杜紅毅 陶文生 李朝榮 馬明 汪長國

摘要 為充分發(fā)掘復(fù)合酶制劑在提高煙葉綜合品質(zhì)方面的潛力，通過開發(fā)較大比例重慶產(chǎn)煙葉葉組配方模塊，研究酶制劑在線提升煙葉模塊品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。通過葉組配方篩選、加料評吸確定了3種較大比例重慶產(chǎn)煙葉葉組配方模塊；通過計算機直接試驗設(shè)計，結(jié)合感官質(zhì)量評價賦分方法，開發(fā)了針對煙葉模塊的不同酶系并組配適用的助劑與料液。結(jié)果表明，經(jīng)過加酶處理后蛋白質(zhì)含量降低率最高達21.73%，水溶性總糖和還原糖含量提高率最高分別達27.76%和27.61%，在線中試試驗對煙葉模塊在降低刺激性、去除雜氣、改善口感、提高純凈度方面的效果明顯。

關(guān)鍵詞 復(fù)合酶制劑；卷煙生產(chǎn)；煙葉模塊品質(zhì)；中試試驗

中圖分類號 TS452? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）11-0169-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.036

Study on the Application of Compound Enzyme Preparations in Cigarette Production on Improving Tobacco Module Quality

DU Hong-yi， TAO Wen-sheng， LI Zhao-rong et al

（Technical Center of China Tobacco Chongqing Industrial Co.， Ltd.， Chongqing 400060）

Abstract In order to fully exploit the potential of compound enzyme preparations in improving the comprehensive quality of tobacco， cigarette blend modules were developed from large ratio Chongqing tobacco to study the key techniques of enzyme preparations for improving tobacco module quality in cigarette production. Three large ratio Chongqing tobacco blend modules were determined by blend formula selection and oral evaluation. By means of computer direct design and sensory quality scoring， different enzyme preparations and coordinated additive solvent system were developed， in combination with the sensory quality evaluation assigning means. The results showed after enzyme treatments， protein reduction rate could reach 21.73%， while water-soluble total sugar and reducing sugar increase rate could reach 27.76% and 27.61% respectively. The pilot test had significant effects on tobacco module about reducing the irritancy， removing offensive odors， improving taste and purity of smoke.

Key words Compound enzyme preparations;Cigarette production;Tobacco module quality;Pilot test

作者簡介 杜紅毅（1982—），男，重慶人，工程師，博士，從事煙草生物技術(shù)研究。

*通信作者，研究員，碩士，從事煙草化學(xué)研究。

收稿日期 2023-05-17

煙草工業(yè)是我國國民經(jīng)濟的重要支柱產(chǎn)業(yè)。作為其重要原料的煙葉，尤其是庫存的低次等級、年限久和產(chǎn)地生長條件較差的煙葉在正常醇化期內(nèi)很難轉(zhuǎn)化為工業(yè)可用性達標(biāo)的適用性原料，因此探索提升煙葉綜合品質(zhì)的方法對卷煙工業(yè)企業(yè)而言尤為重要，對于優(yōu)化企業(yè)庫存結(jié)構(gòu)、降本增效意義重大［1-3］。

采收的新鮮煙葉可通過生物酶技術(shù)處理，在煙葉調(diào)制、打葉復(fù)烤、倉儲醇化和片煙制絲等工序段，去除刺激性與雜氣關(guān)聯(lián)成分前體物、加速大分子物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為致香成分前體物或其他有利于卷煙口感提升的小分子活性成分［4-12］。煙梗、膨脹煙絲等作為葉組配方輔助原料，已有借助生物酶技術(shù)進行提質(zhì)的相關(guān)報道，且取得了良好效果［13-15］。針對煙葉模塊的酶制劑配方研究以及利用微生物和酶協(xié)同作用來改善煙葉品質(zhì)的研究也有一定進展［16-18］。

筆者通過剖析重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司庫存煙葉的品質(zhì)特性并構(gòu)建煙葉模塊，科學(xué)設(shè)計與模塊相匹配的酶組合配方，并在實驗室小試試驗、工廠中試試驗過程中進行逐級優(yōu)化，探索出制絲在線工藝耦合酶制劑處理的具體配方構(gòu)成、工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原輔材料與功能材料。

庫存煙葉、煙絲樣品、CQYY料液、反應(yīng)助劑-03、HD提取物、K326提取物均由重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 生物酶。

中性蛋白酶（100 000 U/g）、中溫α-淀粉酶（2 000 U/g）、酸性纖維素酶（15 000 U/g）、果膠酶（10 000 U/g）、β-葡萄糖苷酶（4 000 U/g）、酸性木聚糖酶（100 000 U/g），均由煙臺中海釣臺生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑與耗材。

主要試劑：檸檬酸、蘋果酸、無水乙醇、二氯甲烷、甲醇、異丙醇、酶活檢測試劑盒（索橋生物）。

主要耗材：尼龍濾網(wǎng)（孔徑100～120目），各種容量燒杯、量筒與容量瓶，移液器，不銹鋼樣品托盤，噴槍，金屬篩網(wǎng)（孔徑40～80目），空煙筒，手動卷煙器。

1.2 儀器與設(shè)備

KBF115恒溫恒濕箱（德國BINDER公司）；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；AX523ZH電子天平（美國OHAUS儀器有限公司）；LabMill120錘式旋風(fēng)磨（瑞典PERTEN公司）；QS-1煙葉切絲機（開封捷利美嘉機械設(shè)備有限公司）；B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；HP 7890GC-5977MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；RM200A轉(zhuǎn)盤式吸煙機（德國博瓦特－凱西公司）；SM450直線型吸煙機（英國Cerulean公司）；San++連續(xù)流動分析儀（荷蘭SKALAR公司）；L-8900氨基酸分析儀（日本HITACHI公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物酶預(yù)處理與配方設(shè)計。

與液態(tài)生物酶產(chǎn)品不同之處在于：粉末狀生物酶需要經(jīng)過水浴活化工序，以達到在煙葉表面添加的最佳狀態(tài)。該研究首先將多種生物酶活化并配制成復(fù)合酶制劑，再將其用于煙葉原料及煙葉模塊的處理。其次，復(fù)合酶制劑的酶系組成和配比需要充分剖析待處理煙葉原料和煙葉模塊的特性，根據(jù)其特性提取待提升的品質(zhì)缺陷，并結(jié)合各單一酶種差異化的反應(yīng)條件而設(shè)計其在復(fù)合酶制劑中的組合比例。最后，根據(jù)實驗室小試試驗的感官評價及化學(xué)成分測定結(jié)果，優(yōu)選出可用性好的復(fù)合酶制劑配方，用于中試試驗。

1.3.2 煙葉模塊構(gòu)建。

在分析煙葉原料和煙葉模塊特性的基礎(chǔ)上構(gòu)建模塊，便于生物酶的處理?；跓熑~風(fēng)格、生態(tài)特性、化學(xué)成分等庫存原料歷史數(shù)據(jù)，結(jié)合產(chǎn)品開發(fā)人員經(jīng)驗研判，開發(fā)出3種重慶煙葉占比較高的煙葉模塊，含1個通用模塊、2個部位模塊。

1.3.3 實驗室小試試驗。

開展單等級煙葉、煙葉部位模塊下的酶組合處理，采用模擬加料方式：按照加酶制劑后終點含水率25%的原則設(shè)計酶用量，噴施于煙葉表面，以噴施等體積蒸餾水為對照，將酶處理樣品與對照樣品放入密封袋內(nèi)置于KBF115恒溫恒濕箱中，于溫度45 ℃、濕度70%條件下反應(yīng)18 h；取出后放入109 ℃烘箱中滅活，取出50%切成標(biāo)準(zhǔn)尺寸的煙絲，再卷制成樣品卷煙用于感官評價；另外50%用于物理指標(biāo)和化學(xué)成分檢測。

1.3.4 中試試驗。

以通用模塊為處理對象，基于實驗室小試試驗結(jié)果，將酶用量換算成相對用量，在制絲線松散回潮段按投料量0.60%加入反應(yīng)助劑-03，在制絲線潤葉加料段按投料量0.95%加入酶制劑或按投料量1.79%～1.93%加入酶制劑，與CQYY料液、HD提取物、K326提取物。貯葉柜加膜放置6 h，進行酶促醇化。制絲參數(shù)如下：加料出口水分25%、HT工作蒸汽壓力0.5 MPa、熱風(fēng)溫度110 ℃、筒壁溫度133 ℃，其他參數(shù)與重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司的現(xiàn)行工藝標(biāo)準(zhǔn)要求相同。制絲結(jié)束后用煙絲卷制樣品卷煙，用于感官評價；采用與龍鳳呈祥（軟魅力朝天門）相同的“三紙一棒”進行卷制，即卷煙紙（HTBE02-34-60）、濾棒120 mm（CQ38-S）、不打孔接裝紙64 mm。另外，取煙絲用于物理指標(biāo)和化學(xué)成分檢測。

1.3.5 感官評價排序賦分法。

感官質(zhì)量評價依據(jù)GB 5606.4—2005規(guī)定的方法進行，采用定性和定量方法對樣品進行評價，并以定性指標(biāo)為參考，以定量指標(biāo)計算評價指標(biāo)，通過統(tǒng)計學(xué)方法（方差或?qū)哟畏治龇ǎ┯嬎愠雒總€指標(biāo)的權(quán)重，然后將權(quán)重與指標(biāo)均值相乘，最后加總得出。

1.3.6 煙絲物理指標(biāo)測定。

填充值依據(jù)YC/T 152—2001規(guī)定的方法進行測定。

1.3.7 常規(guī)化學(xué)成分測定。

水溶性總糖、還原糖、總植物堿、氯、鉀、總氮、蛋白質(zhì)含量分別依據(jù)YC/T 159—2002、YC/T 159—2002、YC/T 468—2013、YC/T 162—2002、YC/T 217—2007、YC/T 161—2002、YC/T 249—2008規(guī)定的方法進行測定。

1.3.8 致香成分檢測。

依據(jù)YC/T 176—2003規(guī)定的方法進行致香成分測定。

GC/MS分析條件如下：色譜柱為DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管色譜柱；載氣為高純氦氣；流速為1.0 mL/min（恒流）；進樣體積1.0 μL；分流比為10∶1；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為初始溫度50 ℃保持2 min，以8 ℃/min速度升至280 ℃，保持25 min；傳輸線溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；EI電離能量70 eV；溶劑延遲時間為5.7 min；全掃描質(zhì)量數(shù)范圍為33～400 amu。全掃描后采用SIM定量。采用NIST譜庫進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

試驗數(shù)據(jù)使用Office Excel 2019軟件進行統(tǒng)計分析與制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉模塊的構(gòu)建

2.1.1 通用模塊。

構(gòu)建基于生物酶處理中試試驗需要的通用模塊，必要時可根據(jù)庫存變化進行動態(tài)調(diào)整，具體見表1。

2.1.2 部位模塊。

依據(jù)重慶產(chǎn)煙葉庫存情況，選取上、中2個部位的代表性煙葉，并按照庫存量進行配比，組成2個部位模塊，用于酶組合處理試驗，具體見表2。

2.2 單等級煙葉酶組合處理試驗

將初烤單等級煙葉（2017年豐都，B3F云煙87）作為小試試驗對象，采用“基于均勻設(shè)計的計算機輔助設(shè)計”設(shè)計酶組合試驗方案，詳見表3。處理完成后，進行排序賦分法感官評價及常規(guī)化學(xué)成分測定，結(jié)果見表4～5。

MZ0（CK）、7個酶組合處理樣品的感官評分排序為MZ5＞MZ4＞MZ6＞MZ2＞MZ3＞MZ1＞MZ7＞MZ0（CK），這表明添加酶制劑后樣品的感官質(zhì)量均優(yōu)于CK。

由表4～5可知，與CK相比，酶組合處理單等級煙葉蛋白質(zhì)含量有所降低（降幅9.35%～21.73%），水溶性總糖含量（增幅7.02%～27.76%）和還原糖含量（增幅5.39%～27.61%）均有所提升，同時感官質(zhì)量最好的MZ5組合處理蛋白質(zhì)含量降低率（21.73%）和水溶性總糖含量提高率（27.76%）、還原糖含量提高率（27.61%）均最高。

2.3 煙葉部位模塊酶組合處理試驗

將構(gòu)建的煙葉部位模塊作為小試試驗對象，采用“基于均勻設(shè)計的計算機輔助設(shè)計”設(shè)計酶組合試驗方案，詳見表6。2個部位模塊酶處理完成后，分別進行排序賦分法感官評價。

上部煙葉模塊試驗組感官評價的排序為BM-ZH-5>BM-ZH-1>BM-ZH-4>BM-ZH-3>BM-ZH-6>BM-ZH-2>BM-ZH-7>BM-ZH-CK。中部煙葉模塊試驗組感官評價的排序為CM-ZH-5>CM-ZH-6>CM-ZH-1>CM-ZH-4>CM-ZH-3>CM-ZH-7>CM-ZH-2>CM-ZH-CK。利用感官評價排序結(jié)果，結(jié)合計算機輔助神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模，進行酶組合優(yōu)化設(shè)計，結(jié)果見表7～8。

由表9～10可知，酶組合處理樣品經(jīng)感官評價排序獲得最優(yōu)酶組合，上部煙葉模塊YHB-2感官評價總分較BM-ZH-CK提升5.5分；中部煙葉模塊YHC-2感官評價總分較CM-ZH-CK提升5.0分。同時，由于纖維素酶和果膠酶的存在具有副作用，使得樣品卷煙普遍因填充值不足而出現(xiàn)熱塌陷、空頭等品質(zhì)缺陷，因此考慮在中試試驗設(shè)計方案中不添加纖維素酶和果膠酶。

2.4 中試試驗

以通用模塊為處理對象，在實驗室小試結(jié)果的基礎(chǔ)上，針對性地設(shè)計了中試試驗方案，具體見表11。

檢測烘后煙絲的填充值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各樣品填充值均較高且差異不大，煙絲填充值在4.4 cm3/g以下。

對中試卷煙樣品進行感官評價，重點關(guān)注雜氣、刺激性及口感等指標(biāo)，詳見表12。由表12可知，相較于CK，處理樣品雜氣、刺激性及口感均明顯改善，煙香純凈度有所提高，與實驗室小試結(jié)果相一致。

測定了烘后煙絲的常規(guī)化學(xué)成分，結(jié)果見表13。由表13可知，相較于CK，處理樣品煙絲常規(guī)化學(xué)成分變化不明顯。

以MCL-0為空白對照，以MCL-1（純酶處理）作為陽性對照，測定了煙氣TPM致香成分，分析結(jié)果見表14。結(jié)合Poucher分類法、色譜保留時間，將致香成分分為3段：分段Ⅰ、分段Ⅱ、分段Ⅲ。

由表14可知，相對于空白對照（MCL-0），純酶處理（MCL-1）樣品3段致香成分總量均有所降低（分段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別降低11.27%、8.92%和7.92%），這與感官評價結(jié)果相一致，即在降低不利于香味成分的同時，致香成分含量降低，從而使雜氣減少、刺激性降低、口感改善及煙香純凈度提高。MCL-2、MCL-3、MCL-4在純酶處理（MCL-1）已有感官品質(zhì)提升效果的基礎(chǔ)上，組分中還增加了CQYY料液、2種提取物，除了MCL-4酚類總量有所降低外，3段致香成分總量均有所提高，MCL-2分段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ致香成分總量分別提高13.18%、8.47%和12.66%，MCL-3分段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ致香成分總量分別提高13.55%、9.67%和12.64%；MCL-4分段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ致香成分總量分別提高14.27%、0.32%和5.59%。由于2種提取物用量極低（0.02%），推測3段致香成分總量提高的原因是增加了CQYY料液，其具體作用機制值得深入研究。

3 討論

該研究中單一酶種與酶組合篩選、酶制劑在線添加工序和制絲工藝參數(shù)調(diào)整優(yōu)化、酶處理效果評價等，均建立在葉組配方式煙葉模塊的選型與特性剖析的基礎(chǔ)上，再依據(jù)酶種反應(yīng)特性和制絲在線生產(chǎn)實際，開展相應(yīng)的酶制劑組合開發(fā)和工藝設(shè)計。目前雖然已達到良好的提質(zhì)處理效果，但煙葉原料種質(zhì)資源覆蓋面還有較大提升空間。在卷煙產(chǎn)品開發(fā)過程中，煙葉原料受氣候、土壤、水肥等生態(tài)條件的影響以及農(nóng)藝栽培、調(diào)制復(fù)烤醇化等多種人工生產(chǎn)因素的干預(yù)，再加上不同烤煙品種的遺傳差異因素，使得所構(gòu)建煙葉模塊之間存在較大品質(zhì)差異和不同可用性缺陷。因此，煙草行業(yè)在加大生物技術(shù)研發(fā)投入的背景下，有必要通過生物酶制劑的定制化開發(fā)思路，在卷煙廠制絲線深挖可使酶促反應(yīng)效率更高的工藝手段，比如定制專用高精度動態(tài)加料與底物濃度監(jiān)控裝置等，在科學(xué)設(shè)計和生物酶在線處理平臺上進行常態(tài)化投入，進一步開發(fā)卷煙用酶處理技術(shù)。

傳統(tǒng)輕工業(yè)領(lǐng)域在生物技術(shù)上的突破，從生化反應(yīng)的成本控制和技術(shù)升級2個方面考慮，既需要取得工藝適應(yīng)性研究成果，更需要深層次理解所涉及生化反應(yīng)體系的作用機理，從而對限速步驟加以改進，確保技術(shù)優(yōu)勢的不斷鞏固和可持續(xù)發(fā)展，有利于實現(xiàn)技術(shù)迭代、自優(yōu)化和成果高效轉(zhuǎn)化。該研究立足于生物技術(shù)在制絲工藝在線應(yīng)用的需求，在分析煙葉特性并構(gòu)建模塊、生物酶選型與酶系構(gòu)建、效果評價與中試試驗應(yīng)用等方面開展了有關(guān)工作。該研究也發(fā)現(xiàn)，處理后樣品評價手段單一，工藝參數(shù)（如加料溫度、貯葉溫濕度和時間等）與生物酶作用最佳條件匹配度不高皆是由于對煙葉外源酶作用的機理研究有限，仍然需要進一步提升酶處理效果和降低成本，保證酶技術(shù)的高效轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

4 結(jié)論

該研究重點開發(fā)了以酶制劑為主體的生物反應(yīng)調(diào)控技術(shù)，用于提高煙葉模塊的綜合品質(zhì)，以改善煙氣口感與香味。通過對庫存煙葉原料的感官評價賦分與主要化學(xué)成分分析，選定原料種類并構(gòu)建煙葉模塊，結(jié)合生物酶的催化特性和反應(yīng)條件分析，確定了采用單酶種類、用法用量和實驗室小試階段預(yù)處理的多酶復(fù)合配比。在實驗室小試過程中，采用以感官評價質(zhì)量為主并適當(dāng)參考化學(xué)成分協(xié)調(diào)性的方法，耦合與酶系協(xié)作的助劑、料液等組分，獲得了可用于中試試驗的多組酶制劑配方，并通過中試試驗確定了適用于在線制絲的最優(yōu)配方，驗證了生物酶制劑用于在線提升煙葉模塊綜合品質(zhì)的技術(shù)可行性，該技術(shù)有利于實現(xiàn)優(yōu)化煙葉庫存結(jié)構(gòu)的目標(biāo)。

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