【摘要】建立高效液相色譜法測定動物可食性組織中氟苯尼考、氟苯尼考胺和甲砜霉素殘留量。試樣經(jīng)過乙腈-乙酸乙酯-氨水（體積比5∶15∶80）混合提取液提取，4%氯化鈉溶液和正己烷液分配凈化，再經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜儀測定，外標法定量。結(jié)果表明，甲砜霉素在25～5000 ng/mL、氟苯尼考胺和氟苯尼考在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，甲砜霉素檢測限為10μg/kg，氟苯尼考及氟苯尼考胺檢測限為2.0μg/kg，回收率均值為73.6%～91.2%，批內(nèi)、批間RSD值均小于20%。本方法專屬性強，靈敏度高，適用于動物可食性組織中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考殘留的測定。

【關(guān)鍵詞】動物可食性組織；氟苯尼考；氟苯尼考胺；甲砜霉素；高效液相色譜法

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.002

Determination of Thiamphenicol， Flufenicomide and Flufenicol Residues in Edible Animal Tissues

LIU Kai

（Liaoning Inspection， Examination & Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）

Abstract： A high-performance liquid chromatography method has been established for the determination of flufenicol， flufenicomide， and thiamphenicol residues in edible animal tissues. The sample was extracted with a mixed extraction solution of acetonitrile-ethyl acetateammonia （volume ratio 5∶15∶80） and purified by 4% sodium chloride solution and n-hexane liquid-liquid distribution， and then purified with HLB solid-phase extraction column. The sample was determined by high-performance liquid chromatography and quantified using an external standard method. The results showed that there was a good linear relationship between the concentration range of 25 ng/mL to 5000 ng/mL of thiamphenicol， and between the concentrations of 5 ng/mL to 500 ng/mL of flufenicol and flufenicomide. The detection limit of thiamphenicol was 10μg/kg， while that of flufenicol and flufenicomide was 2.0μg/kg. The average recovery was 73.6% to 91.1%， and the RSD were<20%. This method is suitable for the determination of thiamphenicol， flufenicomide， and flufenicol residues in edible tissues of animals.

Keywords： edible tissues of animals； flufenicol； flufenicomide； thiamphenicolresidues； high performance liquid chromatography method

甲砜霉素和氟苯尼考是氯霉素的主要替代品，應(yīng)用較廣，具有潛在的體內(nèi)蓄積危險[1-3]，并且由于操作不慎引起殘留的可能性很大。因此，甲砜霉素和氟苯尼考胺可能在動物可食性組織中發(fā)生殘留。

GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，在牛、羊、豬、家禽、魚的靶組織中，甲砜霉素的最大殘留限量均為50μg/kg；氟苯尼考在豬肉、豬皮+脂、豬腎、豬肝、禽肉、禽皮+脂、禽腎、禽肝、牛/羊肉、牛/羊腎、牛/羊肝、魚肉+皮的最大殘留限量分別為300、500、500、2000、100、200、750、2500、200、300、3000、1000μg/kg。

目前，美國采用GC/MS法、歐盟和日本均推薦HPLC法測定組織中氟苯尼考的殘留量[4-6]。國內(nèi)對于動物可食性組織中氟苯尼考（FF）、氟苯尼考胺（FFA）和甲砜霉素（TAP）檢測的研究主要集中于三方面：一是水產(chǎn)品中氟苯尼考、氟苯尼考胺的檢測[7]，二是動物可食性組織中甲砜霉素和氟苯尼考的同時檢測[8-10]，三是液相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法對氯霉素類藥物的殘留檢測[11-13]。而對于動物可食性組織中甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的同時檢測卻未見報道。

因此，制定動物可食性組織中甲砜霉素、氟苯尼考胺和氟苯尼考的檢測方法，可以大大提高甲砜霉素、氟苯尼考胺和氟苯尼考檢測效率，在促進畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展，保障人民身體健康，維護國家食品安全等方面都具有重要意義。甲砜霉素、氟苯尼考胺和氟苯尼考如圖1～圖3所示。

1材料與方法

1.1儀器與材料

Waters E2695高效液相色譜（美國Waters公司）；高速冷凍離心機（Biofuge Strators Centrifuge，德國Thermo Fisher Scientific公司）；均質(zhì)器（PRO250，美國Pro Scientific公司）；氮吹儀（OA-SYS，美國Organomation Associates.Inc公司）；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）；氟苯尼考對照品（純度98.0%）、氟苯尼考胺對照品（純度92.3%）、甲砜霉素對照品（純度99.7%）、乙酸乙酯（色譜純）、乙腈（色譜純）、氨水（分析純）。

1.2標準溶液的配制

精密稱取氟苯尼考、甲砜霉素、氟苯尼考胺對照品適量（相當于各有效成分10 mg），用乙腈稀釋成濃度為100μg/mL對照品儲備液，置于-20℃環(huán)境中保存。

1.3標準曲線溶液的配制

分別準確吸取甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺標準儲備液適量，經(jīng)初始流動相稀釋分別配置成不同濃度的混合標準溶液，其中，甲砜霉素的濃度分別為25.0、50.0、300.0、600.0、2500.0、5000.0μg/L，氟苯尼考胺和氟苯尼考對照品濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0μg/L系列對照溶液，上機測定。

1.4方法

1.4.1樣品溶液的制備

取試料2 g（精確至±1%）于50 mL離心管中，加提取液（乙腈-乙酸乙酯-氨水，5+15+80）15 mL，渦旋1 min，10，000 r/min離心5 min，移取上清液。殘渣用15 mL提取液重復(fù)提取一次，合并兩次提取液于離心管中，混勻。-20℃冷凍1 h，10，000 r/min離心5 min，上清液置于100 mL雞心瓶中，加入5 mL正丙醇，50℃減壓濃縮至干。加入5 mL 4%氯化鈉溶液-甲醇（95+5）溶液溶解殘渣，振蕩3 min，轉(zhuǎn)入50 ml離心管中，加入5 ml甲醇氯化鈉溶液重復(fù)溶解殘渣，合并溶解液。加入10 ml正己烷，振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，再加入10 mL正己烷，重復(fù)上述操作，加入0.5 ml氨水，混勻，為備用液。HLB固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水潤洗。備用液過柱，依次用3 mL水、3 mL水-甲醇-氨水（180+19+1）淋洗，真空抽干，再用3 mL氨水-甲醇（3.3+ 96.7）洗脫，50℃下氮氣吹干，殘渣用2 mL流動相溶解過0.22μm濾膜作為試樣溶液。供高效液相色譜儀測定。

1.4.2色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，粒徑5μm）；流動相：乙腈+0.8 mol/L庚烷磺酸鈉離子對緩沖溶液（21+79）；流速：0.7 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20μL。熒光檢測器：激發(fā)波長235 nm；發(fā)射波長295 nm。

1.4.3檢測限與定量限的確定

稱取2 g空白組織，加適量混合標準溶液，按樣品前處理方法處理后測定。待測物的信噪比S/N>3（按PtP算）為方法的檢出限；待測物的信噪比S/N>10（按PtP算）為方法的定量限。

1.4.4方法的添加回收率與精密度

分別制備低、中、高3種濃度水平的陽性添加樣品，每種濃度水平進行5份樣本分析，重復(fù)3次。根據(jù)當日的標準曲線和陽性添加樣品的響應(yīng)值，計算樣品的提取回收率，并計算樣品的批內(nèi)、批間相對標準偏差。

2結(jié)果與分析

2.1方法專屬性考察

對照品溶液、空白樣品、添加回收色譜圖見圖4～圖34。

圖4～圖34的結(jié)果顯示，在本研究的前處理條件和儀器條件下，樣品中內(nèi)源性的雜質(zhì)對檢測無干擾，具有較好的專屬性。

2.2線性范圍

將峰面積設(shè)定為縱坐標，對照溶液的濃度設(shè)定為橫坐標，得到標準曲線，見表1。

2.3檢測限與定量限的確定

甲砜霉素在豬肉、豬皮+脂、豬腎、豬肝、禽肉、禽皮+脂、禽腎、禽肝、牛/羊肉、牛/羊腎、牛/羊肝、魚肉+皮中檢出限均為10μg/kg，定量限為50.0μg/kg；氟苯尼考及氟苯尼考胺在豬肉、豬皮+脂、豬腎、豬肝、禽肉、禽皮+脂、禽腎、禽肝、牛/羊肉、牛/羊腎、牛/羊肝、魚肉+皮中檢出限均為2.0μg/kg，定量限為10.0μg/kg。

2.4方法的添加回收率與精密度

采用標準添加法，在空白組織中添加高、中、低3種濃度的混合標準工作液進行精密度和準確度的測定，每次5個重復(fù)，并進行3次重復(fù)實驗。由表2～表5可知，在高、中、低3種濃度下，

甲砜霉素的回收率在71.8%～98.7%，氟苯尼考胺的回收率在70%～ 98.6%，氟苯尼考的回收率在70.2%～99.4%，批內(nèi)變異系數(shù)≤13.2%；批間變異系數(shù)≤7.8%。

3討論

3.1流動相的優(yōu)化

本實驗使用高效液相色譜儀[14-17]，A泵入磷酸鹽溶液，B泵入乙腈，通過調(diào)節(jié)兩泵流速，從而改變流動相極性。當乙腈比例從15%調(diào)節(jié)到40%時，各待測物質(zhì)的出峰時間均縮短；當乙腈比例是21%時，各待測物峰與雜質(zhì)峰充分分離，峰形較好。由于氟苯尼考胺為弱堿性極性的性質(zhì)，在C18反相色譜柱中幾乎不保留[18-21]，因此本實驗采用離子對色譜原理進行分析。本實驗采用的離子對試劑是庚烷磺酸鈉，與氟苯尼考胺生成弱極性離子對，弱極性離子對分布在疏水固定相表面，然后再被流動相洗脫下來。隨著庚烷磺酸鈉濃度的增加，氟苯尼考胺出峰時間不斷延長，當庚烷磺酸鈉濃度達到0.8 mol/L時，氟苯尼考胺與雜質(zhì)峰充分分離，峰形較好。

3.2光譜條件的確定

較紫外檢測器檢測，本實驗采用的熒光檢測器樣品雜質(zhì)峰少、干擾少，可將甲砜霉素、氟苯尼考與氟苯尼考胺與組織中的其他組分完全分開，而且熒光檢測器靈敏度更高[22-24]。根據(jù)文獻報道，將激發(fā)波長從200～280 nm，發(fā)射波長從255～400 nm做依次檢測，確定在激發(fā)波長235 nm，發(fā)射波長295 nm熒光條件下，可獲得較大的甲砜霉素、氟苯尼考與氟苯尼考胺信號。

3.3提取溶劑的選擇

甲砜霉素與氟苯尼考屬于弱極性化合物，微溶于水，易溶于有機溶劑。氟苯尼考胺極性強，微溶于水，在弱堿性條件下以分子狀態(tài)存在，易溶于有機溶劑[25-27]。本實驗比較了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、氨化乙酸乙酯（體積比2∶98）、氨化乙腈（體積比2∶98）、氨水乙酸乙酯乙腈混合提取液（體積比2∶49∶49）、氨水乙酸乙酯乙腈混合提取液（體積比5∶15∶80）。結(jié)果表明：乙酸乙酯、乙腈、丙酮、氨化乙酸乙酯（體積比2∶98）、氨化乙腈（體積比2∶98）、氨水乙酸乙酯乙腈混合提取液（體積比2∶49∶49）對甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率較好，回收率較高，但對氟苯尼考胺的提取效率較差，回收率較低。氨水、乙酸乙酯、乙腈混合提取液（體積比5∶15∶80）對甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺的提取效率較好，回收率較高，而且雜質(zhì)峰相對較少。

4結(jié)束語

本試驗建立的樣品前處理分析方法凈化效果好，靈敏度高，甲砜霉素檢測限為10μg/kg，氟苯尼考及氟苯尼考胺檢測限為2.0μg/kg，回收率均值為73.6%～91.1%，批內(nèi)、批間RSD< 20%?？瞻谆|(zhì)對檢測上述3種藥物無干擾，專屬性強，適用于動物可食性組織中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考殘留的測定。

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【作者簡介】

劉凱，女，1975年出生，高級畜牧師，學士，研究方向為畜產(chǎn)品藥物殘留檢測。

（編輯：李鈺雙）