谷云霞　王夢琦　張婷　單李銘　劉小莉

摘要：滇龍膽（Gentiana rigescens）是龍膽藥材的基源植物之一，C2H2鋅指蛋白是鋅指蛋白家族中的一個大家族，其成員在1年生滇龍膽轉(zhuǎn)錄中最為豐富，本研究擬在對滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中C2H2基因家族進(jìn)行鑒定并分析響應(yīng)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)表達(dá)模式，為滇龍膽C2H2轉(zhuǎn)錄因子功能研究提供參考?；诘猃埬戅D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用NCBI、MAFFT、MEME、STRING等在線網(wǎng)站及TBtools 軟件對其基因信息、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，從滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出31 個含有C2H2保守結(jié)構(gòu)域的序列（GrC2H2 1～GrC2H2 31），編碼的氨基酸數(shù)量在53（GrC2H2 14）～604個（GrC2H2 31）之間，等電點(diǎn)介于4.23～9.92之間，且31 個家族成員都定位在細(xì)胞核中，其家族分為10 個亞家族，GrC2H2 5、GrC2H2 6、GrC2H2 8、GrC2H2 11、GrC2H2 17、GrC2H2 18、GrC2H2 19、GrC2H2 22、GrC2H2 23 和GrC2H2 31? 共10個轉(zhuǎn)錄因子為滇龍膽C2H2轉(zhuǎn)錄因子的正調(diào)控因子。2種濃度MeJA誘導(dǎo)后C2H2表達(dá)模式顯示，MeJA濃度越高，GrC2H2基因表達(dá)量越高。本研究首次鑒定了滇龍膽C2H2基因家族并分析了其響應(yīng)MeJA表達(dá)模式，可為后續(xù)深入研究C2H2基因家族功能及滇龍膽優(yōu)質(zhì)品種的選育提供理論參考。

關(guān)鍵詞：滇龍膽；生物信息學(xué)；C2H2 轉(zhuǎn)錄因子；基因表達(dá)；茉莉酸甲酯誘導(dǎo)

中圖分類號：S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0051-07

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.）為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，是歷版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的藥材龍膽的基原植物之一，以干燥的根和根莖入藥，具有清熱燥濕、瀉肝膽實(shí)火的功效［1］，是龍膽瀉肝顆粒、瀉肝安神膠囊等多種中成藥的原料［2］。裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)如龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等為滇龍膽的主要活性成分［3］。上述成分的含量直接影響藥材的品質(zhì)及藥用價值，因此通過調(diào)控裂環(huán)烯醚萜生物合成途徑提高滇龍膽藥材品質(zhì)具有現(xiàn)實(shí)意義。

轉(zhuǎn)錄因子是生物體中調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類蛋白質(zhì)，能直接結(jié)合或者間接作用于特定核苷酸序列，激活或抑制目標(biāo)基因表達(dá)，其中C2H2鋅指蛋白屬于TFⅢ轉(zhuǎn)錄因子，是鋅指蛋白家族中的一個大家族［4］。在功能上，既能結(jié)合 DNA 和 RNA，又能與蛋白質(zhì)相互作用，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA 代謝等多種生物學(xué)功能［5］ 。有關(guān)C2H2 型鋅指蛋白在植物代謝調(diào)控方面的研究很少，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtZAT6基因正向調(diào)節(jié)花青素和總黃酮生物合成積累，C2H2轉(zhuǎn)錄因子可能影響佛手檸檬烯等單萜物質(zhì)的釋放量［6-7］ 。滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出2 637個unigene參與編碼66個TF家族，其C2H2轉(zhuǎn)錄因子家族成員最為豐富（199個，占7.5%），其是否與裂環(huán)烯醚萜類成分的積累相關(guān)？這值得深入探討。茉莉酸甲酯（MeJA） 作為一種植物激素，在植物次生代謝過程中起誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)作用，MeJA處理能顯著誘導(dǎo)辣椒 C2H2 鋅指蛋白基因CaZFs，且可能在防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用［8］。這表明MeJA作為逆境信號物質(zhì)可以誘導(dǎo)植物抗逆響應(yīng)，能夠刺激植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，但能否誘導(dǎo)GrC2H2基因表達(dá)、其表達(dá)趨勢如何尚未見報道。本研究對1年生栽培滇龍膽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘出滇龍膽 C2H2 家族基因，與擬南芥（Arabidopsis thaliana） C2H2 家族基因?qū)Ρ辱b定滇龍膽C2H2 家族成員，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討MeJA誘導(dǎo)滇龍膽C2H2轉(zhuǎn)錄因子對裂環(huán)烯醚萜生物合成的調(diào)控作用，以期為后續(xù)解析滇龍膽C2H2 基因家族功能、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和調(diào)控滇龍膽品質(zhì)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料于2022年8月在云南省大理白族自治州永平縣滇龍膽種植基地（99°58′47″E，25°58′47″N，

海拔2 200 m）采集，經(jīng)鑒定為龍膽科滇龍膽草（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl. ），利用Illumina Novaseq 6000 sequencing 轉(zhuǎn)錄組測序平臺對100 mg/L（XZ）、300 mg/L（LZ）MeJA處理的1年生滇龍膽以及空白組（3個生物學(xué)重復(fù)）完成轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 滇龍膽C2H2基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選出滇龍膽C2H2的家族成員基因，將其基因上傳到NCBI上的開放閱讀框（ORF）中 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），獲得全部蛋白質(zhì)序列，并去除結(jié)構(gòu)域過短的蛋白質(zhì)序列。再將得到的滇龍膽C2H2基因家族蛋白序列上傳到NCBI中進(jìn)行Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索，去除非植物的C2H2基因家族的蛋白質(zhì)序列，從而得到滇龍膽C2H2家族的候選基因。然后用ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線工具預(yù)測滇龍膽C2H2鋅指蛋白的分子質(zhì)量、氨基酸大小、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、蛋白質(zhì)疏水性等理化性質(zhì)［9］。利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線預(yù)測滇龍膽 C2H2蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.3 滇龍膽C2H2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用MAFFT 比對 和NJ/UPGMA 系統(tǒng)發(fā)育（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html）在線網(wǎng)站對滇龍膽C2H2家族的氨基酸序列進(jìn)行多比對分析并以擬南芥C2H2基因家族作為參考序列，然后用比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)選擇默認(rèn)值，再將系統(tǒng)發(fā)育樹用iTOL（https：//itol.embl.de/）網(wǎng)站進(jìn)行美化，從而確定滇龍膽C2H2轉(zhuǎn)錄因子的分類。

1.4 滇龍膽C2H2 基因保守結(jié)構(gòu)域和基序分析

運(yùn)用 MEME（http：//meme-suite. org/tools/meme）網(wǎng)站對滇龍膽C2H2家族蛋白做基序分析，識別的基序數(shù)設(shè)置為10，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/cdd/wrpsb.cgi）網(wǎng)站的CD-search分析滇龍膽C2H2基因家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。然后利用TBtools軟件將滇龍膽C2H2基因家族成員的進(jìn)化樹、基序以及保守結(jié)構(gòu)域合并處理并進(jìn)行可視化分析［10］。

1.5 滇龍膽C2H2基因家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

以擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為模式植物，置信度閾值為0.15，利用 STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫（http：//string-db. org/）分析滇龍膽C2H2 蛋白互作模式，分析其基因共表達(dá)情況。

1.6 滇龍膽C2H2蛋白表達(dá)模式分析

以空白（ZK）、100 mg/L（XZ） 、300 mg/L（LZ）MeJA處理的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，依據(jù)FPKM值，用TBtools軟件繪制滇龍膽C2H2基因表達(dá)熱圖并進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇龍膽C2H2基因家族理化性質(zhì)分析

通過NCBI的OFR與Blast數(shù)據(jù)庫的比對與分析，從滇龍膽基因組中共鑒定出31個含有C2H2保守結(jié)構(gòu)域的序列，并將所得序列依次命名為 GrC2H2 1～ GrC2H2 31（表1）。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，31 個GrC2H2基因的編碼氨基酸數(shù)量在53（GrC2H2 14）～ 604個（GrC2H2 31）之間，差異相對較大；相對分子質(zhì)量介于6 014.90（GrC2H2 14）～

67 662.51（GrC2H2 31）u之間；最大理論等電點(diǎn)為 9.92，最小為4.23，平均值為7.73，其中只有GrC2H2 14不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白。除了GrC2H2 14，其他GrC2H2成員的平均親水系數(shù)都為負(fù)值，因此滇龍膽C2H2家族蛋白多數(shù)為不穩(wěn)定的親水蛋白。此外，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，31 個家族成員都定位到細(xì)胞核中，推測滇龍膽C2H2轉(zhuǎn)錄因子可能都在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

2.2 滇龍膽C2H2基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為準(zhǔn)確了解滇龍膽C2H2各基因間的親緣關(guān)系和生物學(xué)聯(lián)系，利用MAFFT 比對和NJ/UPGMA 系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)站將滇龍膽C2H2和擬南芥C2H2的家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），并結(jié)合PlantTFDB擬南芥數(shù)據(jù)庫和 Englbrecht 等的分類方法［11］進(jìn)行分類，結(jié)果顯示，滇龍膽C2H2家族分為10 個亞家族，除了Ⅳ、Ⅹ亞家族中無滇龍膽C2H2家族成員外，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ中分別含有7、9、1、4、2、1、3、4 個滇龍膽C2H2家族成員。通過滇龍膽C2H2型轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥C2H2型轉(zhuǎn)錄因子在系統(tǒng)進(jìn)化上的同源關(guān)系，推測兩者可能在某些生物學(xué)功能上起著相同或相似的作用［10］。

2.3 滇龍膽C2H2基因家族進(jìn)化樹、保守基序與結(jié)構(gòu)域分析

通過TBtools軟件將GrC2H2基因家族成員的進(jìn)化樹、基序以及保守結(jié)構(gòu)域合并處理并進(jìn)行[JP3]可視化分析，結(jié)果（圖2）顯示，有28 個基因中存在motif 1，其次分別有9、7個基因成員中分別存在motif 8和motif 4，而GrC2H2 1、GrC2H2 8、GrC2H2 11、GrC2H2 19、GrC2H2 30、GrC2H2 16、GrC2H2 23、GrC2H2 5、GrC2H2 6和GrC2H2 17只含有motif 1。GrC2H2 25、GrC2H2 24、GrC2H2 22和GrC2H2 12含有相似的保守基序，且以上4個成員在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上同屬Ⅸ亞家族，這可能與其行使某些特定的功能有關(guān)。然后，根據(jù)CDD在線數(shù)據(jù)庫檢測保守功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)有9 個GrC2H2基因含有zf-C2H2_6保守功能結(jié)構(gòu)域，有3 個GrC2H2基因含有zf-C2H2保守功能結(jié)構(gòu)域，有1個GrC2H2基因含有 zf-C2H2_8 保守功能結(jié)構(gòu)域。

2.4 滇龍膽C2H2基因家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫，把擬南芥作為模式植物對GrC2H2基因家族成員進(jìn)行蛋白互作及共表達(dá)預(yù)測分析，結(jié)果（圖3-A）顯示，11個GrC2H2成員之間有互作關(guān)系，其中AT3G46080.1（對應(yīng)的滇龍膽同源蛋白為GrC2H2 11）屬于網(wǎng)絡(luò)中的主要中心節(jié)點(diǎn)，其余10 個擬南芥C2H2蛋白互相之間有著強(qiáng)或弱的相互作用關(guān)系。其中，AT5G03150.1（GrC2H2 20）和AT1G03840.1（GrC2H2 4），以及AT3G46090.1（[JP4]GrC2H2 11）、AT2G37430.1（GrC2H2 8）和AT3G46080.1（

GrC2H2 11）具有較強(qiáng)的相互作用關(guān)系。GrC2H2共表達(dá)結(jié)果（圖3-B）顯示，只有少數(shù)基因間存在共表達(dá)，其中，ZAT 7（GrC2H2 11）的基因共表達(dá)水平明顯高于其他成員。

2.5 滇龍膽C2H2基因家族成員表達(dá)模式分析

為了解GrC2H2在MeJA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式情況，從滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中挑選出 31 個GrC2H2基因家族成員的 FPKM 值，構(gòu)建GrC2H2基因表達(dá)模式的熱圖，結(jié)果（圖4）顯示，不同GrC2H2基因在2個濃度MeJA處理后的表達(dá)量存在差異，表現(xiàn)為LZ組（300 mg/L）>

XZ組（100 mg/L）>ZK組（空白），可見MeJA的濃度影響GrC2H2基因的表達(dá)量，MeJA的濃度越高，GrC2H2基因的表達(dá)量越高。此外，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，GrC2H2 5、GrC2H2 6、GrC2H2 8、GrC2H2 11、GrC2H2 17、GrC2H2 18、GrC2H2 19、GrC2H2 22、GrC2H2 23和GrC2H2 31 共10個轉(zhuǎn)錄因子為GrC2H2基因的正調(diào)控因子。

3 討論

C2H2型轉(zhuǎn)錄因子是鋅指蛋白中的一大類且廣泛存在于真核生物中。據(jù)研究報道，目前已經(jīng)在擬南芥和陸地棉等中分別鑒定到176、386 個C2H2型鋅指蛋白［11-12］。而本研究中通過對滇龍膽草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共鑒定出31 個GrC2H2基因家族成員，且31個GrC2H2蛋白之間理化性質(zhì)差異大。GrC2H2的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GrC2H2定位都在細(xì)胞核中，該定位結(jié)果與煙草、大麻、木薯的預(yù)測結(jié)果［5，10，13］一致，說明GrC2H2可能全部在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

為解析滇龍膽C2H2基因家族的親緣關(guān)系及生物學(xué)聯(lián)系，把擬南芥C2H2基因家族作為模式植物與滇龍膽C2H2基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示滇龍膽C2H2家族分為10 個亞家族，與擬南芥C2H2基因家族［11］和藥用植物大麻C2H2基因家族［10］的分類基本相一致，與木薯C2H2基因家族（6 個亞家族）［13］和煙草 C2H2 基因家族（5? 個亞家族）［5］的分類進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，滇龍膽的分類更多，表明滇龍膽C2H2基因在鋅指蛋白C2H2 基因中分布很廣。

根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)域的不同，鋅指蛋白主要分為C2H2型、C4型和C6型［14］，本研究中有9 個GrC2H2基因?yàn)镃6型，有3 個GrC2H2基因?yàn)镃2H2型。C2H2型鋅指蛋白在調(diào)控植物的非生物脅迫抗性（包括干旱、鹽、低溫與鋁等的脅迫）、生物脅迫抗性和生長發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［15］。本研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，不同亞家族之間差異明顯，亞家族Ⅷ和Ⅸ中含有的motif 4 在其他亞家族都不存在，并且這個結(jié)構(gòu)域與 C2H2 保守結(jié)構(gòu)域緊密相連。研究表明，許多植物激素參與調(diào)控C2H2型鋅指蛋白基因的表達(dá)，龍歐等研究發(fā)現(xiàn)，金蕎麥C2H2-2基因是一個受MeJA誘導(dǎo)的C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，并通過激活蘆丁生物合成關(guān)鍵酶基因FLS、PAL與 F3′5′H 的表達(dá)來促進(jìn)蘆丁的合成積累［16］。推斷GrC2H2基因可能與激素脅迫有關(guān)，參與調(diào)控植物次生代謝物的合成積累。

GrC2H2基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，GrC2H2家族成員在植物生長發(fā)育及生物和非生物脅迫等應(yīng)答過程中聯(lián)系不是特別緊密，只有少部分基因體現(xiàn)出同源性，說明GrC2H2基因各成員之間相互作用關(guān)系較弱。其中，GrC2H2共表達(dá)結(jié)果顯示，ZAT 7（GrC2H2 11）的基因共表達(dá)水平較高。研究表明，擬南芥ZAT 7（AT3G46090）基因?qū)}脅迫的耐受性更強(qiáng)，且在鹽脅迫下主要在根中的表達(dá)有所提高［17］，由此推測滇龍膽C2H2家族中的GrC2H2 11可能與擬南芥ZAT 7具有相似功能。

MeJA作為基因調(diào)控的誘導(dǎo)子，可上調(diào)或下調(diào)許多植物次生代謝物質(zhì)基因的表達(dá)，是調(diào)控植物次生代謝物合成的重要激素［18］。Zheng等研究發(fā)現(xiàn)，AabHLH 1、AaYABBY 5和AaWRKY 17是青蒿素生物合成的受MeJA誘導(dǎo)的正調(diào)控因子［19］。本研究中，滇龍膽C2H2基因家族中經(jīng)MeJA誘導(dǎo)處理后找到10個正調(diào)控因子，且GrC2H2基因在不同濃度MeJA處理后的表達(dá)量存在差異，MeJA的濃度越高GrC2H2基因的表達(dá)量越高，表明GrC2H2是一個受植物激素MeJA誘導(dǎo)的C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。本研究為深入挖掘和研究C2H2基因家族功能及滇龍膽優(yōu)質(zhì)品種的選育奠定了重要基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-05-31

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81660634）；云南省科技廳-云南中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)（編號：202101AG070013）；云南省高校藥用食用花卉科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號：2020YGC01）；科技創(chuàng)新基地建設(shè)項(xiàng)目（編號：202207AB110015）。

作者簡介：谷云霞（1998—），女，云南玉溪人，碩士研究生，主要從事中藥資源開發(fā)與利用研究。E-mail：2075927117@qq.com。

通信作者：劉小莉，博士，副教授，主要從事中藥資源研究。E-mail：kmxunzi@aliyun.com。