汪宏才 商雨 馬瑤 曾哲 張蓉蓉 姚倫 羅玲 李麗 溫國元 羅青平

摘要：為了建立水禽細(xì)小病毒（WPV）快速檢測方法，根據(jù)序列比對結(jié)果在水禽細(xì)小病毒NS基因SF3保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物，建立SYBR Green I熒光定量PCR通用檢測方法。該方法的擴(kuò)增效率（E）為90.0%，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.607x+38.77；除WPV出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線外，新城疫病毒（NDV）、H9亞型禽流感病毒（H9 AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨肝炎病毒（DHAV）、鴨腸炎病毒（DEV）、鴨呼腸孤病毒（DRV）樣品均未出現(xiàn)S形陽性擴(kuò)增曲線；批內(nèi)變異系數(shù)（CV）為0.15%～0.23%，批間變異系數(shù)為0.09%～0.28%。結(jié)果表明，SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法重復(fù)性好、靈敏度高和特異性強(qiáng)。臨床樣品檢測結(jié)果表明，SYBR Green I熒光定量PCR與普通PCR的符合率達(dá)98.4%，靈敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法不僅能定性檢測WPV，還可以進(jìn)行定量檢測，可用于種鴨場、種鵝場的WPV凈化檢測，也可用于WPV臨床大量樣品的快速檢測。

關(guān)鍵詞：水禽細(xì)小病毒；檢測方法；SYBR Green I；熒光定量PCR

中圖分類號：S855.3? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）06-0218-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.036 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Establishment and application of a SYBR Green I fluorescence quantitative PCR detection method for waterfowl parvoviruses

WANG Hong-cai1，2，SHANG Yu1，2，MA Yao1a，ZENG Zhe1，2，ZHANG Rong-rong1，2，YAO Lun1，2，

LUO Ling1，2，Li Li1a，WEN Guo-yuan1，2，LUO Qing-ping1，2

（1a.Institute of Animal Husbandry and Veterinary； 1b. Key Laboratory of Animal Bacterial Disease Prevention and Control Formulations of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs； 1c.Hubei Key Laboratory of Pathogenic Microbiology of Livestock and Poultry， Hubei Academy of Agricultural Sciences ，Wuhan 430064， China； 2. Hubei Hongshan Laboratory，Wuhan 430070， China）

Abstract： In order to establish a rapid detection method for waterfowl parvoviruses （WPV）， specific primers were designed within the conserved SF3 region of the NS gene of waterfowl parvoviruses based on sequence alignment results， and a SYBR Green I fluorescence quantitative PCR universal detection method was established. The amplification efficiency （E） of this method was 90.0%， the correlation coefficient （R2） was 0.99， and the standard curve equation was y=-3.607x+38.77；except for WPV with an S-shaped amplification curve， the newcastle disease virus （NDV）， H9 subtype avian influenza virus （H9 AIV）， duck tembusu virus （DTMUV）， duck hepatitis A virus （DHAV）， duck enteritis virus （DEV）， and duck reovirus （DRV） samples did not show an S-shaped positive amplification curve；the coefficient of variation （CV） within a batch was 0.15% to 0.23%， and the coefficient of variation between batches was 0.09% to 0.28%. The results indicated that the SYBR Green I fluorescence quantitative PCR detection method had good repeatability， high sensitivity， and strong specificity. The clinical sample testing results showed that the coincidence rate between SYBR Green I fluorescence quantitative PCR and conventional PCR was 98.4%， and the sensitivity was 1 000 times higher than that of conventional PCR. The SYBR Green I fluorescence quantitative PCR detection method could not only qualitatively detect WPV， but also quantitatively detect it. It could be used for WPV purification detection in duck and goose breeding farms， as well as for rapid detection of WPV in large clinical samples.

Key words： waterfowl parvoviruses； detection method； SYBR Green I； fluorescence quantitative PCR

水禽細(xì)小病毒（Waterfowl parvoviruses，WPV）屬于雁形目依賴細(xì)小病毒1型（Anseriform dependoparvovirus 1）［1］，包括鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus， GPV）、番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）和鴨細(xì)小病毒（Duck parvovirus，DPV），三者在病毒形態(tài)、培養(yǎng)特性、理化性質(zhì)及基因組結(jié)構(gòu)等方面具有相似性，但致病性和抗原性卻存在很大差異［2］。GPV主要引起雛鵝和番鴨發(fā)病，MDPV僅引起番鴨發(fā)病，而對鵝、鴨等不致病，DPV是GPV變異株，主要引起鴨發(fā)生短喙侏儒綜合征（Short beak and dwarfism， SBDS）。WPV具有二十面體結(jié)構(gòu)，無包膜，基因組為線性單鏈DNA，大小為4～6 kb［3］?；蚪M包含2個主要的開放閱讀框，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-structural protein， NS）和結(jié)構(gòu)蛋白（Viral structural protein， VP）。最大的NS蛋白是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，含有高度保守的解旋酶超家族3（Superfamily 3， SF3）結(jié)構(gòu)域，具有解旋酶和ATP酶活性［4］。

為了準(zhǔn)確快速診斷水禽細(xì)小病毒，國內(nèi)外學(xué)者建立了多種檢測方法。早期建立的抗原抗體檢測方法主要有乳膠凝集法（Latex particle agglutination test， LPA）［5］、間接免疫熒光法（Immunofluorescence assay， IFA）［6］、ELISA法［7，8］等。而分子生物學(xué)檢測方法由于快捷方便、敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，常用于病原的快速檢測，主要包含常規(guī)PCR方法、不同血清型鑒別診斷PCR方法［9，10］、基于VP3基因的熒光定量PCR檢測方法［11-13］等。

由于水禽細(xì)小病毒的基因具有變異快、易重組等特點(diǎn)，因此在診斷時很容易漏檢或造成假陰性。在缺少通用、快速檢測水禽細(xì)小病毒方法的情況下，建立一種通用型細(xì)小病毒SYBR Green I 熒光定量快速檢測方法，為水禽細(xì)小病毒進(jìn)一步鑒定和分型提供初步診斷。該方法不僅特異性高、敏感性強(qiáng)，而且操作簡便、成本低廉。因此對臨床上水禽細(xì)小病毒的快速診斷具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、H9亞型禽流感病毒（H9 subtype avian influenza virus， H9 AIV）、鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus， DTMUV）、鴨肝炎病毒（Duck hepatitis A virus， DHAV）、鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus， DEV）、鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus， DRV）和水禽細(xì)小病毒（WPV）均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離保存。AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit試劑盒購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；Plasmid Mini Kit I試劑盒、Gel Extraction Kit試劑盒購自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；pMD18-T載體、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×Rapid Taq Master Mix、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器 SimpliAmp PCR儀為Thermo Fisher公司產(chǎn)品，Light Cycler 96實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)為Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上公開的WPV基因組序列，通過序列多重比對，在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，用于熒光定量PCR試驗(yàn)。

1.2.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備 按照試劑盒說明書提取DNA，并以GPV DNA為模板，使用“1.2.1”中設(shè)計(jì)的引物，通過2×Rapid Taq Master Mix進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系（50.0 μL）：Rapid Taq Master Mix 25.0 μL，F(xiàn)orward Primer 2.0 μL，Reverse Primer 2.0 μL，DNA 4.0 μL，ddH2O 17.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切取目的片段，回收純化后克隆至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。測序正確后提取陽性質(zhì)粒pMD18-NS作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，檢測其濃度并計(jì)算陽性標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.2.3 熒光定量反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將重組質(zhì)粒pMD18-NS按10倍梯度進(jìn)行稀釋。SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)充至20.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。熔解曲線反應(yīng)：65 ℃到95 ℃，每個循環(huán)溫度增加0.5 ℃，孵育時間保持20 s。

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 將陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取10-3、10-5、10-7 3個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為生物學(xué)重復(fù)，用建立的SYBR Green I熒光定量檢測方法進(jìn)行檢測。同時每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。根據(jù)Ct計(jì)算批內(nèi)（技術(shù)重復(fù)）和批間（生物學(xué)重復(fù)）的變異系數(shù)，檢驗(yàn)建立方法的重復(fù)性。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 提取NDV、H9 AIV、DTMUV、DHAV、DEV、DRV和WPV的DNA/RNA后，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用本試驗(yàn)建立的熒光定量檢測方法，對上述病毒cDNA進(jìn)行檢測，驗(yàn)證建立方法的特異性。

1.2.6 靈敏度檢測 將陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，按“1.2.3”中反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)，并設(shè)立陰性對照。儀器的最低檢測量即為該方法的靈敏度。

1.2.7 通用性檢測 提取GPV、MDPV和DPV 3種病毒的DNA，使用建立的檢測方法進(jìn)行通用性驗(yàn)證。

1.2.8 臨床樣品的檢測 為了驗(yàn)證建立的熒光定量檢測方法與常規(guī)PCR檢測方法的符合率，使用新建的熒光定量PCR方法對實(shí)驗(yàn)室保存的湖北省、安徽省、湖南省等地區(qū)送檢的128份疑似水禽細(xì)小病毒感染發(fā)病的臨床樣品進(jìn)行檢測，同時使用普通PCR進(jìn)行對比驗(yàn)證，計(jì)算2種檢測方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公開的GPV、DPV、MDPV基因組序列，下載386條完整的WPV核苷酸序列，使用Muscle［14］軟件進(jìn)行多重比對，選擇非結(jié)構(gòu)蛋白NS解旋酶（SF3）基因附近保守區(qū)域（圖1），使用Primer Premier 5軟件，設(shè)計(jì)了一組熒光定量PCR特異性擴(kuò)增引物，F(xiàn)orward Primer：5′-TACAATGGAACACAGAATWCC-3′，Reverse Primer：5′-TCAGACACAACAGGAACWA-3′，擴(kuò)增片段大小為150 bp。

2.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備

采用“2.1”中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，目的條帶大小為150 bp，與預(yù)期大小相同（圖2）。將目的片段回收純化，連接到pMD18-T載體上，得到重組質(zhì)粒pMD18-NS，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)測序鑒定正確后，提取質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)測定質(zhì)粒濃度為298.9 ng/μL，拷貝數(shù)為9.59×1010 copies/μL。

2.3 熒光定量反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMD18-NS，按10倍梯度進(jìn)行稀釋。選取10-7～10-3共5個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個稀釋度設(shè)3個樣品重復(fù)，按照“1.2.3”的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增正常（圖3），標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。結(jié)果顯示，本方法擴(kuò)增效率（E）為90.0%，R2=0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-3.607x+38.77。熔解曲線（圖5）顯示，在79.00 ℃有單一峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

由表1可知，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）在0.15%～0.23%。通過3個生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)測定批間變異系數(shù)，為0.09%～0.28%。建立的熒光定量PCR檢測方法，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于0.30%，表明SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。

2.5 特異性試驗(yàn)

用建立的SYBR Green I熒光定量檢測方法對實(shí)驗(yàn)室保存的NDV、H9 AIV、DTMUV、DHAV、DEV、DRV和WPV進(jìn)行檢測，除WPV出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線、結(jié)果呈陽性外，其他樣品均未出現(xiàn)S形陽性擴(kuò)增曲線，結(jié)果呈陰性（圖6）。

2.6 靈敏度檢測

由圖7可知，當(dāng)樣品稀釋度為10-6時可以看到PCR條帶，當(dāng)樣品稀釋度為10-7時無肉眼可見的條帶出現(xiàn)。而建立的熒光定量PCR方法，當(dāng)樣品稀釋至10-9時，對應(yīng)的質(zhì)?？截悢?shù)為95.9 copies/μL，仍出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，而陰性對照無擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法靈敏度較高，靈敏度是普通PCR的1 000倍。

2.7 通用性驗(yàn)證

提取實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的3種水禽細(xì)小病毒GPV、MDPV和DPV的DNA后，采用“1.2.3”中反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，驗(yàn)證該方法對WPV的通用性，結(jié)果如圖8所示。GPV、MDPV和DPV都出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對照無擴(kuò)增。

2.8 臨床樣品的檢測

采用SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法對湖北省、安徽省、湖南省等地區(qū)送檢的蛋鴨、番鴨、鵝128份臨床樣品進(jìn)行檢測，同時使用普通PCR進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算2種檢測方法的符合率。由表2可知，SYBR Green I熒光定量PCR與普通PCR的符合率達(dá)98.4%。

3 討論

近年來，水禽生產(chǎn)上細(xì)小病毒的發(fā)病率一直居高不下，病毒在環(huán)境中受到自然選擇壓力的作用，產(chǎn)生基因突變或重組，并能突破種間屏障實(shí)現(xiàn)跳躍式進(jìn)化，造成新的基因型不斷出現(xiàn)?；蛑亟M是病毒遺傳變異和進(jìn)化的主要手段，尤其是細(xì)小病毒VP基因，極易發(fā)生重組。GPV DY16株可能由匈牙利的B株和國內(nèi)弱毒疫苗SYG61v株參與的重組毒株，重組區(qū)域主要發(fā)生在VP1基因內(nèi)部［15］，MDPV JH10株為經(jīng)典型MDPV和GPV之間的重組產(chǎn)物，主要在VP3基因中通過重組獲得不同來源的GPV序列［16］。MDPV NY18株是多個病毒之間重組的產(chǎn)物，以典型MDPV YY株為主要親本，經(jīng)典型GPV強(qiáng)毒株DY16株和鵝胚化的弱毒疫苗株SYG61v株作為次要親本參與了重組，重組區(qū)域主要發(fā)生在VP1和VP3區(qū)域［17］。

早期研究發(fā)現(xiàn)VP3蛋白是細(xì)小病毒的主要抗原蛋白，含量約占整個病毒粒子的80%［18］，因此常將VP3基因的同源性作為細(xì)小病毒分類的主要依據(jù)。很多學(xué)者在VP3區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP快速檢測方法［19，20］、多聯(lián)PCR檢測方法［21］等。早期也有學(xué)者［22］針對WPV在鵝和番鴨中傳播，在ITR區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，建立了探針法熒光定量PCR檢測方法。VP3基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白，易突變和重組；ITR區(qū)域?yàn)楦逩C區(qū)域，易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。NS基因相對保守，更具有種屬特征，尤其是SF3基因序列更具有保守性，因此，在NS基因上設(shè)計(jì)檢測引物，檢測水禽細(xì)小病毒。

本研究根據(jù)NS基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，與普通PCR的符合率達(dá)98.4%，靈敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法不僅能定性檢測WPV，還可以進(jìn)行定量檢測，可用于種鴨場、種鵝場的WPV凈化檢測，也可用于WPV臨床快速診斷。同時，由于SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法具有精準(zhǔn)、快速的特點(diǎn)，因此更適用于臨床大量樣品的快速檢測。

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