郭艷平 楊青 王詩(shī)睿 李思敏 于博陽(yáng) 楊筱鳳

摘要：目的 探討SOX1和PAX1基因甲基化檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別病變二次分流的價(jià)值。方法 采集122例人乳頭瘤病毒（HPV）陽(yáng)性患者的宮頸脫落細(xì)胞，同時(shí)行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）和SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)。結(jié)果 HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）2級(jí)及以上（CIN2+）檢出靈敏度為95.24%，特異度為23.75%。結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后，對(duì)CIN2+檢出靈敏度為83.33%，與HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.078）；特異度為77.50%，明顯高于HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)（P<0.001）。CIN2+組SOX1/PAX1基因甲基化水平高于正常宮頸組織及CIN1組（P<0.001）。SOX1、PAX1基因甲基化對(duì)CIN2+診斷的截?cái)嘀捣謩e為-11.81、-11.98。結(jié)論 SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后，CIN2+檢出的效能和準(zhǔn)確性明顯提升。

關(guān)鍵詞：SOX1；PAX1；甲基化；宮頸病變

中圖分類號(hào)： R711? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A? 文章編號(hào)：1000-503X（2024）03-0329-05

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15734

Value of SOX1 and PAX1 Gene Methylation Detection in Secondary Triage of High-Grade Cervical Lesions

GUO Yanping，YANG Qing，WANG Shirui，LI Simin，YU Boyang，YANG Xiaofeng

Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 71006 China

Corresponding author：YANG Xiaofeng Tel：029-85323844，E-mail：yxf73@163.com

ABSTRACT：Objective To evaluate the value of SOX1 and PAX1 gene methylation detection in the secondary triage of high-grade cervical lesions.Methods Exfoliated cervical cells were collected from 122 patients tested positive for human papilloma virus （HPV） and subjected to thin-prep cytologic test （TCT） and SOX1/PAX1 gene methylation tests.Results The HPV test combined with TCT showed the sensitivity of 95.24% and the specificity of 23.75% for detecting cervical intraepithelial neoplasia （CIN） grade 2 and above （CIN2+）.After the addition of the SOX1/PAX1 gene methylation detection in secondary triage，the sensitivity for detecting CIN2+ was 83.33%，which had no statistically significant difference from the sensitivity of TCT combined with HPV test （P=0.078）.However，the specificity reached 77.50%，which was significantly higher than that of HPV test combined with TCT （P<0.001）.The SOX1/PAX1 gene methylation level in the CIN2+ group was higher than those in the normal cervical tissue and the CIN1 group（P<0.001）.The cut-off values of SOX1 and PAX1 gene methylation for CIN2+ detection were -11.81 and -11.98，respectively.Conclusion Adding the detection of SOX1/PAX1 gene methylation in secondary triage significantly improves the efficiency and accuracy of CIN2+ detection.

Key words：SOX1；PAX1；methylation；cervical lesion

Acta Acad Med Sin，2024，46（3）：329-333

宮頸癌發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居首位，我國(guó)宮頸癌每年新發(fā)病例11.93萬(wàn)，死亡病例3.72萬(wàn)［1］。高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及宮頸癌的主要因素［2］。目前HPV檢測(cè)是我國(guó)宮頸癌篩查的主要方法，但其存在敏感度高而特異度不足的問(wèn)題［3］，易導(dǎo)致過(guò)度的陰道鏡檢查及不必要的有創(chuàng)檢查。因此，探索精細(xì)化的危險(xiǎn)分層方法是平衡宮頸癌篩查中風(fēng)險(xiǎn)和獲益的新目標(biāo)。表觀遺傳學(xué)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其主要通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)等方式改變基因功能和表達(dá)水平，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展［4］。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化，導(dǎo)致抑癌基因功能失活和轉(zhuǎn)錄抑制，從而促進(jìn)宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。SOX1基因是Y染色體性別決定區(qū)相關(guān)基因家族成員，參與胚胎發(fā)育和凋亡過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子的編碼，SOX1基因甲基化水平在宮頸癌組織中顯著上調(diào)［6］。PAX1基因?qū)儆谂鋵?duì)盒基因家族，編碼重要的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞譜系特異性調(diào)節(jié)劑，研究顯示PAX1基因甲基化異常與宮頸癌發(fā)生相關(guān)［7］。因此，本研究通過(guò)比較HPV聯(lián)合宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（thin-prep cytologic test，TCT）和SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流對(duì)宮頸高級(jí)別病變的檢出效能，旨在探討SOX1和PAX1基因甲基化檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別病變的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

2020年5至12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)、HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性且自愿接受陰道鏡活檢的患者。排除妊娠或可疑妊娠、急性生殖道感染及子宮或子宮頸手術(shù)者。共納入122例患者，采集宮頸脫落細(xì)胞同時(shí)行SOX1和PAX1基因甲基化檢測(cè)。本研究通過(guò)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批編號(hào)：LLSBPJ-2023）。

1.2 宮頸脫落細(xì)胞采集

取樣前72 h禁盆浴及性生活，無(wú)陰道沖洗及用藥，非月經(jīng)期。取樣時(shí)擦拭宮頸表面過(guò)多分泌物，將宮頸細(xì)胞刷置于宮頸表面及部分宮頸管內(nèi)，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈，將采集的宮頸脫落細(xì)胞保存至細(xì)胞保存液中。

1.3 HPV DNA檢測(cè)

采用潮州凱普生物化學(xué)有限公司HPV分型檢測(cè)試劑盒（PCR＋膜雜交法）在HybriMax雜交儀上進(jìn)行分型檢測(cè)，包括HPV 16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、68、CP8304和81型。

1.4 TCT檢測(cè)

采用自動(dòng)液基細(xì)胞沉降式制片染色系統(tǒng)（廣東安必平醫(yī)藥科技股份有限公司）進(jìn)行制片，由細(xì)胞學(xué)病理診斷醫(yī)師按照2014年美國(guó)陰道鏡和子宮頸病理協(xié)會(huì)分類系統(tǒng)［8］進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5 SOX1和PAX1基因甲基化檢測(cè)

對(duì)待測(cè)樣本及空白對(duì)照進(jìn)行DNA提取，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣本DNA提取液的濃度與純度。將合格的樣本DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾，按照SOX1和PAX1基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┱f(shuō)明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃變性20 s，60 ℃變性30 s，共45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SOX1和PAX1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 陰道鏡檢查及宮頸組織學(xué)判讀

對(duì)所有患者行陰道鏡檢查，于可疑病變處取宮頸活檢，必要時(shí)行宮頸管搔刮。宮頸組織病理結(jié)果由兩名病理科醫(yī)生共同判讀，根據(jù)CIN的評(píng)估結(jié)果判斷宮頸病變的級(jí)別。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線描繪SOX1/PAX1基因檢測(cè)CIN 2級(jí)及以上（CIN2+）的診斷效能及截?cái)嘀?，并?jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV分型及TCT檢測(cè)結(jié)果

122例患者中HPV 16/18陽(yáng)性66例，其中TCT異常30例，TCT正常36例；HPV其他型陽(yáng)性56例，其中TCT異常35例，TCT正常21例。

2.2 HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)對(duì)CIN2+的檢出能力

宮頸活檢病理結(jié)果正常58例，CIN1 22例，CIN2 25例，CIN3 10例，宮頸癌7例。HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)對(duì)CIN2+檢出靈敏度為95.24%，特異度23.75%，符合率48.36%，約登指數(shù)0.19。

2.3 SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流對(duì)CIN2+的檢出能力

122例患者中SOX1基因甲基化檢測(cè)陽(yáng)性37例、陰性85例，PAX1基因甲基化檢測(cè)陽(yáng)性52例、陰性70例。HPV16/18陽(yáng)性及HPV其他型陽(yáng)性且TCT結(jié)果異常的101例患者中，SOX1/PAX1基因陽(yáng)性47例，SOX1且PAX1基因陰性54例。21例HPV其他型陽(yáng)性且TCT正常患者中，SOX1/PAX1基因陽(yáng)性6例，SOX1且PAX1基因陰性15例。SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流對(duì)CIN2+檢出的靈敏度為83.33%，特異度77.50%，符合率79.51%，約登指數(shù)0.61（表1）。

2.4 HPV聯(lián)合TCT并結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流對(duì)CIN2+的檢出能力

HPV聯(lián)合TCT并結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后對(duì)CIN2+檢出的靈敏度為83.33%，與HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.11 P=0.078）。HPV聯(lián)合TCT并結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后對(duì)CIN2+檢出的特異度為77.50%，明顯高于HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)（χ2=46.232，P＜0.001）。

2.5 SOX1/PAX1基因在正常宮頸組織及不同級(jí)別宮頸病變中的甲基化水平

正常宮頸組織、CIN1和CIN2+組中SOX1或PAX1基因甲基化的比例分別為20.69%（12/58）、27.27%（6/22）和83.33%（35/42），正常宮頸組織與CIN1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.557），而CIN1與CIN2+組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

在正常宮頸組織及不同級(jí)別宮頸病變中，SOX1基因甲基化水平隨著病變程度加重而逐漸升高，且正常組織與CIN1組（P=0.181）、CIN1與CIN2組（P=0.258）、CIN3與宮頸癌組（P=0.475）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CIN2與CIN3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）；PAX1基因甲基化水平隨著病變程度加重而逐漸升高，且正常組織與CIN1組（P=0.838）、CIN3與宮頸癌組（P=0.230）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CIN1與CIN2組（P=0.003）、CIN2與CIN3組（P=0.013）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

2.6 SOX1和PAX1基因甲基化對(duì)CIN2+的診斷效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，SOX1基因甲基化診斷CIN2+的AUC為0.76 當(dāng)截?cái)嘀禐?11.81時(shí)，靈敏度為87.3%，特異度為58.1%；PAX1基因甲基化診斷CIN2+的AUC為0.840，當(dāng)截?cái)嘀禐?11.98時(shí)，靈敏度為78.5%，特異度為81.4%（圖2）。

3 討論

宮頸癌是目前唯一病因明確的癌癥，早期發(fā)現(xiàn)宮頸高級(jí)別病變是預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵［9］?，F(xiàn)有篩查手段主要包括宮頸脫落細(xì)胞檢查及高危型HPV檢測(cè)。然而，宮頸脫落細(xì)胞檢查易受主觀因素影響，敏感度較差［10］。高危型HPV DNA檢測(cè)靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)篩查，但由于存在HPV一過(guò)性感染，其特異度較低，增加受檢者的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)［3］。因此，尋找高敏感度和特異度的篩查手段是宮頸癌診治工作的重要方向。

惡性腫瘤的發(fā)生通常是一個(gè)涉及遺傳和表觀遺傳改變的多步驟過(guò)程，最新研究發(fā)現(xiàn)，某些特定基因的表觀遺傳變化可能介導(dǎo)或預(yù)測(cè)癌癥進(jìn)展［11］。甲基化作為表觀遺傳學(xué)中重要的一種方式，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［12］。PAX1是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移，參與胚胎發(fā)育過(guò)程中重要器官的形成［13］。SOX1是編碼SOX家族轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)成員，具有參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)以及決定細(xì)胞存亡的功能。研究表明，SOX1和PAX1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化普遍存在于宮頸癌組織中，且明顯高于正常組織，被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生的早期事件［14-15］。本研究中，HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)對(duì)CIN2+病變檢出的靈敏度高，但特異度低，與Wei等［16］研究結(jié)果一致。結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后，CIN2+病變檢出的特異度明顯提高，達(dá)到77.50%。因此，對(duì)于HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后，CIN2+檢出的靈敏度和特異度均較高，解決了傳統(tǒng)HPV聯(lián)合TCT進(jìn)行宮頸癌篩查特異度較低的問(wèn)題，對(duì)宮頸癌篩查策略的優(yōu)化具有重要意義。

符合率是指診斷試驗(yàn)中真陽(yáng)性和真陰性之和占總受檢人數(shù)的比例，反映了正確診斷患者與排除非患者的能力。本研究傳統(tǒng)HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)CIN2+符合率為48.36%，結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后，CIN2+符合率提升至79.51%，表明結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)對(duì)于CIN2+的診斷和CIN1及一過(guò)性HPV感染的排除能力均提高。同時(shí)，HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)對(duì)CIN2+檢出的約登指數(shù)為0.19，結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后CIN2+篩查結(jié)果約登指數(shù)為0.6 結(jié)合SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)二次分流后對(duì)CIN2+檢出準(zhǔn)確度得到明顯提高。

本研究對(duì)SOX1/PAX1基因甲基化定量檢測(cè)與宮頸病變程度之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CIN2+組SOX1/PAX1基因甲基化水平高于正常宮頸組織及CIN1組。諶媛媛等［17］研究也證實(shí)宮頸脫落細(xì)胞中PAX1和SOX1基因甲基化水平對(duì)宮頸癌具有較高的診斷價(jià)值。此外，PAX1基因甲基化水平在正常宮頸組織、CIN1和CIN2+的變化趨勢(shì)與Li等［18-19］的研究結(jié)果一致。

綜上，本研究結(jié)果表明，采用SOX1/PAX1基因甲基化檢測(cè)進(jìn)行二次分流可顯著提高CIN2+檢出的效率和準(zhǔn)確性，這對(duì)于宮頸癌篩查策略的優(yōu)化具有重要意義。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 郭艷平：研究設(shè)計(jì)、論文撰寫與修改、數(shù)據(jù)分析、按編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修；楊青：數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分析、按編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修；王詩(shī)睿、李思敏、于博陽(yáng)：數(shù)據(jù)分析，按編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行論文核修；楊筱鳳：主導(dǎo)研究工作、提供基金支持、指導(dǎo)學(xué)術(shù)問(wèn)題解答

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-06-19）