摘要： 【目的】探究馬鈴薯塊莖高表達(dá)基因StSuSy4 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。【方法】克隆StSuSy4 的啟動(dòng)子，構(gòu)建pAbAi-StSuSy4pro 誘餌載體，并將其轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞Y1HGold 中，獲得誘餌酵母菌株；利用誘餌載體篩選馬鈴薯幼嫩塊莖組織酵母文庫，并對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行組織表達(dá)模式分析?！窘Y(jié)果】經(jīng)酵母單雜交篩選，獲得1 個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子StBBX25，該基因的開放閱讀框?yàn)?74 bp，編碼258 個(gè)氨基酸。生物信息分析顯示：StBBX25的N 端含有B-box 蛋白的特征結(jié)構(gòu)域B-box1。候選轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的酵母單雜交驗(yàn)證結(jié)果顯示：在200 ng/mL 金擔(dān)子素條件下，pGADT7-AD 空載對(duì)照組酵母不能正常生長(zhǎng)，而pGADT7-StBBX25試驗(yàn)組能正常生長(zhǎng)，表明StBBX25 與StSuSy4 基因啟動(dòng)子存在互作。組織表達(dá)模式分析顯示：StBBX25 和StSuSy4 均為在馬鈴薯塊莖中表達(dá)較高的基因?！窘Y(jié)論】StBBX25 與StSuSy4 啟動(dòng)子互作，暗示StBBX25 可能在馬鈴薯葉片和塊莖淀粉合成以及產(chǎn)量形成中發(fā)揮作用。研究結(jié)果為深入理解馬鈴薯淀粉合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 馬鈴薯；淀粉合成；StSuSy4；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；酵母單雜交；StBBX25

中圖分類號(hào)： S523.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 03?0017?08

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.） 是茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum） 一年生草本植物，在中國已有400 多年的栽培歷史。因其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，馬鈴薯已成為繼小麥、玉米、水稻之后的世界第四大糧食作物。淀粉作為馬鈴薯干物質(zhì)的主要成分，不僅提供了人類所需的能量，在工業(yè)領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。塊莖是馬鈴薯淀粉的主要貯藏器官，塊莖中淀粉的合成來源于葉片中合成的蔗糖。當(dāng)存在尿苷二磷酸（uridine diphos-phate，UDP） 時(shí)，蔗糖合酶（sucrosesynthase，SuSy） 將蔗糖分解成果糖和UDP-葡萄糖（uridine diphos-phate glucose，UDPG），在UDPG 焦磷酸化酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等的作用下，最終產(chǎn)生淀粉合成的直接底物腺苷二磷酸葡萄糖（adenosinediphosphate glucose，ADPG）。作為將光合同化物蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸鄣年P(guān)鍵酶，SuSy 在淀粉合成和庫強(qiáng)度代謝調(diào)控過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)：馬鈴薯中過表達(dá)StSuSy4 可促進(jìn)UDPG 和ADPG 生成，增加塊莖產(chǎn)量和淀粉含量[1]。在玉米中高表達(dá)StSuSy4 后，其種子胚乳中的淀粉和ADPG 含量均顯著增加[2]。

除了參與淀粉合成，蔗糖合酶基因在植物的生長(zhǎng)代謝和抗逆反應(yīng)中具有重要作用。由于蔗糖合酶能夠提供纖維素合成的底物UDPG，因此在纖維素合成過程中起重要作用。使用種子和纖維特異性啟動(dòng)子抑制棉花蔗糖合酶基因SUS 表達(dá)，導(dǎo)致棉纖維起始和延伸受到影響，最終產(chǎn)生基本無棉纖維的棉花種子[3]。蔗糖合酶基因GhSusA1的抑制表達(dá)導(dǎo)致纖維長(zhǎng)度變短，高表達(dá)則增加了纖維長(zhǎng)度和強(qiáng)度[4]。番茄中沉默蔗糖合酶基因SUS 導(dǎo)致子葉和葉片形態(tài)異常，莖尖分生組織中生長(zhǎng)素相關(guān)基因的表達(dá)和生長(zhǎng)素的運(yùn)輸均發(fā)生了改變[5]。此外，蔗糖合酶基因還可參與氧脅迫、高溫等非生物逆境脅迫過程。在黃瓜中，抑制SUS3 表達(dá)增強(qiáng)了黃瓜對(duì)缺氧壓力的敏感性[6]；OsSUS3 基因高表達(dá)可降低高溫脅迫下水稻種子的白堊程度，從而減輕高溫對(duì)水稻的危害[7]。

SuSy 的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子直接或間接調(diào)控。在木薯中，AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子MeERF72 直接結(jié)合MeSus1 啟動(dòng)子，負(fù)向調(diào)控其表達(dá)水平[8]；高表達(dá)bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子ZmPTF1 導(dǎo)致低磷條件下玉米根中蔗糖合酶基因sh1B 和 sus1 表達(dá)下降[9]；FLO2 基因發(fā)生突變的水稻胚乳中，直鏈淀粉含量降低，支鏈淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蔗糖合酶等參與淀粉生物合成的基因表達(dá)水平顯著降低[10]。馬鈴薯中含有6 個(gè)SuSy 基因[11]，其中StSuSy4 在塊莖中高表達(dá)，是參與塊莖淀粉合成的主要蔗糖合酶。為了研究StSuSy4 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究利用酵母單雜交篩庫技術(shù)篩選可直接與StSuSy4啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步解析淀粉合成調(diào)控的分子基礎(chǔ)，也可為高品質(zhì)馬鈴薯品種選育提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

二倍體馬鈴薯C151 從國際馬鈴薯研究中心引進(jìn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的啟動(dòng)子擴(kuò)增

在馬鈴薯基因組網(wǎng)站（http：//spuddb.uga.edu/）搜索StSuSy4 基因啟動(dòng)子序列，并設(shè)計(jì)引物（表1）StSuSy4-promoter 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以二倍體馬鈴薯C151 的DNA 為模板，使用KOD One 酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（體系和程序參照KOD 酶說明書），再將目的片段連接至pTOPO 克隆載體上。

1.2.2 pAbAi-StSuSy4pro 重組質(zhì)粒構(gòu)建

設(shè)計(jì)帶有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基的引物，用1.2.1 節(jié)測(cè)序正確的pTOPO克隆載體為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將pAbAi 載體進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；挑選單菌落，使用載體引物pAbAi-R 和pAbAi-StSuSy4pro （表1） 進(jìn)行陽性鑒定，并將測(cè)序正確的菌株進(jìn)行甘油保存，液氮速凍后保存于?80 ℃冰箱，即得到pAbAi-StSuSy4pro 重組質(zhì)粒。

1.2.3 pAbAi-StSuSy4pro 誘餌載體菌株構(gòu)建

（1） pAbAi-StSuSy4pro 重組質(zhì)粒線性化

37 ℃ 條件下用內(nèi)切酶BstB Ⅰ線性化pAbAi-StSuSy4pro 重組質(zhì)粒，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收，備用；以未酶切的重組質(zhì)粒為對(duì)照，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

（2） pAbAi-StSuSy4pro 誘餌載體菌株構(gòu)建

取提前制備的Y1HGold 感受態(tài)細(xì)胞100 μL，將線性化的pAbAi-StSuSy4pro 重組質(zhì)粒2 μg 轉(zhuǎn)化入感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂布于預(yù)先配制的SD/-Ura 固體培養(yǎng)基中，于30 ℃ 培養(yǎng)。對(duì)酵母單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，以驗(yàn)證pAbAi-StSu-Sy4pro 重組質(zhì)粒是否整合至酵母細(xì)胞基因組中。挑選陽性的誘餌克隆并進(jìn)行甘油保存，液氮速凍后保存于?80 ℃ 冰箱。

1.2.4 酵母單雜交文庫篩選

（1） 建庫

取二倍體馬鈴薯C151 幼嫩薯塊約1 cm，送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司構(gòu)建酵母雜交cDNA 文庫。

（2） 金擔(dān)子素（aureobasidin A，AbA） 的背景質(zhì)量濃度篩選

① 制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。吸取pAbAi-StSu-Sy4pro 酵母菌株至YPDA 液體培養(yǎng)基10 mL 中，30 ℃、200 r/min 搖菌至OD600 值為0.600，并將其分為2 份。其中一份用0.9% NaCl 溶液重懸，使OD600 值為0.002，分別涂布菌液100 μL 于含有0、50、100、150、200 和300 ng/mL AbA 的SD/-Ura 固體培養(yǎng)基上；另一份用于制備酵母感受態(tài)。

② 酵母轉(zhuǎn)化。吸取酵母感受態(tài)細(xì)胞100 μL，將pGADT7-AD 空載轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，并測(cè)定轉(zhuǎn)化后的酵母菌OD600 值；用0.9% NaCl 溶液重懸，使OD600 值為0.002。涂布菌液100 μL 于含有0、50、100、150、200 和300 ng/mL AbA 的SD/-Leu 固體培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)3 d 后觀察其生長(zhǎng)情況，確定后續(xù)篩庫所需的AbA 質(zhì)量濃度。

（3） 酵母單雜交文庫篩選

① 初篩。取pAbAi-StSuSy4pro 酵母菌株10 μL于YPDA 培養(yǎng)液3 mL 中，30 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)， 直至OD600 值為0.600。制備酵母感受態(tài)，將酵母文庫質(zhì)粒10 μg 轉(zhuǎn)入該感受態(tài)中，取菌液100 μL 進(jìn)行1/10 和1/100 稀釋，并涂布于SD/-Leu 平板，用于計(jì)算轉(zhuǎn)化效率；其余菌液涂布于SD/-Leu/AbA150 平板，每塊平板150 μL，涂布約20 塊，于30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，長(zhǎng)出1～2 mm 單克隆，即完成初篩。

② 復(fù)篩。將初篩平板上長(zhǎng)出的克隆劃線于培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA150 上，進(jìn)行二次篩選。

③ 陽性克隆鑒定。復(fù)篩培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單克隆后，加入1×TE 緩沖液50 μL 中重懸菌體，重懸后的菌體置于98 ℃ 金屬浴中5 min 進(jìn)行破壁，后置于冰上冷卻，重復(fù)操作3 次，高速瞬時(shí)離心，保留上清。使用Vazyme Green Taq Mix 體系，以T7 和3′AD 為引物（表1），對(duì)插入到pGADT7 載體中的cDNA 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（體系和程序參照說明書），挑選陽性產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司，利用T7 引物測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 上比對(duì)，將未產(chǎn)生移碼突變的序列作為候選基因進(jìn)行酵母單雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)。

④ 點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。利用天根酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取酵母質(zhì)粒，將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)繁，并重新提取質(zhì)粒。將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至pAbAi-StSuSy4pro 酵母感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于SD/-Leu-Ura 培養(yǎng)基，將pGADT7-AD 空載轉(zhuǎn)化到pAbAi-StSuSy4pro 酵母細(xì)胞中并作為陰性對(duì)照，備用。挑取3 個(gè)SD/-Leu-Ura培養(yǎng)基中的菌斑為1 個(gè)混樣，做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在SD/-Leu-Ura 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，測(cè)定OD600 值；吸取菌液50 μL，用滅菌水稀釋菌液，使其OD600 值為0.100；分別吸取菌液5 μL 涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA100 和SD/-Leu/AbA200 平板上，觀察菌斑生長(zhǎng)情況。在酵母質(zhì)粒驗(yàn)證互作后，克隆候選基因StBBX25 的全長(zhǎng)再次進(jìn)行驗(yàn)證。在馬鈴薯基因組網(wǎng)站中獲得StBBX25 CDS 序列，以馬鈴薯塊莖的總RNA 為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到塊莖cDNA；設(shè)計(jì)分別帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基的特異性引物pGADT7-StBBX25-F 和pGADT7-StBBX25-R （表1），以cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（體系和程序參照說明書），將產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并純化，連接至線性化的pGADT7 載體上，得到pGADT7-StBBX25重組質(zhì)粒。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至pAbAi-StSuSy4pro 酵母感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于SD/-Leu-Ura 培養(yǎng)基，30 ℃ 條件下靜置培養(yǎng)3 d，將pGADT7 空載轉(zhuǎn)化到pAbAi-St-SuSy4pro 酵母感受態(tài)中并作為陰性對(duì)照，觀察菌斑生長(zhǎng)情況，方法同上述酵母質(zhì)粒。

1.2.5 基因表達(dá)模式分析

StBBX25 和StSuSy4 在馬鈴薯富利亞薯 （S.phureja） 雙單倍體材料各組織的FPKM 值參考MASSA 等[12]發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pAbAi-StSuSy4pro 酵母誘餌的表達(dá)載體

通過PCR 擴(kuò)增獲得800 bp 的啟動(dòng)子條帶（圖1a）。pAbAi-StSuSy4pro 重組載體陽性菌株鑒定得到大小約為900 bp 的擴(kuò)增條帶（圖1b）。將質(zhì)粒pAbAi-StSuSy4pro 線性化，條帶如圖1c 所示。攜帶線性化載體的酵母菌株鑒定得到大小約為1 000 bp 的擴(kuò)增條帶（圖1d），表明pAbAi-StSuSy-4pro 酵母誘餌表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 AbA 的背景質(zhì)量濃度

背景質(zhì)量濃度篩選結(jié)果顯示：抑制pAbAi-StSuSy4pro 誘餌載體酵母菌株生長(zhǎng)的AbA 最小質(zhì)量濃度為100 ng/mL （圖2a）；在pGADT7-AD 空載轉(zhuǎn)入的陽性誘餌菌株中發(fā)現(xiàn)抑制該酵母生長(zhǎng)的AbA 最小質(zhì)量濃度為150 ng/mL （圖2b）。為了充分抑制酵母生長(zhǎng)，后續(xù)試驗(yàn)采用150 ng/mL AbA。

2.3 酵母單雜交文庫篩選結(jié)果

復(fù)篩后陽性酵母菌株的PCR 鑒定結(jié)果顯示：條帶多集中于500～2 000 bp （圖3）。經(jīng)測(cè)序和NCBI預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中1 個(gè)基因?yàn)殇\指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，該基因編碼StBBX25[13] ， 其完整CDS 序列為774 bp，編碼258 個(gè)氨基酸，N 端含有1 個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域（圖4）。

2.4 酵母單雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)互作驗(yàn)證結(jié)果

提取到的酵母質(zhì)粒和pGADT7-AD 空載質(zhì)粒的誘餌酵母菌株均可在SD/-Leu-Ura 缺陷培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)（圖5a）。點(diǎn)板驗(yàn)證結(jié)果顯示：在SD/-Leu/AbA200 培養(yǎng)基上，對(duì)照組pGADT7-AD 的酵母無法正常生長(zhǎng)，而試驗(yàn)組酵母質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的酵母細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)，暗示著轉(zhuǎn)錄因子StBBX25與StSuSy4 基因啟動(dòng)子之間存在相互作用，從而激活了報(bào)告基因AbA 的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因是否與StSuSy4 啟動(dòng)子有互作關(guān)系，克隆候選基因StBBX25 的全長(zhǎng)再次進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示重組載體pGADT7-StBBX25 擴(kuò)增條帶約為900 bp（圖5b）；在SD/-Leu 培養(yǎng)基上，pGADT7-AD 和pGADT7-StBBX25 能正常生長(zhǎng)；在SD/-Leu/AbA200培養(yǎng)基上，pGADT7-AD 對(duì)應(yīng)的酵母細(xì)胞不能生長(zhǎng)，pGADT7-StBBX25 對(duì)應(yīng)的酵母細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)（圖5c），由此進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)錄因子StBBX25與StSuSy4 基因啟動(dòng)子存在互作。

2.5 基因的表達(dá)模式

由表2 可知：StSuSy4 在淀粉合成的關(guān)鍵部位塊莖中的表達(dá)量最高，其次為花瓣和花；StBBX25在雄蕊和塊莖中的表達(dá)量明顯高于其他組織?？梢?，StBBX25 和StSuSy4 均為在馬鈴薯塊莖中表達(dá)量較高的基因，但兩者的表達(dá)豐度相差約9 倍。

3 討論

酵母單雜交篩庫技術(shù)在淀粉合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選中的應(yīng)用報(bào)道較少。AJAYO 等[14]以淀粉合成限速酶AGPase 的啟動(dòng)子為誘餌，篩選了玉米胚乳組成的酵母文庫，發(fā)現(xiàn)ZmTCP7 能夠結(jié)合AGPase 啟動(dòng)子，并正向調(diào)控其表達(dá)。本研究通過該技術(shù)篩選出與StSuSy4 啟動(dòng)子互作的StBBX25，該蛋白N 端含有1 個(gè)B-box 結(jié)構(gòu)域，屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族。鋅指轉(zhuǎn)錄因子是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。B-box 蛋白N 端包含1 個(gè)B-box （B-box1） 或2 個(gè)B-box 基序（B-box1 和Bbox2），B-box1 的保守序列為CX2CX7-8CX2DXAXLCX2CDX3H，B-box2 的保守序列為CX2CX3PX4CX2CDX3H[15]。BBX 家族在擬南芥中有32 個(gè)成員[16]，在番茄中有29 個(gè)成員[17]，在馬鈴薯中有30 個(gè)成員[13]。擬南芥中BBX 蛋白參與控制幼苗光形態(tài)發(fā)生、光周期調(diào)控開花、避蔭以及生物和非生物脅迫響應(yīng)等過程，B-box 基序中的保守殘基已被證明在介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中至關(guān)重要[16]。番茄BBX20 則參與類胡蘿卜素的合成，BBX20 與胡蘿卜素生物合成途徑中的八氫番茄紅素合成酶基因PSY1 啟動(dòng)子互作，結(jié)合啟動(dòng)子中的G-box，并激活該基因的表達(dá)，同時(shí)BBX20 與DET1 互作，導(dǎo)致BBX20 受到泛素化降解[18]。在馬鈴薯中，BBX 家族基因的表達(dá)受晝夜節(jié)律的調(diào)控，同時(shí)其表達(dá)與黃化、去黃化過程緊密相關(guān)[12]。本研究表明：StBBX25 與St-SuSy4 啟動(dòng)子互作，StSuSy4 啟動(dòng)子序列包含典型的G-box 序列CACGTG。結(jié)合目前已有對(duì)StSuSy4功能的研究，推測(cè)StBBX25 可通過與G-box 結(jié)合來調(diào)控StSuSy4 的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)馬鈴薯葉片和塊莖中的淀粉合成以及產(chǎn)量形成發(fā)揮作用。馬鈴薯BBX 家族基因的生物學(xué)功能知之甚少，因此，StBBX25 的鑒定可為深入理解該家族基因的功能提供思路。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了淀粉合成關(guān)鍵基因StSuSy4 的啟動(dòng)子載體，篩選了幼嫩塊莖組成的酵母文庫，發(fā)現(xiàn)StBBX25 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合StSuSy4基因的啟動(dòng)子，并通過酵母單雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)試驗(yàn)證明了它們之間存在互作。StBBX25 在馬鈴薯塊莖中的表達(dá)量較高，符合其在塊莖中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的特征。

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責(zé)任編輯：何謦成

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（32360756）；云南省院士工作站（202105AF150028）。