IOFP對DTMUV中和抗體滴度的影響

對不同時間點鴨DTMUV的中和抗體滴度進行了檢測，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，IOFP佐劑不僅能夠提升中和抗體的滴度，而且能夠促進中和抗體的提前分泌。在每個時間點，試驗組的中和抗體滴度均高于對照組，且差異極顯著（P＜0.01）；對照組在7 d左右檢測到中和抗體的存在，而試驗組4 d即可檢測到，且其中和抗體滴度與對照組7 d時的中和抗體滴度相近。

2.5 IOFP對DTMUV排毒量的影響

如圖5所示，2組鴨在攻毒后2 d即可在泄殖腔中檢測到病毒的存在，4 d時排毒量達到峰值，此后緩慢下降。對照組在攻毒后的持續(xù)排毒期為22 d，而試驗組為18 d；在排毒量方面，對照組在每個時間點的排毒量均高于試驗組。

3 討論與結(jié)論

樺褐孔菌具有較強的免疫增強和免疫調(diào)節(jié)作用，自16世紀(jì)以來就被人類用于多種疾病的治療［16-17］。隨著研究的不斷深入，樺褐孔菌的增強免疫作用在多種動物中得到體現(xiàn)。樺褐孔菌多糖通過促進小鼠胸腺的發(fā)育而提升T淋巴細胞的含量［18］。樺褐孔菌胞內(nèi)多糖能夠強烈刺激BDF1小鼠脾臟B淋巴細胞的增殖和分化，促進IgM的產(chǎn)生，二者均能夠增強小鼠的免疫力［16］。樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物以口服形式用于禽類生產(chǎn)，可以顯著促進脾臟、胸腺和法氏囊的發(fā)育，提升T淋巴細胞的含量和相關(guān)細胞因子的表達，提升特異性抗體水平，從而改善機體的攻毒保護率［19］；以口服形式將樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物飼喂肉兔，胸腺器官指數(shù)、T淋巴細胞的含量、相關(guān)細胞因子的表達和特異性抗體水平均得到不同程度的改善［20］。以上結(jié)果表明，樺褐孔菌是動物普遍適用的一種免疫增強劑。在筆者所在課題組的前期研究中，IOFP配合新城疫病毒（NDV）疫苗使用可以顯著提升疫苗的特異性HI抗體和中和抗體水平，并促進了中和抗體的提前產(chǎn)生，但IOFP配合其他（形式）的疫苗是否能達到同樣的效果還需要進一步驗證。

抗體效價是臨床上判斷疫苗能否保護野毒感染的直觀指標(biāo)，也是評價疫苗免疫效果的主要標(biāo)準(zhǔn)［21］。該研究從體液免疫入手，以雞和鴨為研究對象，分析了口服IOFP對禽流感滅活疫苗和鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗體液免疫的增強效果。結(jié)果表明，IOFP能夠顯著提升SPF雞和鴨的抗體水平、縮短中和抗體的產(chǎn)生時間、提高病毒的清除速率。IOFP配合禽流感疫苗使用時，試驗組所有時間點的HI抗體和中和抗體滴度均顯著或極顯著高于對照組，特別是免疫后4～7 d時的HI抗體和4～14 d的中和抗體滴度，2組間差異極顯著（P＜0.01）。早期抗體滴度的快速提升能夠有效縮短免疫后的空窗期，盡早對動物提供有效保護對于禽類養(yǎng)殖業(yè)的高效生產(chǎn)具有重要意義。這不僅體現(xiàn)在雞免疫的禽流感滅活疫苗中，而且在鴨免疫的鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗中也得到了體現(xiàn)。在免疫后4 d的抗體效價測定中，對照組尚未產(chǎn)生抗體，而試驗組已經(jīng)檢測到抗體，在此時間點同樣也檢測到中和抗體的產(chǎn)生，試驗組中和抗體滴度與對照組7 d時的中和抗體滴度相當(dāng)。該研究2個試驗結(jié)果與IOFP增強NDV滅活疫苗免疫效果的研究結(jié)果相一致。此外，該研究使用鴨坦布蘇病毒弱毒活疫苗。相較于滅活疫苗，活疫苗不僅能夠激發(fā)機體的體液免疫，而且能夠誘導(dǎo)細胞免疫的產(chǎn)生，所以進行了鴨坦布蘇病毒攻毒后的排毒量檢測，以確定疫苗對病毒的殺滅作用。以上結(jié)果證實，無論是病毒含量還是排毒時間，IOFP均起到了積極的作用，這也是增強機體細胞免疫反應(yīng)強度的體現(xiàn)。

綜上所述，無論是雞還是鴨，亦或滅活苗還是弱毒苗，IOFP均能夠起到增強免疫效果、縮短免疫空窗期的作用，是禽類及不同形式疫苗普遍適用的口服佐劑。該研究僅選擇實踐中廣泛應(yīng)用的疫苗為代表進行了驗證，并未使用所有形式的疫苗，后續(xù)研究將進行逐一驗證。

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