張怡洋 劉陽 阮迪 張璐 劉光琇 陳拓 張威 薛林貴 章高森

摘要：為了解新疆艾丁湖地區(qū)中可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌的多樣性及抗輻射相關(guān)特征，以去除鹽組分的R2A為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在NaCl濃度為50～300 g/L范圍內(nèi)對(duì)艾丁湖地區(qū)湖邊灘涂沉積物和湖周鹽堿地中可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌進(jìn)行分離。結(jié)果表明，經(jīng)16S rRNA序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，共得到80株好氧嗜鹽細(xì)菌。湖周鹽堿地的可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌數(shù)量顯著高于湖邊灘涂沉積物，物種豐富度也顯著高于湖邊灘涂沉積物；其中，中度嗜鹽菌不僅數(shù)量多且多樣性豐富。分離所得的好氧嗜鹽細(xì)菌隸屬于厚壁菌門、放線菌門和變形菌門的22個(gè)屬；其中，厚壁菌門（70.00%）是優(yōu)勢菌門，Bacillus（45.00%）是優(yōu)勢菌屬。此外，還分離得到19株高度嗜鹽的潛在新種。分離所得的80株可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌中有34株在100 J/m2的UVC輻照后存活率（SR）大于10%，屬于Bacillus的嗜鹽-抗輻射細(xì)菌占25.00%；分離自100 g/L NaCl的Streptomyces sp. ALP-8和Streptomyces sp. ASS-29的抗輻射能力最強(qiáng)，SR分別為67.23%和65.73%；極端嗜鹽細(xì)菌Staphylococcus sp. ASS-5（分離自300 g/L NaCl）、Sediminibacillus sp. ALP-17（分離自250 g/L NaCl）和Kocuria sp. ASS-27（分離自250 g/L NaCl）的SR也在50%以上。

關(guān)鍵詞：可培養(yǎng)細(xì)菌；嗜鹽細(xì)菌；多樣性；抗輻射；艾丁湖

中圖分類號(hào)：Q939.9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）06-0044-09

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.007 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The preliminary study of the diversity and radiation-resistant characteristics of culturable aerobic halophilic bacteria in the Aiding Lake

ZHANG Yi-yang1，2，3， LIU Yang2，4，5， RUAN Di2，6， ZHANG Lu2，3，5， LIU Guang-xiu2，3，

CHEN Tuo2，4，5， ZHANG Wei2，3， XUE Lin-gui1，2， ZHANG Gao-sen 2，3

（1.School of Biological and Pharmaceutical Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou? 730070， China； 2.Gansu Key Laboratory of Extreme Environmental Microbial Resources and Engineering， Lanzhou? 730000， China； 3. Northwest Institute of Eco-Environment and Resources/Key Laboratory of Desert and Desertification，Chinese Academy of Sciences， Lanzhou? 730000， China； 4.Northwest Institute of Eco-Environment and Resources/State Key Laboratory of Cryospheric Science，Chinese Academy of Sciences， Lanzhou? 730000， China； 5.University of Chinese Academy of Sciences， Beijing? 100049， China； 6.College of Geography and Environmental Science， Northwest Normal University， Lanzhou? 730070， China）

Abstract：In order to reveal the diversity and radiation-resistant related characteristics of the culturable aerobic halophilic bacteria in Aiding Lake of Xinjiang， R2A with the salt fraction removed was used as the basal medium to isolate aerobic halophilic bacteria in the mudflat sediment and saline land around the Aiding Lake area in the range of 50～300 g/L NaCl concentration. The results showed that 80 strains of aerobic halophilic bacteria were obtained by 16S rRNA sequence and phylogenetic analysis. The number of culturable aerobic halophilic bacteria and the species richness in the saline land around the lake were significantly higher than those in the mudflat sediment. Among them， moderate halophilic bacteria were not only more abundant but also rich in diversity. The isolated aerobic halophilic bacteria belonged to 22 genera of the phyla Firmicutes， Actinobacteria and Proteobacteria. Among them， the Firmicutes （70.00%） was the dominant phylum and the Bacillus （45.00%） was the dominant genus. In addition， 19 potential new species with high salinity were isolated. 34 strains from the isolated 80 aerobic halophilic bacteria had a survival rate （SR） of more than 10% after UVC irradiation at 100 J/m2， and 25.00% of the halophilic radiation-resistant bacteria were Bacillus. Streptomyces sp. ALP-8 and Streptomyces sp. ASS-29 isolated from 100 g/L salt concentration were the most radiation-resistant， and SR was 67.23% and 65.73% respectively. The SR of extreme halophilic bacteria Staphylococcus sp. ASS-5（isolated from 300 g/L NaCl）， Sediminibacillus sp. ALP-17 （isolated from 250 g/L NaCl） and Kocuria sp. ASS-27 （isolated from 250 g/L NaCl） was all above 50%.

Key words： culturable bacteria； halophilic bacteria； diversity； radiation-resistant； Aiding Lake

嗜鹽菌是一類在高鹽環(huán)境中生長繁殖的極端微生物，擁有獨(dú)特的生存機(jī)制和多樣的代謝產(chǎn)物［1］。根據(jù)其對(duì)鹽的需求和生長模式分為中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌，中度嗜鹽菌能夠在5%～20%的NaCl下生長，極端嗜鹽菌能夠在20%～30%的NaCl下生長。許多嗜鹽菌可以在很寬的鹽濃度范圍內(nèi)生長，取決于環(huán)境和營養(yǎng)因素的影響［2，3］。嗜鹽菌能夠耐受高鹽濃度的主要原因是其擁有特殊的適應(yīng)性機(jī)制，可以在高鹽環(huán)境中生存和繁殖，這些生存機(jī)制使其在制藥、藥物輸送、農(nóng)業(yè)、鹽廢水處理、可生物降解塑料生產(chǎn)、生物燃料生產(chǎn)等領(lǐng)域都具有一定的應(yīng)用價(jià)值［4-7］。

嗜鹽菌廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，已報(bào)道的嗜鹽菌主要分布于各種高鹽環(huán)境（海水、鹽湖、鹽沼、鹽田、鹽堿地等）［8］。極端嗜鹽菌大多是古菌，Tindall等［9］于1984年從東非索達(dá)湖中分離出了第一株嗜鹽古菌，Zheng等［10］從西藏的鹽堿地中分離出6株極端嗜鹽古菌。中度嗜鹽菌中細(xì)菌占比較大，如Sediminibacillus dalangtanensis分離自鹽湖沉積物［11］，Gracilibacillus salitolerans分離自鹽堿地［12］，Microbulbifer salipaludis分離自鹽沼［13］。中度嗜鹽菌可用于降解工業(yè)殘留污染物或有毒化學(xué)品［14］。極端嗜鹽菌具有產(chǎn)生水解酶如淀粉酶和脂肪酶的能力，在皮革工業(yè)和食品保鮮等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［15］。

艾丁湖位于新疆吐魯番盆地的最低點(diǎn)，海拔低至-153.4 m［16］，屬于典型的大陸性暖溫帶干旱沙漠氣候，降水稀少，蒸發(fā)強(qiáng)烈［17］，是中國西北地區(qū)著名的高鹽湖泊，其湖水含鹽量高達(dá)300～350 g/L，礦化度最高可達(dá)20%，是嗜鹽微生物生長的理想環(huán)境［18］。由于艾丁湖地處高原干旱區(qū)，因此太陽輻射非常強(qiáng)烈，分布其中的嗜鹽菌除了應(yīng)對(duì)高鹽度挑戰(zhàn)外，還存在高度暴露于太陽紫外線輻射的挑戰(zhàn)，艾丁湖及其周邊地區(qū)太陽年輻射量達(dá)5 940～6 120 MJ/m2［19］。研究者們對(duì)艾丁湖微生物的研究主要集中在嗜鹽細(xì)菌多樣性、抗菌活性［20］、苯酚降解特性［21］、纖維素酶活性［22，23］等方面，尚未見關(guān)于艾丁湖地區(qū)嗜鹽-抗輻射細(xì)菌的報(bào)道。本研究在對(duì)新疆艾丁湖的湖邊灘涂沉積物和湖周鹽堿地可培養(yǎng)嗜鹽細(xì)菌分離及多樣性研究的基礎(chǔ)上，對(duì)分離所得的嗜鹽細(xì)菌進(jìn)行抗輻射能力篩選，并研究其抗輻射特征和耐鹽能力之間的聯(lián)系。對(duì)艾丁湖嗜鹽細(xì)菌多樣性和抗輻射特性的研究不僅有助于深入了解高鹽、強(qiáng)輻射環(huán)境下微生物的適應(yīng)機(jī)制，還可以為相關(guān)抗逆領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)和抗逆耦聯(lián)機(jī)制的研究提供重要的科學(xué)依據(jù)和資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品于2022年6月采集自新疆艾丁湖（89°26′E，42°67′N）的湖邊灘涂沉積物（ASS）和湖周鹽堿地（ALP）2個(gè)樣點(diǎn)，分別取表層5～10 cm的湖邊灘涂沉積物和湖周鹽堿土樣品，每個(gè)樣點(diǎn)均采集3份平行樣品，將采集的樣品裝于無菌離心管中，于4 ℃低溫保存，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后保存于-20 ℃環(huán)境下以供后續(xù)菌株分離。

1.2 好氧嗜鹽細(xì)菌分離培養(yǎng)

培養(yǎng)基選擇：以去除鹽組分的R2A瓊脂培養(yǎng)基（R2A，DSMZ No. 830）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制成NaCl濃度為50、100、150、200、250、300 g/L的鹽基培養(yǎng)基，以此培養(yǎng)基作為篩選好氧嗜鹽細(xì)菌的功能培養(yǎng)基。菌株培養(yǎng)分離的主要步驟如下：稱取5 g沉積物或鹽堿土樣品于含有10～20顆無菌小玻璃珠的100 mL錐形瓶中；加入45 mL 9 g/L的無菌生理鹽水；30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min后，取上清梯度稀釋至10-2、10-3、10-4后吸取100 μL菌懸液均勻涂布于不同鹽度的R2A培養(yǎng)基；30 ℃恒溫培養(yǎng)2周左右，記錄菌落生長情況，根據(jù)菌落的形態(tài)特征進(jìn)行純化，將純化的菌株用20%的甘油（V/V）保存在-80 ℃冰箱中，以供后續(xù)試驗(yàn)使用。以上所有培養(yǎng)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行。

1.3 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

分離得到的好氧嗜鹽細(xì)菌DNA使用DNA提取試劑盒（Omega，美國）提??；使用16S rRNA基因序列通用引物（Forward 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；Reverse 1492R：5′-GGTTACCTTGTT? ACGACITT-3′）對(duì)每株可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：1.0 μL通用引物（0.5 μL 27F + 0.5 μL 1492R），12.5 μL Taq DNA聚合酶，10.5 μL去離子水，1.0 μL單菌落DNA。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物由北京擎科生物科技股份有限公司西安分公司完成16S rRNA基因序列的測定，獲得的16S rRNA基因序列在NCBI GenBank保藏獲得可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌的16S rRNA基因序列保藏編號(hào)。利用EZBioCloud在線服務(wù)器（http：//www.ezbiocloud.net）［24］，選取與分離菌株具有較高相似性的16S rRNA作為參比菌株，利用MEGA11.0［25］中的鄰近法［26］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 好氧嗜鹽細(xì)菌的抗UVC能力評(píng)估

以O(shè)D600 nm=1的菌懸液作為試驗(yàn)樣品，將細(xì)菌懸液逐級(jí)稀釋至濃度為10-3、10-4、10-5，各取100 μL均勻涂布于R2A瓊脂平板上，然后放入紫外燈箱進(jìn)行UVC輻照處理，劑量為100 J/m2。以大腸桿菌（Escherichia coli）為陰性對(duì)照，耐輻射奇異球菌（Deinococcus radiodurans）為陽性對(duì)照，設(shè)置3組平行試驗(yàn)。將平板放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14 d后，計(jì)算其存活率（Survival rates， SR），計(jì)算式如下。

SR = [NrN0] （1）

式中，Nr為輻照后菌落個(gè)數(shù)；N0為輻照前菌落個(gè)數(shù)［27］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用CLUSTAL X軟件進(jìn)行16S rRNA基因序列比對(duì)［28］，系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA11.0軟件繪制；其余統(tǒng)計(jì)分析與圖的繪制由SPSS 24.0和Origin 2023b version軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌的分離與類群分析

使用添加50、100、150、200、250、300 g/L NaCl的R2A鹽基培養(yǎng)基進(jìn)行好氧嗜鹽細(xì)菌的分離篩選。對(duì)不同濃度NaCl培養(yǎng)基上可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，ASS和ALP兩個(gè)樣地培養(yǎng)的好氧嗜鹽細(xì)菌數(shù)量隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的增加逐漸減少，具體表現(xiàn)為50 g/L>100 g/L>150 g/L>200 g/L>250 g/L>300 g/L（圖1）。當(dāng)NaCl濃度為50～200 g/L時(shí)（圖1），ALP的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量均顯著大于ASS（P<0.05），但隨著NaCl濃度的升高，ASS可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌的數(shù)量顯著高于ALP（P<0.05）；NaCl濃度為250 g/L和300 g/L時(shí)，ASS的可培養(yǎng)嗜鹽細(xì)菌數(shù)量分別為1.63×104 CFUs/g和0.82×104 CFUs/g，ALP在? ?NaCl濃度為300 g/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上未分離得到菌株。綜上可知，艾丁湖湖邊灘涂沉積物和湖周鹽堿地都是嗜鹽細(xì)菌的良好生態(tài)棲息地；相較于湖周鹽堿地，湖邊灘涂沉積物中分離得到的嗜鹽細(xì)菌對(duì)鹽濃度具有更強(qiáng)的耐受能力。

基于ASS和ALP分離得到的所有嗜鹽細(xì)菌菌株形態(tài)、顏色等特征的不同，用平板劃線法對(duì)不同的菌落進(jìn)行純化，共獲得132株好氧嗜鹽細(xì)菌（表1）。50～300 g/L NaCl分別分離得到48株（36.36%）、37株（28.03%）、29株（21.97%）、11株（8.33%）、5株（3.79%）、2株（1.52%）菌株，根據(jù)16S rRNA基因序列采用EZBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net）對(duì)132株菌株進(jìn)行物種鑒定。類群分析表明，在屬水平上，50 g/L NaCl分離得到的類群最多，共有18個(gè)屬，分別為Bacillus（芽孢桿菌屬）、Citrobacter（檸檬酸桿菌屬）、Mesobacillus、Microbacterium（微桿菌屬）、Neobacillus、Okibacterium、Paenibacillus（類芽孢桿菌屬）、Planococcus（游動(dòng)球菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）、Streptomyces（鏈霉菌屬）、Blastococcus、Metabacillus（副芽孢桿菌屬）、Pseudarthrobacter（類節(jié)桿菌屬）、Pseudochrobactrum（假蒼白桿菌屬）、Rossellomorea、Kocuria（考克氏菌屬）、Nocardiopsis（擬諾卡氏菌屬），其中Paenibacillus的菌株數(shù)量最多。100 g/L NaCl分離得到的類群有14個(gè)屬，分別為Bacillus、Paenibacillus、Planococcus、Pseudomonas、Psychrobacter、Streptomyces、Blastococcus、Metabacillus、Pseudarthrobacter、Pseudochrobactrum、Rossellomorea、Halomonas、Kocuria、Nocardiopsis。150 g/L NaCl分離得到的類群有7個(gè)屬，分別為Bacillus、Planococcus、Metabacillus、Halomonas、Kocuria、Nocardiopsis、Sutcliffiella。200 g/L NaCl分離得到的類群有3個(gè)屬，分別為Bacillus、Kocuria、Sutcliffiella。100、150、200 g/L NaCl分離得到的嗜鹽細(xì)菌中，均為Bacillus的細(xì)菌數(shù)量最多。250 g/L NaCl分離得到的類群有2個(gè)屬，分別為Kocuria、Sediminibacillus（沉積物芽孢桿菌屬）。300 g/L NaCl分離得到的類群只有1個(gè)屬，為Staphylococcus（葡萄球菌屬）。

通過比較分析發(fā)現(xiàn)，Kocuria的菌株能夠生存的鹽濃度范圍較廣，能夠耐受50～250 g/L的NaCl；其次是Bacillus的菌株，能夠耐受50～200 g/L的NaCl；Planococcus和Metabacillus均可在50～150 g/L的NaCl下生長。Halomonas在較低鹽濃度下未分離得到，卻可以耐受100～150 g/L NaCl；同樣，Sutcliffiella菌株在50～100 g/L NaCl下未分離得到，卻能夠在150～200 g/L NaCl下生長。Sediminibacillus和Staphylococcus分別僅在250 g/L和300 g/L NaCl的條件下分離得到（表1）。以上結(jié)果表明，不同鹽濃度所分離菌株的數(shù)量和類群均有不同，能耐高鹽濃度的極端嗜鹽細(xì)菌在數(shù)量和類群上相對(duì)較少，而50、100、150 g/L NaCl分離得到的中度嗜鹽細(xì)菌在屬水平上的物種豐富度較高。此外，高鹽環(huán)境中不同系統(tǒng)發(fā)育水平的可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)不同鹽濃度的耐受能力不同，生長適應(yīng)性也不同。

2.2 可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)ASS和ALP的可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，ALP的可培養(yǎng)數(shù)量（2.62×105 CFUs/g）顯著高于ASS（1.81×105 CFUs/g）（P<0.05，圖2）?；?6S rRNA基因測序結(jié)果，以16S rRNA基因序列相似度100%為相同菌株的標(biāo)準(zhǔn)，去除132株嗜鹽細(xì)菌中的重復(fù)菌株后，最終得到80個(gè)系統(tǒng)發(fā)育型（Genotype），16S rRNA基因序列結(jié)果保藏到NCBI GenBank。采用EZBioCloud進(jìn)行序列比對(duì)后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，80個(gè)系統(tǒng)發(fā)育型分屬于厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。其中，厚壁菌門是優(yōu)勢菌門，占總分離菌株的70.00%，放線菌門次之，占總分離菌株的16.25%，變形菌門僅占總分離菌株的13.75%（圖2）。

圖3為用鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析表明，厚壁菌門分離到的56株好氧嗜鹽細(xì)菌分屬于Bacillus、Paenibacillus、Planococcus、Metabacillus、Sutcliffiella、Mesobacillus、Neobacillus、Rossellomorea、Sediminibacillus和Staphylococcus共10個(gè)屬，Bacillus是其中的優(yōu)勢菌屬。變形菌門的13個(gè)系統(tǒng)發(fā)育型分屬于Kocuria、Streptomyces、Blastococcus、Microbacterium、Nocardiopsis、Okibacterium和Pseudarthrobacter共7個(gè)屬，Kocuria和Streptomyces是其中的優(yōu)勢菌屬。變形菌門包括11株嗜鹽細(xì)菌，分屬于Pseudomonas、Pseudochrobactrum、Psychrobacter、Citrobacter和Halomonas共5個(gè)屬，Pseudomonas是其中的優(yōu)勢菌屬。艾丁湖中可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌的多樣性豐富，是蘊(yùn)藏嗜鹽細(xì)菌的天然優(yōu)質(zhì)菌種資源庫，Bacillus的嗜鹽細(xì)菌最多，占分離菌株的45.00%。

2.3 潛在新型好氧嗜鹽細(xì)菌分析

通過16S rRNA基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)有19株可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌為潛在新種，與其最相似模式菌株的16S rRNA基因序列相似度低于原核生物的物種劃分閾值（98.65%）［29］（圖3）。所有潛在新種在ASS中的數(shù)量明顯高于ALP；ASS發(fā)現(xiàn)潛在新種13株，ALP僅有6株（圖4）。其中，ASS發(fā)現(xiàn)的潛在新種分屬于Bacillus、Halomonas、Nocardiopsis、Paenibacillus、Pseudochrobactrum、Rossellomorea、Staphylococcus和Streptomyces共8個(gè)屬；ALP發(fā)現(xiàn)的潛在新種分屬于4個(gè)屬，分別為Bacillus、Neobacillus、Planococcus、Sutcliffiella。潛在新種的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，Bacillus和Paenibacillus的潛在新種較多；Sutcliffiella和Bacillus的潛在新種對(duì)200 g/L的極端高鹽濃度具有良好的耐受性。綜上，艾丁湖湖邊灘涂和湖周鹽堿地均發(fā)現(xiàn)大量對(duì)高鹽濃度有抗性的潛在新種，是發(fā)掘新型嗜鹽細(xì)菌資源的有利環(huán)境。

2.4 好氧嗜鹽細(xì)菌的抗輻射與耐鹽能力相關(guān)性分析

將分離得到的80株好氧嗜鹽細(xì)菌進(jìn)行輻射強(qiáng)度為100 J/m2的UVC輻照并以其存活率評(píng)估菌株的抗輻射能力。結(jié)果表明，陰性對(duì)照大腸桿菌（Escherichia coli）在輻射強(qiáng)度為100 J/m2 UVC輻照下的SR為0，陽性對(duì)照耐輻射奇異球菌（Deinococcus radiodurans）的SR為67.10%，UVC輻照后SR在10%以上的菌株有34株（圖5）。SR在10%以上的菌株與其分離鹽度的分析結(jié)果表明（圖5），抗輻射能力最強(qiáng)的2株菌分離自含100 g/L NaCl的培養(yǎng)基，分別為Streptomyces sp. ASS-29和Streptomyces sp. ALP-8，在輻射強(qiáng)度為100 J/m2的UVC輻照下SR分別為65.73%和67.23%；其次是菌株Staphylococcus sp. ASS-5、Sediminibacillus sp. ALP-17和Kocuria sp. ASS-27，SR均高于50%，其中Staphylococcus sp. ASS-5分離自300 g/L NaCl，Sediminibacillus sp. ALP-17和Kocuria sp. ASS-27分離自250 g/L NaCl。SR在40%～50%的菌株均分離自200 g/L NaCl。SR在30%～40%的菌株均分離自100～150 g/L的NaCl。SR在20%～30%的菌株，除了Streptomyces sp. ASS-3分離自50 g/L NaCl，SR為22.36%，其余均分離自100 g/L NaCl。SR在10%～20%的菌株均分離自50 g/L NaCl的R2A鹽基培養(yǎng)基上。以上結(jié)果表明，常年受到強(qiáng)太陽輻照的鹽湖艾丁湖分離得到的嗜鹽細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抗輻射能力，強(qiáng)抗輻射能力的菌株大多分離自高鹽濃度的培養(yǎng)基，并且嗜鹽細(xì)菌的抗輻射能力與鹽耐受濃度有關(guān)，與其系統(tǒng)發(fā)育地位也有緊密的聯(lián)系。

3 討論

本研究對(duì)新疆艾丁湖的湖邊灘涂沉積物和湖周鹽堿地的好氧嗜鹽細(xì)菌進(jìn)行分離篩選，使用含有50、100、150、200、250、300 g/L NaCl的R2A鹽基培養(yǎng)基對(duì)其好氧嗜鹽細(xì)菌的多樣性進(jìn)行分析；此外，對(duì)分離出的所有可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌進(jìn)行抗輻射能力篩選，并研究其抗輻射和耐鹽能力之間的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，湖周鹽堿地的可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌數(shù)量顯著高于湖邊灘涂沉積物。不同鹽濃度所分離菌株的數(shù)量和系統(tǒng)發(fā)育型均有不同。隨著培養(yǎng)鹽濃度的增加，好氧嗜鹽細(xì)菌多樣性和數(shù)量顯著降低，極端嗜鹽細(xì)菌的數(shù)量和系統(tǒng)發(fā)育型相對(duì)較少，中度嗜鹽細(xì)菌不僅數(shù)量多且多樣性豐富。在高鹽濃度下（250、300 g/L NaCl），湖周鹽堿地可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌數(shù)量顯著低于湖邊灘涂沉積物，湖周鹽堿地在NaCl濃度為300 g/L的培養(yǎng)基上未分離得到菌株，以上結(jié)果表明湖邊灘涂沉積物中的好氧嗜鹽細(xì)菌具有更強(qiáng)的鹽耐受能力。這可能是因?yàn)闃O端嗜鹽細(xì)菌的生長不僅需要相對(duì)較高的Na+，而且其中大多數(shù)細(xì)菌的生長需要Mg2+等其他鹽基陽離子的參與，而輕度嗜鹽細(xì)菌的生長通常不依賴于Na+以外的其他鹽基陽離子［30，31］。此外，湖邊灘涂和湖周鹽堿地環(huán)境的異質(zhì)性也是影響嗜鹽細(xì)菌生存的關(guān)鍵因素［32，33］。

根據(jù)16S rRNA基因測序比對(duì)結(jié)果，分離得到的好氧嗜鹽細(xì)菌隸屬于厚壁菌門、放線菌門和變形菌門，其中厚壁菌門（70.00%）是優(yōu)勢菌門，這與其他干旱高鹽環(huán)境中的研究結(jié)果相似［34，35］。這可能是因?yàn)楹癖诰T大多為革蘭氏陽性菌，且在干旱的沙漠環(huán)境中也存在大量的厚壁菌門的細(xì)菌，其厚的細(xì)胞壁能夠耐受極強(qiáng)的膜滲透壓變化，高鹽濃度脅迫下能夠進(jìn)行良好的滲透來保護(hù)膜內(nèi)免受滲透脅迫的影響，保證細(xì)胞的正常生命活性［27，36］。此外，厚壁菌門嗜鹽細(xì)菌分泌的獨(dú)特堿性蛋白、促進(jìn)植物生長的次級(jí)代謝產(chǎn)物和獨(dú)特的耐鹽脅迫基因參與的代謝通路也能夠保護(hù)其免受高鹽濃度脅迫［37-39］。其中，Bacillus的嗜鹽細(xì)菌最多，占全部分離菌株的45.00%，表明高鹽堿環(huán)境是Bacillus spp.能夠良好適應(yīng)并生存的生態(tài)位［40］；例如，Bagheri等［41］從伊朗高鹽湖的鹽泥中分離得到中度嗜鹽菌Bacillus iranensis，Chen等［42］從海膽中分離得到中度嗜鹽菌Bacillus hemicentroti，Menes等［43］從馬加迪湖的沉積物中分離得到嗜鹽堿菌Bacillus natronophilus，Lei等［44］從新疆沙車縣的鹽堿土中分離得到中度嗜鹽菌Bacillus shacheensis等。

研究表明，沙漠中強(qiáng)抗輻射能力的菌株以厚壁菌門中的Bacillus為主［45，46］。劉陽等［47］發(fā)現(xiàn)沙漠中抗輻射能力較強(qiáng)的菌株均來自放線菌門。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 J/m2的UVC輻照后存活率在10%以上的菌株有34株（占比為42.50%），Bacillus的細(xì)菌占比最高，達(dá)25.00%，抗輻射能力最強(qiáng)的2株菌分離自含100 g/L NaCl的培養(yǎng)基，分別為Streptomyces sp. ALP-8和Streptomyces sp. ASS-29，均為放線菌門，這與之前的研究相似［27］。分離自300 g/L NaCl的菌株Staphylococcus sp. ASS-5 UVC輻照后存活率為55.61%；分離自250 g/L NaCl的菌株Sediminibacillus sp. ALP-17和Kocuria sp. ASS-27在100 J/m2的UVC輻照后的存活率均在50%以上，分別為54.64%和52.18%。綜上，分離自高鹽濃度的細(xì)菌均具有強(qiáng)的抗輻射能力，說明好氧嗜鹽細(xì)菌的抗輻射能力與其耐鹽能力有一定相關(guān)性。這可能與極端環(huán)境的生境特點(diǎn)有關(guān)，生存在極端環(huán)境的微生物一般都能夠進(jìn)化出多元的抗逆特性，例如Georgiou等［48］認(rèn)為沙漠中大多數(shù)抗輻射細(xì)菌的輻射耐受性與其抗干旱和抗氧化能力相關(guān)；此外也有研究表明干旱、低碳且高鹽的環(huán)境中嗜鹽厚壁菌門的細(xì)菌表現(xiàn)出較豐富的多樣性，干旱和高鹽環(huán)境共同提供了嗜鹽細(xì)菌的優(yōu)勢生態(tài)位［49］。極端環(huán)境的異質(zhì)性或許是驅(qū)動(dòng)抗逆細(xì)菌進(jìn)化出獨(dú)特多元抗逆通路的關(guān)鍵因素［48］。另外，厚壁菌門和放線菌門的嗜鹽-抗輻射細(xì)菌可以形成孢子進(jìn)入保護(hù)性休眠，保護(hù)細(xì)胞免受高鹽和輻照脅迫［49，50］；由于細(xì)胞壁的屏蔽作用，革蘭氏陽性菌中UV誘導(dǎo)的DNA損傷程度低于革蘭氏陰性菌，厚細(xì)胞壁的存在同樣也可以保護(hù)細(xì)胞免受高鹽脅迫［51］。不僅如此，嗜鹽桿菌產(chǎn)生的類胡羅卜素不僅對(duì)紫外線具有良好的吸收作用，也能夠在光催化下保護(hù)細(xì)胞，抵抗鹽脅迫［52］；中度和極端嗜鹽桿菌和球菌中多胺類物質(zhì)（如putrescine、permidine和cadaverine）可以在光效應(yīng)下提高細(xì)胞攝入的高濃度鹽調(diào)節(jié)通道的效率，從而盡可能減少高鹽脅迫對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的損傷［53］；嗜鹽菌對(duì)紫外暴露和高鹽導(dǎo)致的滲透脅迫損傷后強(qiáng)大的修復(fù)系統(tǒng)也是嗜鹽-抗輻射細(xì)菌抗逆能力的體現(xiàn)［54］。

4 小結(jié)

新疆艾丁湖地區(qū)湖周鹽堿地的可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌數(shù)量顯著高于湖邊灘涂沉積物，分別為2.62×105 CFUs/g和1.81×105 CFUs/g?；?6S rRNA基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析得到的80株可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌隸屬于厚壁菌門、放線菌門和變形菌門，其中厚壁菌門（相對(duì)占比70.00%）是優(yōu)勢菌門；屬水平上，分離得到22個(gè)屬，其中Bacillus（相對(duì)占比45.00%）是優(yōu)勢菌屬。在高鹽濃度的培養(yǎng)基中分離得到19株潛在新種，其中Bacillus分離得到的潛在新種最多。此外，分離得到的80株可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌有34株細(xì)菌的D10（存活率大于10%的輻照劑量）大于100 J/m2 UVC 輻照。研究發(fā)現(xiàn)，分離自高鹽濃度培養(yǎng)基的嗜鹽細(xì)菌具有強(qiáng)抗輻射能力，分離自300 g/L NaCl隸屬厚壁菌門的Staphylococcus sp. ASS-5（存活率為 55.61%）以及分離自250 g/L NaCl隸屬厚壁菌門的Sediminibacillus sp. ALP-17（存活率為54.64%）和放線菌門的Kocuria sp. ASS-27（存活率為52.18%）在輻射強(qiáng)度為100 J/m2 UVC輻照下的存活率均在50%以上。

綜上所述，艾丁湖地區(qū)的可培養(yǎng)好氧嗜鹽細(xì)菌多樣性高，并且均具有強(qiáng)的抗輻射能力，說明該研究區(qū)域蘊(yùn)藏著大量嗜鹽-抗輻射細(xì)菌極端微生物資源，為鹽耐受-抗輻射相關(guān)的耦聯(lián)抗逆機(jī)制研究提供了菌株資源，同時(shí)也對(duì)深入研究細(xì)菌在高鹽、強(qiáng)輻射環(huán)境中的適應(yīng)機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

致謝：感謝云南大學(xué)吳明輝博士和青海大學(xué)李娟博士對(duì)此次艾丁湖科考采樣的幫助與支持。

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