摘 要 采集不同作物（花椒、玉米）與魔芋套作后的土壤樣品，通過ASV高通量測(cè)序方法分析根際土壤中的微生物信息，探究不同套作模式下魔芋根際微生物群落組成和多樣性的差異。結(jié)果表明：不同栽培模式能影響土壤微生物的活性和多樣性，表現(xiàn)在Chao1、Ace和Shannon指數(shù)都出現(xiàn)差異，玉米-魔芋栽培模式下，增加了擬桿菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度；花椒-魔芋栽培模式下，增加了放線菌門的相對(duì)豐度。不同健康情況下的土壤微生物存在差異，患軟腐病的花椒-魔芋套作增加了擬桿菌門和藍(lán)藻菌門的相對(duì)豐度，正常的花椒-魔芋套作中，放線菌門相對(duì)豐度更大。

關(guān)鍵詞 套作；魔芋；土壤微生物群落；多樣性；豐度

中圖分類號(hào)：S632.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.11.004

根際微生物的數(shù)量往往比根際區(qū)外多數(shù)十倍，在植物根系的直接作用下促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和增殖，并且與植物的根之間存在著相互作用關(guān)系。微生物既能分解有機(jī)物，又能給植物提供營養(yǎng)，同時(shí)也能產(chǎn)生一些其他的物質(zhì)，如維生素和生長(zhǎng)刺激素，為植物提供重要的養(yǎng)分及能源，另外，土壤中的通氣性和水分狀態(tài)也會(huì)對(duì)微生物的生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響。

將魔芋與花椒或玉米進(jìn)行套作栽培，是農(nóng)民提高作物產(chǎn)量的種植方法。但魔芋生長(zhǎng)習(xí)性比較特別，不耐旱也不耐澇，同時(shí)由于魔芋的根系比較淺，在黏性土壤中生長(zhǎng)比較緩慢，容易受到根際微生物的影響。作為一種重要的生物群落，根際微生物群落對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和健康具有重要的影響。這些微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌等，它們常常與植物根系形成共生關(guān)系，相互利用和促進(jìn)生長(zhǎng)。保證作物的根系健康是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要措施之一。通過調(diào)整土壤的性質(zhì)和改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，可以提供良好的根際生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)根際的發(fā)育。這需要加強(qiáng)根際微生物的多樣性檢測(cè)管理，調(diào)節(jié)土壤酸堿與微生物的數(shù)量平衡等[1]。只有健康的根際環(huán)境才能有效吸收養(yǎng)分和水分，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，研究作物根際微生物多樣性的關(guān)系與變化，對(duì)作物健康生長(zhǎng)非常重要。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于四川省涼山彝族自治州美姑縣，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)域，具有典型的山地氣候特點(diǎn)，晝夜溫差較大，年均氣溫11.4 ℃，光照雨量條件充足，全年日照較好，年均日照時(shí)數(shù)1 791 h，年均降水量815 mm，該區(qū)土壤質(zhì)地以黃棕壤為主。

1.2" 測(cè)序試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，分別為玉米-魔芋套作、花椒-魔芋套作和攜帶軟腐病的花椒-魔芋套作。2023年，于魔芋成熟期的11月采集各處理的土壤樣品，每個(gè)處理隨機(jī)選取采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的作物，采集魔芋根系上附著的土壤作為試驗(yàn)根際土壤，挑出根系、秸稈、石塊等雜物，輕刮根際剩余土壤作為樣品，所有樣品用無菌塑料袋收集，收集后放在干冰上立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，并根據(jù)研究需要分成2份，1份存儲(chǔ)在?80 ℃用于DNA高通量測(cè)序分析，另1份風(fēng)干用于理化指標(biāo)檢測(cè)和分析。采用高通量測(cè)序技術(shù)獲取土壤微生物的Chao1、Ace和Shannon 指數(shù)，分析土壤微生物多樣性特征。

測(cè)序試驗(yàn)流程如下：

環(huán)境樣品DNA提取→設(shè)計(jì)合成引物接頭→PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物定量與均一化→構(gòu)建PE文庫→Illumina測(cè)序

1.2.1" DNA提取

使用DNA試劑盒（Omega Bio-tek， Norcross， GA， USA）提取每個(gè)樣品的DNA，待每個(gè)DNA提取后，使用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)抽提的DNA基因組。

1.2.2" PCR擴(kuò)增

在測(cè)序?qū)嶒?yàn)的指定測(cè)序區(qū)域合成帶有barcode的特異引物[2]。PCR 實(shí)驗(yàn)采用TransGen AP221-02，PCR儀為ABI GeneAmpamp;reg 9700型。對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，混合處理同一樣本的PCR產(chǎn)物，接著使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用AxyPrepDNA（AXYGEN）凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，最后使用Tris_HCl進(jìn)行洗脫處理[3]。PCR擴(kuò)增結(jié)果鑒定膠圖見圖1。

1.2.3" PCR產(chǎn)物定量

根據(jù)電泳定量結(jié)果利用QuantiFluor?-ST（Promega）定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，接著按照樣品測(cè)序需求，將PCR產(chǎn)物按一定比例混合。

1.2.4" Illumina文庫構(gòu)建

利用PCR技術(shù)在目標(biāo)區(qū)的外部末端添加Illumina官方接頭序列，使用凝膠回收試劑盒切膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。緩沖液Tris-HCl進(jìn)行洗脫處理，2%瓊脂糖電泳進(jìn)行測(cè)定，使用氫氧化鈉進(jìn)行變性進(jìn)而生成單鏈DNA片段[4]。試劑：TruSeqTM DNA Sample Prep Kit。

1.2.5" Illumina測(cè)序

DNA片段作為試驗(yàn)測(cè)序模板，堿基序列作為引物，PCR合成DNA片段；變性退火處理后，DNA片段一端將與引物互補(bǔ)固定以合成連接；對(duì)反應(yīng)序列表面進(jìn)行掃描，得到單個(gè)序列模板在每次反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程中所生成的核苷酸種類；利用化學(xué)切割技術(shù)恢復(fù)基因端黏性，聚合核苷酸，統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)結(jié)果獲得模板DNA片段的序列[5]。

1.3" 生物信息分析

使用ASV（Amplicon Sequence Variant）高通量測(cè)序方法，可以進(jìn)行物種分類、群落多樣性分析、物種差異分析、相關(guān)性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和功能預(yù)測(cè)分析等一系列的統(tǒng)計(jì)學(xué)或可視化分析。將Illumina測(cè)序獲得的PE reads分割后，首先基于測(cè)序質(zhì)量對(duì)雙端Reads進(jìn)行質(zhì)控和篩選，同時(shí)根據(jù)雙端Reads之間的overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，獲得質(zhì)控拼接之后的優(yōu)化數(shù)據(jù)。使用序列降噪方法處理優(yōu)化數(shù)據(jù)，獲得ASV代表序列和豐度信息[6-7]?；贏SV代表序列及豐度信息，進(jìn)行群落多樣性分析，得到微生物群落分布柱狀圖，如圖2所示。所有的數(shù)據(jù)分析均在生物云平臺(tái)上進(jìn)行，采用mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)Chao1、Ace和Shannon 指數(shù)，并采用Wilxocon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行Alpha多樣性的組間差異分析[8]，確定不同組間水平豐度顯著差異的的細(xì)菌類群。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同栽培模式對(duì)根際微生物多樣性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，玉米-魔芋和花椒-魔芋兩種套作模式下的根際微生物群落有差異。由表1可知，玉米-魔芋套作模式下，擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）的相對(duì)豐度得到提升，豐度占比分別為9%、16%。而花椒-魔芋套作模式下的放線菌門（Actinobacteriota）的占比更大，提高到了22%。擬桿菌門與綠彎菌門對(duì)玉米-魔芋這種套作栽培模式更敏感，而花椒-魔芋套作栽培模式對(duì)放線菌門的影響更大。由表2可知，玉米-魔芋與花椒-魔芋2種套作方式改變了其根際微生物的多樣性。在Chao1和Ace指數(shù)[9]方面，花椒-魔芋套作比玉米-魔芋套作分別提高了20%和19%，Shannon指數(shù)也有相同趨勢(shì)，花椒-魔芋套作比玉米-魔芋套作提高了5%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩種栽培模式下作物的微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著差別，即玉米和花椒兩種不同作物與魔芋套作對(duì)魔芋根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成有不同的影響作用，并且花椒-魔芋這種套作模式對(duì)魔芋根際的土壤微生物的影響更為顯著。

玉米-魔芋與花椒-魔芋兩種套作模式充分發(fā)揮高矮作物的空間配置優(yōu)勢(shì)，但不同栽培模式能影響土壤微生物的活性和多樣性[10]。在作物栽培中，可以利用套作措施有效調(diào)控種群間比率的方法，根據(jù)根際微生物的差異去選擇合適的栽培模式，以達(dá)到最理想的種植效果。

2.2" 不同健康情況下的根際微生物多樣性差異

胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌（Ewinia caroto-voravar carotovora）引起的魔芋軟腐病是一種細(xì)菌性病害，其致病機(jī)制是病原微生物釋放的果膠酶，細(xì)胞中層發(fā)生溶解，腐蝕組織，從而吸引其他的腐菌，并將其分解，生成吲哚，發(fā)出惡臭[11]。針對(duì)正常的花椒-魔芋套作與患軟腐病的花椒-魔芋套作進(jìn)行根際微生物分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)，患軟腐病的套作中的根際微生物擬桿菌門（Bacteroidota）與藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）相對(duì)含量得到增加，分別提升到了21%和19%，而正常的花椒-魔芋套作中的根際微生物放線菌門（Actinobacteriota）相對(duì)含量更多，達(dá)到了22%（見表1）。

擬桿菌門是一類單細(xì)胞，可廣泛存在于土壤，是微生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一部分，能夠幫助宿主維持健康和免疫功能。藍(lán)藻菌門是光合細(xì)菌，具有多種生物防控應(yīng)用，藍(lán)藻可以釋放酶、分解病原體的細(xì)胞壁或菌絲，與病原體和害蟲競(jìng)爭(zhēng)根際空間和養(yǎng)分，并通過與植物根部的互動(dòng)來激活植物的防御反應(yīng)。很多健康的植物在未被病原體感染以前，就已經(jīng)包含了各種各樣的抗病性細(xì)菌，比如檢測(cè)到的擬桿菌門與藍(lán)藻菌門等。在作物患上軟腐病后，作物在與病原微生物演化的同時(shí)，也形成了復(fù)雜的抗性機(jī)制，以應(yīng)對(duì)病原的多重致病方式，導(dǎo)致擬桿菌門與藍(lán)藻菌門等抗病性細(xì)菌的含量急劇增加，以抵抗病原物的侵入和擴(kuò)展。而土壤放線菌門是一類促生性細(xì)菌，這類細(xì)菌可以分解有機(jī)物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化成為植物可以使用的營養(yǎng)物質(zhì)，從而為植物的生長(zhǎng)提供養(yǎng)分[12-14]。健康的植物土壤中，富含更多的營養(yǎng)物質(zhì)，土壤放線菌與這些物質(zhì)形成共生關(guān)系，微生物豐度增多。這就解釋了為什么患病套作的抗病性細(xì)菌的豐度增加，正常套作的土壤中促生性細(xì)菌更多的原因。

3" 討論與結(jié)論

根際土壤微生物的數(shù)量與種類對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和健康狀況具有重要的作用，其多樣性對(duì)根際營養(yǎng)元素的吸收與轉(zhuǎn)化也具有重要的作用，其中有益菌能夠增加土壤中的有效營養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)作物對(duì)環(huán)境的抗性[15]。具體比較玉米-魔芋與花椒-魔芋兩種套作處理魔芋根際微生物的真菌及細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)不同栽培模式處理的部分根際微生物的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)較大差異。玉米-魔芋與花椒-魔芋兩種套作方式顯著影響了根際微生物的多樣性，表現(xiàn)在Chao 1、Ace和Shannon指數(shù)發(fā)生顯著變化。根際細(xì)菌在門類上的相對(duì)豐度出現(xiàn)差異，這是由于根際土壤中含有豐富的微生物，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化與土壤類型、根際營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)及栽培方式等因素有關(guān)[16-17]。

不同套作模式影響根際微生物多樣性體現(xiàn)在改變了根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，對(duì)微生物種類、數(shù)量、豐度等均有一定影響。除此之外，對(duì)比患軟腐病和健康的花椒-魔芋套作的試驗(yàn)結(jié)果顯示，擬桿菌門、藍(lán)藻菌門和放線菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，這些抗病菌和促生菌參與植物抗病機(jī)制與提供養(yǎng)分過程，在此發(fā)育過程中微生物相對(duì)豐度發(fā)生改變，進(jìn)而促進(jìn)魔芋的生長(zhǎng)發(fā)育并提高魔芋品質(zhì)。研究表明，不同的種植方式和作物的健康狀況會(huì)影響土壤根系微生物的多樣性及組成，特別是有益微生物的分布組成，對(duì)土壤微生物的調(diào)控具有重要意義。

綜上所述，不僅根際微生物群落能對(duì)作物產(chǎn)生影響，作物的生長(zhǎng)方式和生長(zhǎng)狀況對(duì)微生物群落的影響也是顯著的，其生態(tài)平衡的調(diào)整和優(yōu)化，對(duì)現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量提升至關(guān)重要，需要在實(shí)踐中探索適合不同環(huán)境條件下的調(diào)控策略，不斷提高根際微生物群落的生態(tài)效應(yīng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)性，根際微生物的群落結(jié)構(gòu)龐大，更多的促生菌和抗病菌需要未來進(jìn)一步分析和鑒定。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）