摘要：【目的】通過對叉角厲蝽[Eocanthecona fiurcellata（Wolf）]毒液絲氨酸蛋白酶（Serine protease，SP）基因E/SP2的克隆、序列分析、表達(dá)譜分析及RNA干擾（RNA interference，RNAi），解析EfSP2蛋白的功能，為ESP2基因的分子特征研究及功能注釋提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繌牟娼菂栻硗僖合俎D(zhuǎn)錄組中獲得E/SP2基因序列，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增E/SP2基因完整開放閱讀框（Open reading frame，ORF）序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析EJSP2基因在叉角厲蝽不同發(fā)育階段（卵、1～5齡若蟲和雌雄成蟲）唾液腺及雌成蟲不同組織（馬氏管、唾液腺、脂肪體、卵巢、中腸、頭）中的表達(dá)情況；通過RNAi技術(shù)檢測其對叉角厲蝽雌雄成蟲存活及捕食的影響?！窘Y(jié)果】克隆獲得EfSP2基因ORF序列長861 bp，編碼286個(gè)氨基酸；EfSP2氨基酸序列中具有1個(gè)完整的Tryp-SPc結(jié)構(gòu)域，含有胰蛋白酶N末端保守的起始氨基酸序列（IVGG）;含有保守的SP三聯(lián)體催化活性中心，屬于絲氨酸蛋白酶家族的類胰蛋白酶亞家族；與稻綠蝽（Nezara viridula）SP同源性最高，氨基酸序列一致性為44.69%。EJSP2基因在叉角厲蝽雌雄成蟲和唾液腺中有極高的表達(dá)量。注射dsEISP2能顯著抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)（Plt;0.05，下同），且顯著降低叉角厲蝽雌雄成蟲的存活率和捕食量?！窘Y(jié)論】成功克隆了叉角厲蝽毒液絲氨酸蛋白酶E/SP2基因。時(shí)空表達(dá)譜及RNAi結(jié)果表明，EfSP2可能是叉角厲蝽生長發(fā)育、捕食和消化過程中的重要蛋白之一。

關(guān)鍵詞：叉角厲蝽；唾液腺；絲氨酸蛋白酶；基因克?。槐磉_(dá)模式；RNA干擾

中圖分類號：S476.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）02-0489-10

Cloning，expression and predation function analysis of serine protease EfSP2 gene from Eocanthecona furcellata （Wolff）venom

ZHANG Man1，LIU Bing-shun2，CHEN Xiao'，YUE Mao-ting'，ZHU Guo-yuan'，

TIAN Yong-ming'，NING Jing-yi'，QIN De-qiang'，WU Guo-xing'，GAO Xi1（'College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China;2Lufeng Agricultural Technology ExtensionCenter，Chuxiong，Yunnan 651200，China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to analyze the function of EfSP2 protein by cloning，sequence analysis，expression profile analysis and RNA interference（RNAi）of serine protease（SP）gene ESP2 from the venom of Eocanthecona fiurcellata（Wolff），and to provide ascientific basis for the molecular characterization and functional an-notation of the E/SP2 gene.【Method】The E/SP2 gene sequence was obtained from the salivary gland transcriptome of Efiuncellata.The complete open reading frame（ORF）sequence of the E/SP2 gene was amplified by PCR technology and analyzed by bioinformatics.Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression of E/SP2 gene in different developmental stages（eggs，1*-5 instar nymphs，male and female adults）salivary gland and different tissues（malpighian tube，salivary gland，fat body，ovary，gut，head）of female adults.At the same time，RNAi technology was used to detect its effects on the survival and predation of maleand female E.furcellata adults.【Result】The ORF sequence of E/SP2 gene obtained from cloning was 861 bp，encoding 286 amino acids.The amino acid sequence of EfSP2 con-tained acomplete Tryp-SPc domain and aconserved initial amino acid sequence（IVGG）at theN-terminus of trypsin.It contained aconserved SP triplet catalyticactivity center and belonged to the tryptase subfamily of the serine protease fami-ly.It had the highest homology with Nezara viridula SP，with an amino acid sequence identity of44.69%.The E/SP2 gene was highly expressed in male and female adults and salivary glands of E.furcellata.The injection of dsESP2 signifi-cantly inhibited the expression of target genes（Plt;0.05，the same below），and significantly reduced the survival rate and predation of male and female E.furcellata adults.【Conclusion】The Efucellata venom serine protease EfSP2 gene is suc-cessfully cloned.The spatiotemporal expression profile and RNAi results show that EfSP2 islikely to be one of the impor-tant proteins in the processesof growth，development，predation and digestionof E.furcellata

Key words：Eocantheconafiurcellata（Wolff）;salivary gland;serine protease;gene cloning;expression pattern;RNA interference

Foundation items：Yunnan Agricultural Basic Research Joint Special Project（202301BD070001-137，202101BD 070001-050）;Yunnan Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders Reserve Talents Project（202205AC 160077）;Yunnan Tobacco Company Science and Technology Plan Project（2023530000241012）

0引言

【研究意義】叉角厲蝽[Eocanthecona furcellata （Wolff）]隸屬于半翅目（Hemiptera）蝽科（Pentatomi-dae）益蝽亞科（Asopinae），是一種具有良好捕食能力的天敵昆蟲，對多種重要的農(nóng)業(yè)害蟲具有較好的防控效果（Wen et al.，2017;張曼等，2022），尤其對鱗翅目害蟲有較強(qiáng)的控害能力（趙航等，2022），在生物防治方面極具應(yīng)用潛力。捕食性節(jié)肢動(dòng)物的唾液已被確定為毒素、過敏原及抗止血化合物的來源，包括些消化酶、蛋白質(zhì)和肽類等。具有刺吸式口器的捕食性昆蟲常依靠毒液毒素來捕食或麻痹獵物（Beak and Lee，2014）。有關(guān)捕食性昆蟲毒液蛋白組分鑒定的研究報(bào)道了絲氨酸蛋白酶（Serine protease，SP）是捕食性昆蟲毒液中普遍存在的蛋白組分（Beak and Lee，2014;Walkeret al.，2017，2018，2019;Rügen et al.，2021），在其捕食過程中伴隨毒液的分泌通過口針釋放到獵物體內(nèi)，對自身的生長發(fā)育及獵物的捕食消化起重要作用。因此，深入研究捕食性昆蟲叉角厲蝽唾液蛋白的生理功能不僅有利于揭示捕食者的捕食機(jī)制，同時(shí)也可為殺蟲活性物質(zhì)的開發(fā)提供新途徑，對害蟲綠色防控具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】捕食性蝽類具備靈活的刺吸式口器并伴隨足和觸角的配合與強(qiáng)大的消化酶系統(tǒng)，使得其可以有效捕食與自身體型接近或超過自身的獵物，以適應(yīng)競爭激烈的捕食性生境（Cohen，1990）。飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，叉角厲蝽捕食行為與躅蝽（Arma chi-nensis）和黃帶犀獵蝽（Betta macostoma）等捕食性蝽類的捕食行為類似（王燕等，2019;王亞楠等，2020），當(dāng)搜尋到獵物后便會(huì)迅速發(fā)起進(jìn)攻，直接將口針刺入獵物體內(nèi)，同時(shí)分泌大量毒液釋放到獵物體內(nèi)導(dǎo)致獵物快速麻痹和死亡（Lemos et al.，2005;Azevedoet al.，2007），這種毒性主要由神經(jīng)毒素和消化酶所導(dǎo)致（Walker et al.，2016）。昆蟲中的絲氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶超家族，參與調(diào)控很多蛋白質(zhì)水解級聯(lián)反應(yīng)，是大多數(shù)昆蟲消化系統(tǒng)內(nèi)重要的消化酶（劉巧英等，2016），同時(shí)在昆蟲的免疫反應(yīng)中也扮演著重要角色（初源，2017;唐琦等，2017）。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域的不同，絲氨酸蛋白酶可分為單結(jié)構(gòu)域和多結(jié)構(gòu)域蛋白，其中單結(jié)構(gòu)域蛋白主要發(fā)揮蛋白消化功能，多結(jié)構(gòu)域蛋白多作用于各種生物過程中的分子識別（Ross et al.，2003;Veillard et al.，2016）。絲氨酸蛋白酶含有保守的S、H和D殘基組成的催化三聯(lián)體（Perona and Craik，1995;Pola-nowski and Wilusz，1996），在昆蟲胚胎發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、消化代謝和免疫防御反應(yīng)中起重要作用（唐琦等，2017）。近年來，已有眾多學(xué)者從許多昆蟲中克隆得到多種絲氨酸蛋白酶基因，如煙草天蛾（Manduca sexta）卵中的多種絲氨酸蛋白酶參與黑化反應(yīng)和抗菌肽合成，構(gòu)成了煙草天蛾卵的先天性免疫系統(tǒng)（Gorman et al.，2004）;豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）絲氨酸蛋白酶ACYPI4531參與了豌豆蚜對細(xì)菌及真菌的免疫防御反應(yīng)和酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)（王雯，2019）;茶尺蠖（Ectropis obliqua）絲氨酸蛋白酶基因EoSP1被成功克隆并說明該基因可響應(yīng)茶尺蠖的饑餓反應(yīng)（張新等，2019）;褐飛虱（Nilaparvata lugens）clip型的絲氨酸蛋白酶基因被成功克隆并證實(shí)其在褐飛虱的生長發(fā)育和免疫防御過程中發(fā)揮調(diào)控作用（鄔偉等，2022）。天敵昆蟲相關(guān)報(bào)道則相對較少，如寮黑瘤姬蜂（Coccygomimus laothoe）毒液中的絲氨酸蛋白酶能抑制寄主血淋巴黑化（Danneels et al.，2010）;麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）毒液中的絲氨酸蛋白酶可誘導(dǎo)寄主草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的Sf21細(xì)胞凋亡（Formesyn et al.，2013）;管氏腫腿蜂（Sclerodermus guani）中的一個(gè)毒液絲氨酸蛋白酶基因被克隆并證實(shí)對寄主黃粉蟲（Tenebrio molitor）蛹的體液免疫和細(xì)胞免疫具有調(diào)控作用（李麗芳，2016）。然而，有關(guān)捕食性昆蟲中的絲氨酸蛋白酶相關(guān)功能還有待揭示?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)叉角厲蝽絲氨酸蛋白酶基因E/SP2的轉(zhuǎn)錄水平較高（高平等，2021），推測其可能在叉角厲蝽的捕食過程中發(fā)揮作用，但有關(guān)E/SP2基因的相關(guān)研究迄今尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于叉角厲蝽唾液腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過PCR技術(shù)克隆E/SP2基因，并對其生物信息學(xué)和發(fā)育階段及組織表達(dá)模式進(jìn)行分析，通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)抑制該基因表達(dá)后檢測其對叉角厲蝽存活及捕食的影響，以期為E/SP2基因的分子特征研究及功能注釋提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試?yán)ハx叉角厲蝽于2018年采集自云南省玉溪市元江縣濱江大道小燕村，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)于（27±1）℃、相對濕度60%～80%、光周期14L：10D的環(huán)境下用黃粉蟲蛹飼養(yǎng)多代。

1.1.2主要試劑TRIzol試劑、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Tag TMIⅡ（Tli RnaseH Plus）、E.coli DH5α Compe-tent Cells、pMD\"19-T Vector Cloning Kit、in vitro Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis）均購自寶生物工程（大連）有限公司；1.1×金牌Mix Ver.Trelief DNA Gel Extraction Kit、GoldenStar°T6 Super PCR Mix（1.1×）、IPTG、X-Gal、Amp*購自北京擎科生物科技有限公司，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2叉角厲蝽唾液腺RNA提取和cDNA合成取叉角厲蝽成蟲（雄性：雌性=1：1）置于培養(yǎng)皿中，加入磷酸鹽緩沖液（PBS），使用解剖鑷和解剖針在日產(chǎn)Olympus雙目立體解剖鏡下解剖獲得叉角厲蝽唾液腺，將其移至盛有200μL TRIzol試劑的1.5 mLRNase-free離心管中，每重復(fù)20個(gè)唾液腺（雄性：雌性=1：1），共3個(gè)重復(fù)。唾液腺充分研磨成勻漿后加入TRIzol至1mL用于RNA提取。提取的總RNA用Nano Drop 2000微量紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度，質(zhì)量合格后進(jìn)行下一步反應(yīng)。去除基因組DNA反應(yīng)體系10μL：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，總RNA根據(jù)檢測濃度定量至100ng～1μg，加無酶無菌水至10μL;反應(yīng)條件：42℃2 min，4℃保存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μL：上述反應(yīng)液10μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1μL，RT Primer Mix 1μL，5×PrimeScriot Buffer 4μL，無酶無菌水4μL;反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EfSP2基因克隆

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期從叉角厲蝽唾液腺轉(zhuǎn)錄組中獲得具有完整開放閱讀框（Open reading frame，ORF）的ESP2基因序列（高平等，2021），利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)克隆引物；利用NCBI Primer-BLAST（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC=BlastHome）設(shè)計(jì)基因定量引物（表1）;以唾液腺cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50μL：cDNA模板1μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，1.1×金牌Mix Ver.45μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2 min;98℃10s，58℃10s，72℃20 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段通過凝膠回收試劑盒Trelief DNA Gel Extraction Kit回收，回收產(chǎn)物連接至pMD19-T Vector克隆載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)箱菌液復(fù)蘇后均勻涂抹在含有IPTG、X-Gal和Amp'的LB固體培養(yǎng)基上，再經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑選20個(gè)陽性克隆的單菌落在含有Amp*的LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，菌液PCR驗(yàn)證后，將陽性菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.4 EfSP2基因的生物信息學(xué)分析

完成測序后，用DNAstar中的SeqMan拼接序列并用BiOXM與原序列比對，以確定序列的正確性，用BLAST（https：/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和DNAMAN進(jìn)行氨基酸多序列比對，利用在線網(wǎng)站SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預(yù)測信號肽、使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)、分子量和親疏水性、NCBI（https：/www.ncbi.nlm nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和保守位點(diǎn)、Cell-PLoc-2（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，TMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)，運(yùn)用MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用Bootstrap法進(jìn)行1000次循環(huán)檢驗(yàn)。

1.5 EfSP2基因時(shí)空表達(dá)特征分析

分別收集叉角厲蝽不同發(fā)育階段樣本：卵50粒、1～3齡若蟲唾液腺各40個(gè)、5齡若蟲唾液腺及雌雄成蟲唾液腺各20個(gè)；不同組織樣本：來自10頭3日齡雌成蟲的唾液腺、頭、脂肪體、卵巢、中腸和馬氏管。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。將解剖獲得的各樣本置于TRIzol試劑中，RNA提取和cDNA合成方法同1.2。使用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測EfSP2基因在叉角厲蝽不同發(fā)育階段和雌成蟲不同組織中的表達(dá)特征。反應(yīng)體系10.0μL：TB GreenPremix Ex TaqTM IⅡ5.0μL，cDNA模板1.0μL，上、下游引物（表1）各0.4μL，無酶無菌水3.2μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30s;95℃5s，60℃30s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。內(nèi)參基因選擇E/RPL9，引物序列見表1。采用2-AAQ法分析基因相對表達(dá)量。

1.6 RNA干擾EfSP2基因后對叉角厲蝽存活及捕食的影響

為進(jìn)一步研究EISP2基因在叉角厲蝽中的功能，對EfSP2基因進(jìn)行RNAi試驗(yàn)?；贓fSP2和GFP基因的cDNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)含T7啟動(dòng)子的特異性引物（表1），以克隆測序驗(yàn)證正確的EfSP2質(zhì)粒和GFP質(zhì)粒（購自北京擎科生物有限公司）為模板，使用GoldenStar T6 Super PCR Mix（1.1×）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段通過凝膠回收試劑盒Trelief DNA Gel Extraction Kit對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化的DNA模板使用in vitro Transcription T7 Kit合成dsEfSP2和dsGFP，使用1%瓊脂糖凝膠電泳評估dsRNA的完整性，并使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測量濃度，用無酶無菌水將dsRNA稀釋至1000 ng/μL后置于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

選擇3日齡叉角厲蝽雌雄成蟲進(jìn)行RNAi試驗(yàn)，使用1μL的微量進(jìn)樣器在叉角厲蝽后胸與腹部節(jié)間膜最外側(cè)部位緩慢注射1μL濃度為1000 ng/μL的dsRNA。注射后將叉角厲蝽轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為（27±1）℃，相對濕度60%～80%，光周期14L：10D。以注射dsEISP2的叉角厲蝽為試驗(yàn)組，注射dsGFP的叉角厲蝽為對照組，注射時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭叉角厲蝽試蟲，5頭黃粉蟲蛹供其取食，浸潤的脫脂棉球提供水分。分別在注射后1、2、4和6 d解剖存活的叉角厲蝽收集唾液腺。解剖時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)唾液腺用于檢測叉角厲蝽唾液腺中ESP2基因的RNAi效果。

將5頭黃粉蟲蛹稱重并記錄，放置在培養(yǎng)皿中以供注射dsRNA的叉角厲蝽捕食，24 h后再次稱重5頭黃粉蟲蛹并放入培養(yǎng)皿中，記錄叉角厲蝽死亡數(shù)并計(jì)算叉角厲蝽每頭每日捕食量，爾后再稱重新鮮黃粉蟲蛹后放入培養(yǎng)皿，共記錄觀察6 d，分析dsRNA對叉角厲蝽雌雄成蟲的致死效果及對捕食量的影響，每處理10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭叉角厲蝽試蟲。共進(jìn)行3次注射試驗(yàn)，即每個(gè)時(shí)間每組共30個(gè)重復(fù)，至少15個(gè)重復(fù)的數(shù)據(jù)用于分析叉角厲蝽存活及捕食量。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行處理，利用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理之間基因表達(dá)的差異采用單因素方差分析，利用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較分析，RNAi效率及捕食量檢測采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法，顯著性水平均為Plt;0.05。采用GraphPad Prism 8.0.2制圖。

2結(jié)果與分析

2.1 EfSP2基因序列特征

從叉角厲蝽唾液腺克隆獲得EfSP2的ORF序列，其編碼區(qū)長861 bp，編碼286個(gè)氨基酸，預(yù)測為親水蛋白，理論分子量為31.42 kD，理論等電點(diǎn)為8.87。EfSP2氨基酸的N端有30個(gè)氨基酸殘基的信號肽序列，有跨膜結(jié)構(gòu)域，定位在細(xì)胞外。

EfSP2氨基酸序列有1個(gè)完整的Tryp-SPc結(jié)構(gòu)域，含有胰蛋白酶N末端保守的起始氨基酸序列（IVGG），第44位的異亮氨酸殘基I為剪切位點(diǎn)；第217位的天冬氨酸殘基D，第244位的絲氨酸殘基S和第246位的甘氨酸殘基G是底物結(jié)合位點(diǎn)；與其他半翅目昆蟲一樣具有SP保守的三聯(lián)體催化活性中心，組氨酸殘基H、天冬氨酸殘基D和絲氨酸殘基S分別位于第42、90和186位（圖1）。與其他半翅目昆蟲構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，叉角厲蝽EfSP2與稻綠蝽（Nezara viridula）SP同源性最高，氨基酸序列一致性為44.69%（圖2）。

2.2 EfSP2基因的時(shí)空表達(dá)特征

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對EfSP2基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析，結(jié)果顯示，ESP2基因在叉角厲蝽各發(fā)育階段均有表達(dá)，其中4～5齡若蟲、雄成蟲、雌成蟲的表達(dá)量均顯著高于其他發(fā)育階段（Plt;0.05，下同），雌成蟲的表達(dá)量最高，1齡若蟲中幾乎不表達(dá)（圖3-A）。在雌成蟲不同組織中，EfSP2基因在唾液腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織，其次是中腸，在脂肪體和卵巢中的表達(dá)量最低（圖3-B）。

2.3 EfSP2基因的RNAi效應(yīng)

檢測結(jié)果（圖4）顯示，雌雄成蟲注射dsEfSP2后不同時(shí)間，與注射dsGFP相比，注射dsEISP2后EfSP2基因的表達(dá)量均顯著降低。其中，雌成蟲注射后2～6 d表達(dá)量分別顯著降低99.22%、99.89%和99.84%;雄成蟲注射后1～6 d表達(dá)量分別顯著降低95.16%、82.08%、99.96%和98.92%。總體來看，雌雄成蟲目的基因干擾效率變化趨勢一致，且在注射4和6 d后干擾效率最高。

2.4 RNAi后對叉角厲蝽存活率和捕食量的影響

對RNAi后叉角厲蝽的存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖5-A和圖5-B）顯示，與對照相比，注射dsE/SP2基因后，叉角厲蝽雌雄成蟲的存活率均顯著下降，注射后第2 d存活率下降最快。注射dsGFP后叉角厲蝽雌成蟲的平均生存時(shí)間為4.12±0.54 d，第4d的存活率為57.10%，注射dsEfSP2基因后叉角厲蝽雌成蟲的平均生存時(shí)間為3.09±0.26 d，顯著低于對照（x2=4.559，Plt;0.05），第3 d的存活率為40.00%。注射dsGFP基因后叉角厲蝽雄成蟲的平均生存時(shí)間為4.53±0.55 d，第4d的存活率為84.60%，注射dsEfSP2基因后叉角厲蝽雄成蟲的平均生存時(shí)間為2.75±0.27 d，顯著低于對照（x2=9.212，Plt;0.05），第2 d的存活率為37.50%。

RNAi叉角厲蝽E/SP2基因表達(dá)后檢測捕食量的變化，結(jié)果（圖6-A和圖6-B）顯示，與注射dsGFP相比，注射dsEJSP2基因后，叉角厲蝽雌雄成蟲的捕食量均顯著低于對照，且一直保持較低水平。雌雄成蟲均在注射5 d后捕食量最低，每頭雌雄成蟲的平均捕食量分別為1.27和1.28 mg。

3討論

本研究通過叉角厲蝽唾液腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和PCR技術(shù)克隆驗(yàn)證獲得具有完整ORF的E/SP2基因序列。序列分析表明，該基因編碼的氨基酸序列中存在信號肽序列，預(yù)示著其是分泌蛋白（Moreau and Asgari，2015）。氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)EfSP2與其他半翅目昆蟲的SPs氨基酸序列一樣具有保守的三聯(lián)體催化活性中心（組氨酸殘基H、天冬氨酸殘基D、絲氨酸殘基S），說明ESP2基因?yàn)镾P的成員。另外，EfSP2基因編碼的氨基酸序列中有1個(gè)完整的Tryp-SPc結(jié)構(gòu)域，在蛋白序列N端還含有保守氨基酸殘基IVGG，屬于絲氨酸蛋白酶家族中的類胰蛋白酶亞族。

昆蟲中絲氨酸蛋白酶家族基因的表達(dá)譜呈現(xiàn)多樣性，E/SP2基因在不同發(fā)育階段和成蟲不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異。從不同發(fā)育階段看，ESP2在4～5齡若蟲和雌雄成蟲中表達(dá)量最高，在卵、1～3齡若蟲中表達(dá)量低，且在卵和1齡若蟲中最低，可能與叉角厲蝽的捕食行為相關(guān)。據(jù)報(bào)道，叉角厲蝽捕食行為主要發(fā)生在若蟲和成蟲階段，其中1齡若蟲不捕食，僅靠吸食植物汁液即可完成發(fā)育，進(jìn)入2齡后開始捕食，而且也有刺吸植物汁液的現(xiàn)象，隨齡期的增長其植食性逐漸減弱，捕食性逐漸增強(qiáng)（姚明勇等，2019;張曼等，2022）。從成蟲不同組織看，EfSP2在唾液腺中有極高的表達(dá)量，中腸次之，在脂肪體和卵巢中的表達(dá)量最低。唾液腺是昆蟲產(chǎn)生唾液大分子物質(zhì)尤其是唾液蛋白的重要消化器官（李飛等，2021），含有的蛋白質(zhì)種類十分豐富，既有組織蛋白，也有分泌蛋白（馬琳，2015;戚良軒等，2023）。捕食性蝽將唾液腺分泌的毒液通過口針注射到獵物體內(nèi)迅速麻痹或殺死獵物，并利用其分泌的毒液蛋白對獵物中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行體外消化后再由口針吸回，腸內(nèi)消化（朱艷娟，2021;蘇定義等，2023）。此外，中腸是昆蟲攝取營養(yǎng)物質(zhì)后的主要消化場所，因此結(jié)合前文所述，克隆得到的EfSP2蛋白屬于分泌型毒液蛋白，且在叉角厲蝽若蟲期2～5齡、雌雄成蟲及在唾液腺和中腸中有較高的表達(dá)量，因此推測ESP2在叉角厲蝽的捕食和消化過程中至關(guān)重要。

近年來，已在眾多昆蟲中利用RNAi技術(shù)進(jìn)行相關(guān)基因的功能解析，但不同種類的昆蟲和不同的dsRNA遞送方式對RNAi的敏感性差異很大（Belles，2010;Joga et al.，2016;許靜靜等，2022）。與喂食法和浸泡法相比，顯微注射法可在一定程度上避免昆蟲腸道上皮細(xì)胞、外部表皮等將一定量的dsRNA直接轉(zhuǎn)運(yùn)至靶標(biāo)組織或血淋巴中，以達(dá)到高效率的RNAi效果（朱邦勤，2019）。本研究通過顯微注射法將dsEfSP2注射入叉角厲蝽雌雄成蟲體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在注射dsEfSP2后1～6 d內(nèi)雌雄成蟲的干擾效率均較高，其中雌雄成蟲被干擾后EISP2基因顯著下調(diào)60.00%和80.00%以上，說明叉角厲蝽對RNAi顯微注射法的敏感性好。在半翅目昆蟲中，中黑盲蝽和褐飛虱對RNAi顯微注射法也有較高的敏感性。通過顯微注射法分別干擾中黑盲蝽中胰蛋白酶前體基因AsTryP和褐飛虱中絲氨酸蛋白酶基因NISCP4的表達(dá)后，與對照相比，目的基因表達(dá)水平分別顯著下調(diào)65%以上和59%以上（朱邦勤，2019;鄔偉等，2022）。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干擾ESP2基因表達(dá)后，叉角厲蝽雌雄成蟲的存活率均顯著下降，這一現(xiàn)象在豌豆蚜中也有發(fā)現(xiàn)，注射了dsSP后，豌豆蚜的存活率在8d內(nèi)顯著下降且更易感染病原菌（王雯，2019），證實(shí)ESP2基因參與了叉角厲蝽的生長發(fā)育過程。另一方面，EfSP2屬于類胰蛋白酶亞族成員，類胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶在昆蟲中參與多種生理生化過程，包括食物蛋白消化、激素活化、凝血、黑色素合成及抗微生物等免疫反應(yīng)（葛釗宇等，2016;趙愛平，2017）。故而EJSP2基因可能也參與調(diào)節(jié)免疫生理。本研究檢測了干擾E/SP2表達(dá)后叉角厲蝽的捕食量，發(fā)現(xiàn)1～6d內(nèi)雌雄成蟲的捕食量均顯著下降。絲氨酸蛋白酶是昆蟲主要蛋白質(zhì)水解消化酶，其酶解產(chǎn)物是昆蟲生存和繁殖所需營養(yǎng)的重要來源（Bao et al.，2014），ESP2對叉角厲蝽的捕食和消化至關(guān)重要，當(dāng)被干擾表達(dá)后，必然會(huì)造成叉角厲蝽的消化系統(tǒng)紊亂，影響其捕食量。除消化功能外，絲氨酸蛋白酶還參與昆蟲的血液凝固、免疫反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化等作用（唐琦等，2017;趙愛平，2017），也有可能干擾ESP2基因的表達(dá)后，影響了叉角厲蝽的其他生理功能而造成其存活及捕食量顯著降低，這些功能還有待進(jìn)一步深入研究。而作為可分泌的毒液絲氨酸蛋白酶，EfSP2蛋白是否對獵物的生長發(fā)育、麻痹及免疫等方面存在影響，這將是本研究下一步的探索目標(biāo)。

4結(jié)論

成功克隆了叉角厲蝽毒液絲氨酸蛋白酶E/SP2基因。時(shí)空表達(dá)譜及RNAi結(jié)果表明，EfSP2可能是叉角厲蝽生長發(fā)育、捕食和消化過程中的重要蛋白之一。

參考文獻(xiàn)（References）：

初源.2017.絲氨酸蛋白酶SP1、SP13、SP105在亞洲玉米螟天然免疫反應(yīng)中的功能及作用機(jī)制[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué).[ChuY.2017.Functions and action mechanisms of serine proteaseSP1、SP13 and SP105 in the innate immune"response in Ostrinia furnacatis（Guenée）[D].Beiing：China"Agricultural University.]

高平，廖賢斌，李麗芳，蘭明先，趙航，陳斌，吳國星，高熹.2021.叉角厲蝽唾液腺轉(zhuǎn)錄組及差異分析[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），36（1）：29-38.[GaoP，LiaoXB，Li LF，Lan MX，Zhao H，Chen B，Wu GX，Gao X.2021.Transcriptome and difference analysis of Eocanthecona furcellata（Wolff）[J].Journal of Yunnan Agricultural Uni-versity（Natural Science），36（1）：29-38.]doi：10.12101/j.issn.1004-390X（n）.201011011.

葛釗宇，彭文學(xué)，李戎.2016.昆蟲絲氨酸蛋白酶的分子特點(diǎn)及進(jìn)化研究概況[J].南方農(nóng)業(yè)，10（31）：47-50.[Ge ZY，Peng WX，Li R.2016.Molecular characteristics and evo-lutionary studies of insect serine proteases[J].South China Agriculture，10（31）：47-50.]doi：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.31.014.

李飛，易金玉，劉玉娣，侯茂林.2021.白背飛虱若蟲和雄雌成蟲唾液腺蛋白鑒定[J].昆蟲學(xué)報(bào)，64（3）：281-301.[LiF，YiJY，Liu YD，Hou ML.2021.Identification of salivary gland proteins of nymphs and male and female adults of Sogatella furcifera（Hemiptera：Delphacidae）[J].Acta En-tomologica Sinica，64（3）：281-301.]doi：10.16380/j.kcxb 2021.03.001.

李麗芳.2016.管氏腫腿蜂毒液金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶基因的克隆與功能研究[D].昆明：西南林業(yè)大學(xué).[Li LF.2016.Molecular cloning and functional characteriza tion of venouse metalloprotease and serine protease genes"of Scleroderma guani[D].Kunming：Southwest Forestry"University.]

劉巧英，李夢歌，劉雪飛，余昊，王運(yùn)兵.2016.中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因克隆與序列分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，55（21）：5659-5663.[LiuQY，LiM G，Liu XF，Yu H，Wang YB.2016.Cloning and sequence analysis of serine pro-teinase of Adelphocoris suturalis Jakovlev[J].Hubei Agri-cultural Sciences，55（21）：5659-5663.]doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.056.

馬琳.2015.角倍蚜唾液蛋白的研究[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院.[Ma L.2015.Studies on saliva protens of Chi-nese horned gall aphid，Schlechtendalia chinensis[D].Bei-jing：Chinese Academy of Forestry.]

戚良軒，徐晴玉，李晶，鞠佳菲，孫洋，方繼朝，紀(jì)銳.2023.灰飛虱唾液鞘形態(tài)及其蛋白質(zhì)組分鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，39（1）：30-36.[Qi LX，Xu QY，Li J，Ju JF，Sun Y，F(xiàn)an JC，JiR.2023.Morphology and protein identification"of salivary sheath from Laodelphaxstriatellus[J].Jiangsu"Journal of Agricultural Sciences，39（1）：30-36.]doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.01.004.

蘇定義，王玉琴，李露，吳國星，朱家穎.2023.捕食性蝽類唾液腺解剖方法——以叉角厲蝽為例[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)45（4）：1126-1129.[Su DY，Wang YQ，LiL，Wu GX，ZhuJY.2023.A protocol for dissecting the salivary gland from predatory bug-A case study in Eocanthecona furcel-lata[J].Journal of Environmental Entomology，45（4）：1126-1129.]doi：10.3969/j.issn.1674-0858.2023.04.32.

唐琦，周倩，邱立鵬，李東，李國輝.2017.絲氨酸蛋白酶在昆蟲先天免疫中的功能和作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué)，43（3）：502-508.[Tang Q，ZhouQ，Qiu LP，LiD，Li GH.2017.Advances in functions and action mechanism of serine protease in insect innate immunity[J].Science of Sericulture，43（3）：502-508.]doi：10.13441/j.cnki.cykx.2017.03.022.

王雯.2019.絲氨酸蛋白酶ACYPI4531在豌豆蚜免疫防御反應(yīng)中的作用研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué).[Wang W.2019.The role of serine protease ACYPI4531 in immune responses of the pea aphid，Acyrthosiphonpisum[D].Yangling：Northwest Aamp;F University.]

王燕，張紅梅，尹艷瓊，李向永，趙雪晴，唐藝婷，王孟卿，諶愛東，陳福壽，張禮生.2019.蜀蝽成蟲對草地貪夜蛾不同齡期幼蟲的捕食能力[J].植物保護(hù)，45（5）：42-46.[Wang Y，Zhang HM，Yin YQ，Li XY，Zhao XQ，Tang YT，Wang MQ，Chen AD，Chen FS，Zhang LS.2019.Preda-tion of adult of Arma chinensis to larvae of Spodoptera fru-giperda[J].Plant Protection，45（5）：42-46.]doi：10.16688/j.zwbh.2019346.

王亞楠，趙勝園，何運(yùn)轉(zhuǎn)，吳孔明，李國平，封洪強(qiáng).2020.黃帶犀獵蝽對草地貪夜蛾幼蟲的捕食作用[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，36（4）：525-529.[Wang YN，Zhao SY，HeYZ，Wu KM，LiG P，F(xiàn)eng HQ.2020.Predationof the larvae of"Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）by Sycams croceouit-tatus Dohrn[J].Chinese Journal of BiologicalControl，36（4）：525-529.]doi：10.16409/j.cnki.2095-039x，2020.04.014.

許靜靜，常永梅，任夢圓，董艷玲，李永強(qiáng).2022.豌豆蚜可溶型海藻糖酶基因克隆及RNA干擾效應(yīng)[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），44（11）：88-98.[Xu JJ，Chang YM，Ren MY，Dong YL，LiY Q.2022.Gene cloningand RNA interference effects of soluble trehalase gene of the pea aphid，Acyrthosiphon pisum[J].Journal ofSouthwest University（Natural Science Edition），44（11）：88-98.]doi：10.13718/j.cnki.xdzk.2022.11.009.

鄔偉，程依情，王正亮，俞曉平.2022.褐飛虱clip絲氨酸蛋白酶基因NICSP4的克隆及功能分析[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，38（5）：1202-1212.[Wu W，Cheng YQ，Wang ZL，Yu XP.2022.Cloning and function analysis of aclip-domain serine protease gene NICSP4 in the brown planthopper，Nilaparvata lugens（Hemiptera：Delphacidae）[J].Chinese Journal of Biological Control，38（5）：1202-1212.]doi：10.16409/j.cnki.2095-039x.2021.11.008.

姚明勇，王嵐，周呂，黃敏，陳文龍.2019.性比對叉角厲蝽成蟲壽命和繁殖力的影響[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，38（3）：78-81.[Yao MY，Wang L，Zhou L，Huang M，Chen WL.2019.Effects of different sex ratios on longevity and fecun-dity of adults Cantheconidea furcellata（Hemiptera：Asopi-nae）[J].Journal of Mountain Agriculture and Biology，38（3）：78-81.]doi：10.15958/j.cnki.Sdnyswxb.2019.03.014.

張曼，高平，趙航，周辰彥，梁晨，湯永玉，邢孔正，吳國星，高熹.2022.捕食性天敵叉角厲蝽生長發(fā)育、繁殖及各蟲態(tài)形態(tài)特征觀察[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，53（4）：1078-1087.[Zhang M，GaoP，ZhaoH，ZhouCY，Liang C，Tang YY，Xing KZ，Wu GX，Gao X.2022.Development，fecundity and morphological characteristics of the predatory Eocan-theconafucellata（Wolff）[J].Journal of Southern Agri-culture，53（4）：1078-1087.]doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.04.021.

張新，陳成聰，杜琴，李喜旺，孫曉玲.2019.茶尺蠖絲氨酸蛋白酶基因EoSPI的克隆、時(shí)空表達(dá)及對饑餓的表達(dá)響應(yīng)[J].茶葉科學(xué)，39（6）：669-680.[Zhang X，Chen CC，Du Q，LiXW，Sun XL.2019.Cloning and expression analy-sis of serine protease EoSPI in tea geometrid（Ectropis obliqua）and its response to starvation[J].Journal of Tea"Science，39（6）：669-680.]doi：10.13305/j.cnki.jts.2019.06.006.

趙愛平.2017.梨小食心蟲幼蟲中腸胰蛋白酶活性、表達(dá)量及與生長發(fā)育的關(guān)系研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué).[Zhao AP.2017.Study of midgut trypsin activities and gene expression in oriental fruit moths during larval deve-lopment[D].Yangling：Northwest Aamp;F University.]

趙航，廖賢斌，高平，邢孔正，梁晨，吳國星，陳斌，高熹.2022.叉角厲蝽對亞洲玉米螟幼蟲的捕食功能反應(yīng)[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，44（2）：422-429.[Zhao H，LiaoXB，Gao P，Xing KZ，Liang C，Wu GX，Chen B，Gao X.2022.Functional"response of Eocantheconafiurcellata to the larvae of Ostri-nia furnacalis[J].Journal ofEnvironmental Entomology，44（2）：422-429.]doi：10.3969/j.issn.1674-0858.2022.02.19.

朱邦勤.2019.中黑盲蝽TiyP和PGL基因的克隆及生殖調(diào)控功能研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué).[Zhu BQ.2019.Cloning and reproductive regulation of TiyP and PGL"genes ofAdelphocoris suturalis[D].Wuhan：Huazhong"Agricultural University.]doi：10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000205.

朱艷娟.2021.蝎蝽消化器官的初步觀察與消化酶活性的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.[Zhu YJ.2021.Prelimi-nary observation on digestive organs and activities of digestive enzymes in Arma chinensis（Hemiptera：Pen-tatomidae）[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.]doi：10.27630/d.cnki.gznky.2021.000794.

Azevedo D 0，Zanuncio JC，Zanuncio JS，Martins GF，Marques-SilvaS，Sossai MF，Serrao JE.2007.Biochemi-cal and morphological aspects of salivary glands of the predator Brontocoris tabidus（Heteroptera：Pentatomidae）[J].Brazilian Archives of Biology and Technology，50：469-477.doi：10.1590/s1516-89132007000300013.

Bao YY，Qin X，Yu B，Chen LB，Wang ZC，Zhang CX.2014.Genomic insights into the serine protease gene family and"expression profile analysis in the planthopper，Nilapanvata lugens[J].BMC Genomics，15（1）：507.doi：10.1186/1471-2164-15-507.

Beak JH，Lee SH.2014.Differential gene expression profiles in the salivary gland of Orius laevigatus[J].Journal of Asia-Pacific Entomology，17（4）：729-735.doi：10.1016j.aspen.2014.06.015.

BellésX.2010.Beyond Drosophila：RNAiin vivo and functional genomics in insects[J].Annual Review of Entomology，55：111-128.doi：10.1146/annurev-ento-112408-085301.

Cohen AC.1990.Feeding adaptations in some predaceous Hemiptera[J].Annals of the Entomological Society of America，83（6）：1215-1223.

Danneels EL，RiversDB，de Graaf DC.2010.Venom proteins"of the parasitoid wasp Nasonia vitripenmis：Recent disco-very of an untapped pharmacopee[J].Toxins，2（4）：494-516.doi：10.3390/toxins2040494.

Formesyn EM，Heyninck K，de Graaf DC.2013.The roleof serine-and metalloproteases in Nasoniavitripenmis venom in cell death related processes towards aSpodoptera frugi-perda Sf21 celline[J].Journal of Insect Physiology，59（8）：795-803.doi：10.1016/j.jinsphys.2013.05.004.

Gorman MJ，Kankanala P，Kanost MR.2004.Bacterial chal-lenge stimulatesinnateimmuneresponses in extra-embryo-nic tissues of tobacco hornworm eggs[J].Insect Molecu-lar Biology，13（1）：19-24.doi：10.1111/j.1365-2583.2004.00454.x.

Joga MR，Zotti MJ，Smagghe G，Christiaens 0.2016.RNAi efficiency，systemic properties，and novel delivery me-thods for pest insect control：What we know so far[J].Fron-tiers in Physiology，7：553.doi：10.3389/fphys.2016.00553.Lemos WP，Ramalho FS，Serrao JE，Zanuncio JC.2005.Morphology of female reproductive tract of the predator"Podisus nigrispinus（Dallas）（Heteroptera：Pentatomidae）fed on diferent diets[J].Brazilian Archives of Biologyand Technology，48：129-138.doi：10.1590/s1516-89132005000100017.

Moreau MJS，Asgari S.2015.Venom proteins from parasitoid wasps and their biological functions[J].Toxins，7（7）：2385-2412.doi：10.3390/toxins7072385.

Perona JJ，Craik CS.1995.Structural basis of substrate speci ficityin the serine proteases[J].Protein Science，4（3）：337-360.doi：10.1002/pro.5560040301

Polanowski A，Wilusz T.1996.Serine proteinase inhibitors from insect hemolymph[J].Acta Biochimica Polonica，43：445-453.doi：10.18388/abp.1996-4476.

Ross J，Jiang HB，KanostM R，Wang Y.2003.Serine proteases and their homologs in the Drosophila melanogaster genome：An initial analysis of sequence conservation and phylogenetic relationships[J].Gene，304：117-131.doi：10.1016/s0378-1119（02）01187-3.

Rügen N，Jenkins TP，Wielsch N，Vogel H，Hempel BF，Süssmuth RD，Ainsworth S，Cabezas-Cruz A，Vilcinskas A，TonkM.2021.Hexapod assassins'potion：Venom com-position and bioactivity from the Eurasian Assassin bug"Rhynocorisiracumdus[J].Biomedicines，9（7）：819.doi：10.3390/biomedicines9070819.

Veillard F，Troxler L，Reichhart JM.2016.Drosophila melano-gaster clip-domain serine proteases：Structure，function and regulation[J].Biochimie，122：255-269.doi：10.1016/j.biochi.2015.10.007.

Walker AA，Hernandez MJ，Corzo G，F(xiàn)ry BG，King GF 2018.Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera[J].Cellular and Molecular Life Sciences，75：3215-3229.doi：10.1007/s00018-018-2768-1.

Walker AA，Madio B，Jin JY，Undheim EAB，F(xiàn)ry BG，King GE.2017.Melt with this kiss：Paralyzing and liquefying venom of the assassin bug Pristhesancus plagipennis（Hemiptera：Reduviidae）[J].Molecularamp;Cellular Pro-teomics，16（4）：552-566.doi：10.1074/mcp.ml16.063321.

Walker AA，Robinson SD，Undheim EA B，Jin JY，Han X，F(xiàn)ry BG，Vetter I，King GF.2019.Missiles of mass disrup-tion：Composition and glandular origin of venom used as aprojectiledefensiveweapon by the assassin bug Platymeris rhadamanthms[J].Toxins，11（11）：673.doi：10.3390/tox-insl1110673.

Walker AA，Weirauch C，F(xiàn)ry GB，KingGF.2016.Venoms of Heteropteran insects：A treasuretrove of diverse pharmaco-logical toolkits[J].Toxins，8（2）：43.doi：10.3390/toxins 8020043.

Wen J，Chen K，F(xiàn)u L，Chen YG.2017.Exposure ofEocan-thecona furcellata（Hemiptera：Pentatomidae）nymphs and"adults to high temperatures induces an aestivo-hibernal egg diapause：A strategy for surviving hot summers[J].Applied Entomology and Zoology，52：457-467.doi：10.1007/s13355-017-0497-9.

（責(zé)任編輯 麻小燕）