楊智敏　張慧豪　張園園　杜紅巖　劉曉東　侯亞光　王毅　徐道龍　黃金貴　程曉寧　隨洋　王瑞利　于超　趙玲玲　陳春梅　雅茹　賈麗　張明月　王宏偉　姚淞耀　趙瑩　邵科

摘要：由甜菜尾孢菌（Cercospora beticola）引起的甜菜褐斑病是一種廣泛發(fā)生、危害嚴(yán)重的真菌性病害，嚴(yán)重制約了我國糖料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為挖掘?qū)μ鸩撕职卟【哂猩缿?yīng)用潛力的拮抗菌株，從內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾黑土地采集甜菜健康植株根際土壤樣本，通過梯度稀釋平板法和對峙培養(yǎng)法進行分離、純化、篩選，獲得1株具有良好拮抗效果的菌株HM85?；谄湫螒B(tài)學(xué)特征和生理生化特征，結(jié)合16S rRNA基因序列分析將菌株HM85鑒定為婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）。平板對峙試驗結(jié)果顯示，菌株HM85對甜菜尾孢菌HB2-2-2菌株的生長有明顯抑制作用，抑菌率為58.68%。盆栽試驗結(jié)果表明，HM85在防治甜菜褐斑病的同時對甜菜植株具有一定的促生作用，株高、株鮮重、根長、根鮮重和根直徑與對照組相比分別增加22.73%、20.47%、36.10%、32.52%和75.03%。由此可見，婁徹氏鏈霉菌HM85具有作為促生菌劑和生防菌劑的研發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞：婁徹氏鏈霉菌；甜菜尾孢菌；甜菜褐斑??；拮抗活性；促生作用

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0144

中圖分類號：S182 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）05014808

食糖被列為國家的重要戰(zhàn)略儲備，對我國經(jīng)濟發(fā)展和人民生活有著非常重要的意義。甜菜（Beta vulgaris L.）作為主要糖料作物之一，其產(chǎn)糖量約占世界年產(chǎn)糖量的25%[1]。甜菜褐斑?。–ercospora leaf spots，CLS）是由甜菜尾孢菌（Cercospora beticola Sacc.）引起的葉部病害，在世界范圍內(nèi)最具破壞性，影響1/3以上的甜菜種植區(qū)[23]。該病在我國東北、華北和西北三大甜菜產(chǎn)區(qū)發(fā)病普遍，每年均有不同程度的發(fā)生，一般可使塊根減產(chǎn)15%～20%，含糖率下降0.8～2.0 個百分點，葉莖損失40%～70%[45]；病情指數(shù)每增加1個單位，根重減少1.3 g，含糖率降低0.046個百分點[6]。

甜菜褐斑病發(fā)病初期葉片呈現(xiàn)褐色或紫色小圓斑，隨后斑點逐漸擴大，直徑達(dá)2～5 mm，斑點周圍呈褐色。后期病斑中央呈現(xiàn)灰白色霉層，即病菌的分生孢子和分生孢子梗。病斑因發(fā)病程度、葉片大小而不同，每片病葉上病斑可達(dá)數(shù)十個至上千個，病斑連片后，葉片干枯死亡。一般褐斑病先侵染外層生理成熟的葉片，逐漸向中層葉片發(fā)展，發(fā)病重的外層、中層葉片陸續(xù)枯死，影響甜菜的光合作用和養(yǎng)分輸送，導(dǎo)致植株生長勢衰弱、甜菜塊根產(chǎn)量下降、含糖量降低、塊根中灰分和有害氮增加、原料產(chǎn)量和質(zhì)量下降[7] 。

在甜菜種植中，除了選用抗病品種、合理輪作外，褐斑病治以化學(xué)防治為主。但化學(xué)殺菌劑的長期不合理使用不僅引起環(huán)境污染、食品藥物殘留、非靶標(biāo)生物毒害等問題，還導(dǎo)致病原菌的選擇壓力和抗藥性增強[8-10]。生物防治是植物病害綜合防治的重要措施，可通過有益微生物及其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)微生態(tài)、直接或間接抑制病原菌生長繁殖等途徑達(dá)到控制病害的目的，具有環(huán)境友好、高效無污染、改善土壤微生態(tài)等優(yōu)點。近年來，利用拮抗菌防治褐斑病的研究越來越被關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）對甜菜褐斑病有抑制作用[7]；青霉對尾孢菌（Cercosporabeticola）有抑制作用，其抑制作用與粘合劑水平有關(guān)[11]；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TL6對花生褐斑病具有較好的防治效果，其發(fā)酵液原液對花生褐斑病防治效果為69.17%[12]。放線菌資源豐富，在土壤中分布廣泛，多數(shù)可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，其中鏈霉菌屬及其相似類菌群是植物病害生物防治中最主要的資源。鏈霉菌是產(chǎn)生抗生素的主要來源，約80%的抗生素應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上。鏈霉菌制成的菌劑已有多種被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如鏈霉素、井崗霉素、農(nóng)抗120、多效霉素、S-921等。放線菌對多種植物病原菌有拮抗作用，如葡萄孢菌、楊樹腐爛病菌、灰霉病菌以及白菜軟腐病菌等[13]。目前，關(guān)于放線菌防治甜菜褐斑病的研究較少，挖掘、篩選和利用拮抗放線菌對甜菜褐斑病進行生物防治具有重要意義。本研究從內(nèi)蒙古呼倫貝爾黑土地采集甜菜健康植株根際土樣，從中分離篩選對甜菜褐斑病病原菌具有拮抗作用的放線菌，旨在為甜菜褐斑病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試甜菜

試驗所用甜菜品種為KWS2314，種子由內(nèi)蒙古敕勒川糖業(yè)有限責(zé)任公司提供。其屬于豐產(chǎn)偏高糖品種，抗病性居于中等水平，為內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)主栽品種之一。

1.1.2 供試土樣

2021年9月，在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾甜菜生產(chǎn)田采集甜菜根際土樣品2份。每份樣本隨機選擇5株健康甜菜植株，小心用鐵鍬將植株挖起，使勁搖晃，除去大顆粒土壤。將附著在根上1～5 mm的土壤用無菌濾紙條充分刮取，裝于無菌自封袋內(nèi)，-80 ℃保藏[14]。

1.1.3 供試病原菌

甜菜褐斑病病原菌甜菜生尾孢（Cercospora beticola）HB2-2-2 菌株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治研究室分離、鑒定和保存。

1.1.4 供試培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基（1 L）：淀粉20.0 g、KNO3 1.0 g、Na2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O0.5 g，NaCl 0.5 g、FeSO4·4H2O 0.01 g、瓊脂18.0 g，121 ℃，1×105 Pa高壓蒸汽滅菌20 min。PDA培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g，瓊脂18.0 g。淀粉水解培養(yǎng)基（1 L）：可溶性淀粉 10.0 g、NaCl0.5 g、MgCO3 1.0 g、K2HPO4 0.3 g、KNO3 1.0 g，pH調(diào)至7.2，瓊脂20 g。明膠液化培養(yǎng)基（1 L）：明膠200.0 g、葡萄糖 20.0 g、蛋白胨5.0 g，pH調(diào)至7.2。牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基（1 L）：脫脂牛奶1 000 g、CaCO3 0.02 g。纖維素水解培養(yǎng)基（1 L）：MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、NaCl 0.5 g、KNO31.0 g，pH調(diào)至7.2。碳源利用培養(yǎng)基（1 L）：（NH4）2SO42.64 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O0.5 g、CuSO4·5H2O 0.006 4 g、 FeSO4·7H2O 0.001 g、MnCl2·4H2O 0.001 g、ZnSO4·7H2O 0.001 g，pH 調(diào)至7.2，瓊脂15 g。氮源利用培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O0.01 g、KH2PO4 0.1 g，pH調(diào)至7.2，瓊脂15.0 g。所需試劑均購自天津市鎧通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 土樣預(yù)處理

采集的土壤樣品室溫自然風(fēng)干2～3 d后，稱取土壤2 g置于裝有18 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，放置在搖床150 r·min-1震蕩2 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株分離

取預(yù)處理土壤懸液1 mL加入9 mL滅菌生理鹽水中，依次進行梯度稀釋。分別吸取200 μL稀釋度10-3和10-4的土壤懸液到分離培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)，用無菌涂布棒均勻涂布，置于生化培養(yǎng)箱（寧波萊?？萍加邢薰荆?8 ℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7 d后，觀察菌落生長情況，用接種環(huán)挑選單菌落至高氏1號培養(yǎng)皿上純化培養(yǎng)，并根據(jù)菌落形態(tài)特征對分離得到的放線菌菌株去重，加入25%（體積分?jǐn)?shù)）甘油在-80 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.2.3 拮抗菌株初篩

以甜菜褐斑病病原菌為靶標(biāo)菌進行拮抗菌株的篩選。用接種針挑取甜菜生尾孢HB2-2-2菌餅（直徑5 mm）置于PDA 平板中央，在其四周 3.0 cm處劃線接種不同放線菌純培養(yǎng)，以單獨接種靶標(biāo)菌為空白對照，在28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)7～10 d后（空白對照菌落直徑長至培養(yǎng)皿約3/4處，但未長滿），拍照并記錄具有拮抗活性的菌株。

1.2.4 拮抗菌株的復(fù)篩

根據(jù)初篩結(jié)果，選擇對靶標(biāo)菌有抑制作用的菌株進行復(fù)篩試驗。以甜菜生尾孢菌為靶標(biāo)菌，在距靶標(biāo)菌（直徑5 mm）3.0 cm 處用接種環(huán)劃線接種初篩中有拮抗活性的菌株，以僅接種靶標(biāo)菌為空白對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。倒置培養(yǎng)7～10 d后，統(tǒng)計菌絲直徑并計算菌絲生長抑制率（公式1），從中挑出抑菌效果最佳的菌株進行下一步研究。

1.2.5 形態(tài)特征觀察

將篩選出的放線菌HM85劃線接種于新鮮的高氏1號培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，拍照并記錄生防菌的菌落形狀、顏色及邊緣形態(tài)等特征。

1.2.6 生理生化特性測定

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]中描述的方法對菌株 HM85的碳源和氮源利用、分解纖維素、明膠液化以及產(chǎn)H2S能力等特性進行測定。

1.2.7 16S rRNA基因序列分析

采用CTAB法[15]提取放線菌基因組DNA，利用引物243F（5'-GGATGAGCCCGCGGCCTA-3'） 和A3R （5'-CCAGCCCCACCTTCGAC-3'）擴增16S rRNA 基因。PCR反應(yīng)體系：2×PCR mix 12.5 μL，243F/A3R引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，無菌水9.5 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，59 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。將擴增得到的PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進行特異性檢測，并送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/）進行BLAST 比對分析。用MEGA7 軟件采用極大似然法（maximum likelihood）重復(fù)1 000次進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.8 拮抗菌株HM85對甜菜促生效果測定

用無菌土種植甜菜種子，在25 ℃、光照強度為600 lx的溫室日夜交替培養(yǎng)30 d（每天黑暗培養(yǎng)8 h，光照培養(yǎng)16 h），在甜菜幼苗第4片葉時，將不同處理的菌液或培養(yǎng)基灌根接種至甜菜根部。處理組A：每株先接種拮抗菌株HM85發(fā)酵液15 mL，待24 h 后接種病原菌甜菜生尾孢HB2-2-2 孢子液15 mL（取甜菜生尾孢在PDA平板上生長的菌餅于PDB培養(yǎng)基中180 r·min-1、28 ℃培養(yǎng)7 d，3層濾紙過濾后用血球計數(shù)板計數(shù)孢子含量，調(diào)整孢子含量為1×106 cell·mL-1）。處理組B：每株同時接種滅菌的高氏1號液體培養(yǎng)基和病原菌甜菜生尾孢HB2-2-2孢子液各15 mL。對照組：每株加入滅150菌的高氏1號液體培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基各15 mL灌根。處理后的甜菜苗在溫室中培養(yǎng)，30 d后調(diào)查統(tǒng)計株高、根長、根直徑、鮮重等生理指標(biāo)。試驗重復(fù)3次，每處理8株甜菜苗。

促生效率=（A-B）/B×100% （2）

式中，A 和B 分別為處理組A和處理組B的株高、鮮重和根長等性狀。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

使用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和整理，GraphPad Prism8.0.2繪制柱狀圖，使用IBM SPASS Statistics 26軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素ANOVA檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

用高氏1號培養(yǎng)基對采集的甜菜根際土樣放線菌進行分離、培養(yǎng)，純化，得到43株放線菌分離物。通過平板對峙法對分離獲得的放線菌株進行篩選，獲得8株對甜菜褐斑病病原菌甜菜生尾孢HB2-2-2具有抑制效果的拮抗菌株，分別為HM13、HM41、HM44、HM47、HM45、HM66、HM74 和HM85（圖1）。

復(fù)篩結(jié)果（圖2和表1）表明，供試的8株放線菌對甜菜褐斑病病原菌菌絲生長的抑菌半徑為（0.71±0.03）～（2.37±0.06）cm，抑菌率為（17.56%±0.70%）～（58.68%±1.60%），其中，菌株HM85對甜菜褐斑病病原菌菌絲生長抑制作用最強，抑菌半徑為（2.37±0.06） cm，抑菌率為（58.68%±1.60%）。因此，選定菌株HM85進行后續(xù)研究。

2.2 菌株HM85 對甜菜的防病促生作用

盆栽實驗結(jié)果（圖3）表明，與空白對照組相比，僅接種甜菜生尾孢菌HB2-2-2孢子液的甜菜植株出現(xiàn)生長勢衰弱、葉片發(fā)黃等癥狀，株高、株鮮重、根鮮重、根直徑分別降低17.27%、9.83%、14.35%和8.02%。而先接種HM85發(fā)酵液再接種HB2-2-2孢子液的甜菜植株長勢良好，同時葉片呈綠色無發(fā)黃癥狀。

如圖4所示，加入生防菌株HM85發(fā)酵液的處理組與僅接種病原菌的甜菜植株相比，根長無顯著性差異，但株高、根鮮重、根直徑及地上部分鮮重等生理指標(biāo)顯著提高，對不同指標(biāo)的促生效率從20.47%～75.03%不等，其中對根直徑的促生效率最為明顯，為75.03%（表2）。表明菌株HM85在防治甜菜褐斑病的同時對植株有一定的促生作用。

2.3 菌株HM85 的分類鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株HM85的形態(tài)學(xué)特征

菌株HM85在高氏1號培養(yǎng)基上的形態(tài)特征如圖5所示，氣生菌絲顏色為牡蠣白，基內(nèi)菌絲顏色為黑色。

2.3.2 菌株HM85的生理生化性質(zhì)分析

從表3可以看出，菌株HM85 能夠利用木糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、水楊苷作為單一碳源生長，不能利用蔗糖、肌醇作為單一碳源生長，能使牛奶凝固與胨化，能使明膠液化，可以產(chǎn)H2S和黑色素，能使淀粉水解，能夠分解纖維素。

2.3.3 菌株HM85 的分子生物學(xué)鑒定

菌株HM85的16S rRNA 基因序列比對結(jié)果（圖6）顯示，菌株HM85與供試鏈霉菌的同源性為99.72%～98.45%。其中，與婁徹氏鏈霉菌S. roche（VITLG012）的同源性最高（99.72 %），說明二者的親緣關(guān)系最近；基于16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹也顯示其與婁徹氏鏈霉菌（S. roche）（VITLG012）聚為同一分支，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性等結(jié)果，將菌株HM85鑒定為婁徹氏鏈霉。

3 討論

甜菜褐斑病的流行嚴(yán)重影響著甜菜塊根產(chǎn)量、含糖率、灰分和有害氮含量，導(dǎo)致原料產(chǎn)量和質(zhì)量下降，影響甜菜糖的加工效率與質(zhì)量。同時，尾孢菌不僅為甜菜褐斑病發(fā)生的主要病原菌，還是大豆、玉米等糧食作物病害發(fā)生的主要病原。已有研究表明，玉蜀尾胞菌（Cercosporazeaemaydis）、大豆尾孢菌（Cercospora sojina）等是引起玉米和大豆灰斑病和褐斑病的重要病原菌[16-18]。因此，本研究結(jié)果在豐富甜菜褐斑病生防優(yōu)質(zhì)菌種資源的同時，為其他植物與糧食作物相關(guān)病害的防治防控研究提供了重要參考。

放線菌是植物病害生物防治的重要微生物資源。其中，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素廣泛應(yīng)用于醫(yī)療與制藥領(lǐng)域，是放線菌門中最為龐大且極富物種多樣性的分支。鏈霉菌經(jīng)過多年來系統(tǒng)深入研究，在系統(tǒng)分類學(xué)、多樣性以及天然產(chǎn)物資源勘探與應(yīng)用等領(lǐng)域都取得了巨大進展。弗氏鏈霉菌（S. fradiae） [19]、黃麻鏈霉菌（S. corchorusii） [20]、毒三素鏈霉菌（S. toxytricini）[21]等被用于作物枯萎病的防治；瘡痂鏈霉菌（S. scabiei）和藤黃灰鏈霉菌（S.luteogriseus）可以防治花生白絹病等[22]。本研究從內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾黑土地甜菜根際土壤分離得到43株可培養(yǎng)放線菌，從中篩選出8株對甜菜褐斑病病原菌具有拮抗作用的菌株，其中，最具生防應(yīng)用潛力的菌株HM85 鑒定為婁徹氏鏈霉菌（S. roche）。

前期研究發(fā)現(xiàn)，婁徹氏鏈霉菌（S. roche）XL-6無菌發(fā)酵液顯著降低茄子青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)[23]；蘋果內(nèi)生婁徹氏鏈霉菌A-m1發(fā)酵濾液對葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、蘋果擬莖點霉（Phomopsis mali）、膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）等病原菌表現(xiàn)出抑菌作用[24]。HM85對峙培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，該菌對甜菜生尾孢菌的生長有較強抑制作用，并且在防褐斑病的同時對甜菜有一定的促生作用。由此可見，婁徹氏鏈霉菌HM85具有良好的研發(fā)和應(yīng)用潛力，圍繞該菌對甜菜褐斑病的生防機理還有待進一步探究。

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（責(zé)任編輯：溫小杰）

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目（2020GG0271）；國家糖料產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-170725）；內(nèi)蒙古自治區(qū)“ 揭榜掛帥”項目（2022JBGS0029）； 內(nèi)蒙古自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化專項資金項目（2021CG0042）。