韓倩 尤欣 郭思桃 姜瑞麗 錢雪橋 王永強 劉佳旭

摘要 為了解廣東省四會地區(qū)某雞場多病因氣囊炎的主要致病菌及其耐藥情況。采用形態(tài)學鑒定、16S rRNA基因測序等方法對分離株進行鑒定，選取3種常用抗生素進行藥物敏感性試驗，進行耐藥性研究。結果表明：第1株分離株菌落呈典型的“荷包蛋”狀，第2株分離株為革蘭氏陰性桿菌，第3株分離株為革蘭氏陽性球菌，經(jīng)16S rRNA 基因測序比對分析，3種病原的同源性均在99%以上，確定多病因氣囊炎的主要致病菌為雞毒支原體、大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌，分別命名為SH-MG株、SH-E株和SH-S株。藥物敏感性結果表明，SH-E株對阿莫西林、氟苯尼考和泰妙菌素產(chǎn)生了耐藥性，SH-S株對阿莫西林產(chǎn)生了耐藥性，SH-MG株對泰妙菌素敏感。說明禽多病因氣囊炎很可能是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和雞毒支原體共同感染造成的，其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對一些常用的抗生素表現(xiàn)出耐藥性，泰妙菌素是防治雞毒支原體感染的首選藥物。

關鍵詞 禽多病因氣囊炎；分離鑒定；耐藥性；雞毒支原體；禽致病性大腸桿菌；金黃色葡萄球菌

中圖分類號 S858.31? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）11-0085-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.018

Isolation， Identification and Antibiotic Resistance of Pathogen Isolated from Avian with Multicausal Airsacculitis

HAN Qian，YOU Xin，GUO Si-tao et al

（Guangdong HAID Group Co.Ltd.， Key Laboratory of Microecological Resources and Utilization in Breeding Industry， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Guangzhou， Guangdong 511400）

Abstract In order to investigate the major pathogen of multicausal airsacculitis and its antibiotic resistance in a hennery in Sihui area of Guangdong Province， the morphological identification， 16S rRNA gene sequencing were performed， and drug resistance of these isolates were assessed using MIC. The results showed that the colonies of the first isolate had a typical “poached egg”shape， the second isolate was Gram-negative bacilli and the third isolate was Gram-positive cocci. 16S rRNA gene sequencing analysis results showed that the isolated strains were identified as Mycoplasma gallinarum， Escherichia coli and Staphylococcus aureus， named as SH-MG strain， SH-E strain and SH-S strain， respectively. Drug resistance results showed that SH-E strain was resistant to amoxicillin， florfenicol and tiamulin， and SH-S strain was resistant to amoxicillin. We conclude that the multicausal airsacculitis is probably caused by co-infection of drug-resistant Staphylococcus aureus， drug-resistant Escherichia coli and Mycoplasma gallinarum， tiamulin is the first choice for the prevention and treatment of mycoplasma gallinis infection.

Key words Multicausal airsacculitis;Isolation and identification;Drug resistance;Mycoplasma gallisepticum;Avian pathogenic Escherichia coli;Staphylococcus aureus

基金項目 廣州市高水平企業(yè)研究院項目（202205110006）。

作者簡介 韓倩（1993—），女，江蘇徐州人，碩士，從事動物行為與健康養(yǎng)殖研究。

*通信作者，獸醫(yī)師，博士，從事動物傳染病和免疫學研究。

收稿日期 2023-08-03；修回日期 2023-08-24

禽呼吸道疾病長期困擾著養(yǎng)禽業(yè)，春秋季節(jié)高發(fā)，嚴重影響了雞群增重、生長發(fā)育和產(chǎn)蛋率，對養(yǎng)禽業(yè)造成了的巨大經(jīng)濟損失［1］。2021年以來，廣東省四會地區(qū)某雞場陸續(xù)出現(xiàn)氣囊纖維素性滲出、氣管栓塞等多病因氣囊炎的癥狀，發(fā)病率為50%～70%，死亡率高達30%。據(jù)報道，雞毒支原體（mycoplasma gallisepticum，MG）是引發(fā)雞的慢性呼吸道疾病的主要病原之一，常與禽致病性大腸桿菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、傳染性鼻炎、新城疫和傳染性支氣管炎等混合感染［2］，可導致呼吸道癥狀加重，死亡率升高。此外，由于基層養(yǎng)殖場對抗菌藥物的長期依賴和不合理用藥，導致多種細菌的耐藥性呈逐年上升趨勢［3］。鑒于此，為了確定該雞場雛雞氣囊炎的發(fā)生是否由MG、APEC和SA聯(lián)合感染，在進行現(xiàn)場流行病學觀察及臨床診斷基礎上，無菌采集1～2月齡發(fā)病雛雞的咽拭子，進行了病原的分離鑒定及藥物敏感性試驗。不但可以為控制該病的發(fā)生提供理論支持，而且可以為動物感染疾病模型的建立提供依據(jù)，對禽類健康養(yǎng)殖及畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料與菌株來源。

20份咽拭子，采自廣東省四會地區(qū)某雞場；雞毒支原體標準菌株S6株，由華南農(nóng)業(yè)大學丁煥中教授贈予；禽致病性大腸桿菌10389標準株及金黃色葡萄球菌10384標準株，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 主要試劑及設備。

1.1.2.1 主要試劑。革蘭氏染色液（環(huán)凱微生物公司，批號6107243）、麥康凱瓊脂（環(huán)凱微生物公司，批號022140）、甘露醇高鹽瓊脂（海博生物，批號HB4128）、麥氏比濁管（環(huán)凱微生物公司，批號075870）、PPLO無結晶紫肉湯（海博生物，批號HB8475）、LB肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物，028320）、胎牛血清（美國 Gibco 公司，批號10091148）、酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、醋酸鉈（美國 Sigma 公司，批號T8266-5G）、PCR Master Mix（購自TakaLa公司，批號RR300A）、阿莫西林、氟苯尼考和延胡索酸泰妙菌素標準品（國家標準品網(wǎng)，批號CCAD300574、140806和Y0000333）。

1.1.2.2

主要儀器。二氧化碳培養(yǎng)箱（ESCO公司，CLM-170B-8-NF型）、振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司，ZQZY-AF8V型）、生物安全柜（ESCO公司，AC2-4D1型）、電泳凝膠成像系統(tǒng)（SAGECREATION公司，Champ Ge17000型）、正置顯微鏡（LEICA，DM750型）。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集與初步分離。

1.2.1.1

雞毒支原體的分離與純化。隨機無菌采集10份患有氣囊炎病雞的咽拭子，編號后立即放入加有2 mL PPLO培養(yǎng)基［1］的10 mL EP管內，使用0.45 μm濾器過濾2次，垂直放置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3～6 d，直到培養(yǎng)基的顏色呈現(xiàn)黃色后再傳代。連續(xù)傳代7～9次后，取培養(yǎng)物接種固體培養(yǎng)基，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)6～7 d。在低倍鏡下選取單個菌落再次接種PPLO肉湯培養(yǎng)基，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色剛好變黃后，得到純化的分離株培養(yǎng)物［4-5］。

1.2.1.2

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的分離與純化。無菌采集10份咽拭子病料接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，再用無菌接種環(huán)蘸取少量培養(yǎng)液分別在麥康凱、甘露醇高鹽選擇培養(yǎng)基上劃線接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。挑取可疑單菌落接種于 LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，重復3次，得到純化的分離株培養(yǎng)物。

1.2.2 菌落形態(tài)及染色鑒定。

顯微鏡低倍鏡下直接觀察PPLO固體培養(yǎng)基上的MG菌落形態(tài)，在這之后使用Dinese染色液染色后再次置于顯微鏡低倍鏡下觀察形態(tài)。分別吸取5 μL APEC和SA菌液沉淀均勻涂于載玻片上，按照革蘭氏染色液試劑盒說明書染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 病原的PCR鑒定。

根據(jù)NCBI中MG、APEC和SA的16S rRNA序列設計引物，分別以菌液為模板，進行PCR鑒定。引物序列如表1所示，引物由上海生工合成。

對疑似菌液采用 10 μL 的反應體系進行PCR擴增：上、下游引物各0.2 μL，模板1.0 μL，Mix 5.0 μL，無菌水3.6 μL。同時用雞毒支原體標準菌株S6株、禽致病性大腸桿菌10389標準株及金黃色葡萄球菌10384標準株做陽性對照，并設立無菌水為模板做陰性對照。反應條件：94 ℃預變性3 min、94 ℃變性15 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。擴增產(chǎn)物取 6 μL 經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳，使用1×TAE 緩沖液，180 V 恒壓電泳 35 min，電泳后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)拍照保存后棄去。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定。

取一96孔板，每孔加入200 μL PPLO（或50 μL MH）培養(yǎng)基。向每排第1孔加入50 μL抗生素，抗生素溶液配制方法見表2。用移液器吹打3～5次混勻后，吸取50 μL混合液加入第2孔，混勻后，吸取50 μL混合液加入第3孔，以此類推，至第10孔時，吸棄50 μL混合液。向每排前11孔中加入50 μL菌液，使其終濃度為2×104 CCU/mL（5×105 CFU /mL）。加蓋后用封口膜封住周圍的縫隙以防漏氣，5% CO2，37 ℃（或37 ℃）培養(yǎng)4～6 d（或過夜培養(yǎng)），每日觀察記錄結果，當變色孔不再增加后確定終點，并以抑制MG（或APEC和SA）生長的抗生素的最高稀釋度作為最低抑菌濃度。

3種抗生素對分離菌株的藥敏折點如表3 所示。相關數(shù)據(jù)來自美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）。

2 結果與分析

2.1 雞毒支原體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的分離及初步鑒定結果

成功從廣州四會某雞場的臨床樣本中分離得到一株雞毒支原體，命名為SH-MG株；一株大腸桿菌，命名為SH-E株；一株金黃色葡萄球菌，命名為SH-S株。將樣品處理后接種于PPLO液體培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2 恒溫箱培養(yǎng)7～9代，隨后接種于PPLO固體培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2 溫箱培養(yǎng)3～7 d，在顯微鏡觀察到圓形并呈典型“荷包蛋” 樣的菌落（圖1A）。使用Dinese染色后，低倍鏡下同樣觀察到典型的“煎蛋型”菌落（圖1B）。挑取單菌落到PPLO液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待發(fā)生顏色改變后再次接種PPLO固體培養(yǎng)基，重復3次，即可獲得純化的支原體，CCU 測定結果為 109 CCU/mL。將SH-E和SH-S樣品分別劃線接種于麥康凱（圖1C）和高鹽甘露醇固體培養(yǎng)基（圖1D），于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落涂片、革蘭氏染色鏡檢（圖1E、圖1F），篩選疑似菌落，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 雞毒支原體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的PCR鑒定結果

分離株16S rRNA 基因 PCR 鑒定結果顯示，擴增片段的大小分別為 538、358和607 bp（圖2），與預期片段大小相符，表明片段擴增正確。對16S rRNA 基因測序結果進行 Blast 基因比對分析，結果表明，擴增序列與 NCBI上公布的16S rRNA序列NR_104952.1、NR_024570、NR_118997同源性均在99%以上。證實該分離株為雞毒支原體、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

2.3 雞毒支原體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的耐藥性分析結果

藥物敏感試驗結果見表4。由表4可知，與大腸桿菌10389標準株相比，SH-E株對氟苯尼考和泰妙菌素產(chǎn)生了較強的耐藥性，MIC值相差數(shù)10倍；與金黃色葡萄球菌10384標準株相比，SH-S株對阿莫西林和泰妙菌素產(chǎn)生了較強的耐藥性，MIC值相差數(shù)百倍。雞毒支原體S6株和SH-MG株對3種抗生素的藥物敏感性一致。

3 討論

在該試驗中，試驗所用病料為廣東省四會地區(qū)發(fā)病雛雞的咽拭子，雛雞表現(xiàn)為氣管栓塞、氣囊炎等多病因氣囊炎的癥狀。由于不同病原菌的致病性和耐藥情況不同，所以對病原的鑒定顯得尤為重要。結合傳統(tǒng)分離鑒定方法與PCR技術，發(fā)現(xiàn)多病因氣囊炎很可能是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和雞毒支原體混合感染造成的，而且大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對阿莫西林和氟苯尼考表現(xiàn)出耐藥性，雞毒支原體對泰妙菌素敏感。

支原體分離、培養(yǎng)條件比較苛刻，生長緩慢，培養(yǎng)時間長，操作繁雜［7］。結合該次試驗，對該技術的幾個關鍵點進行總結。此次試驗10份咽拭子中僅有1份分離出1株MG，分離率低至10%，因此建議采集病料時數(shù)量加倍，或采集雜菌少、易分離出支原體的新鮮支氣管和肺組織［8］。據(jù)文獻［4-5］報道，病料培養(yǎng)液的過濾除菌可采用0.22 μm或0.45 μm濾膜，但經(jīng)過多次嘗試后發(fā)現(xiàn)0.22 μm濾膜過濾后，濾液中通過PCR方法無法檢測到雞毒支原體，僅能在0.45 μm濾膜過濾后的菌液中分離出雞毒支原體，因此建議濾器采用0.45 μm孔徑大小。在分離過程中，發(fā)現(xiàn)大部分雜菌耐藥性很強，且0.45 μm濾膜難以過濾掉所有雜菌，可通過增加醋酸鉈、青霉素的用量或增加傳代次數(shù)來提高分離支原體的成功率，該次試驗發(fā)現(xiàn)傳至7代左右，菌液由渾濁變?yōu)橥该鞯某赛S色液體，此時再通過涂布方法便可分離出支原體單菌落。此外，支原體的培養(yǎng)對營養(yǎng)條件要求高，采購血清時須選取品質高、有保障的品牌。

近年來，隨著養(yǎng)禽業(yè)越來越規(guī)模化、集約化，多種病原的混合感染，特別是一些飼料添加劑中盲目使用某些抗菌藥物，導致細菌的耐藥性呈逐年上升趨勢［9］。這不僅不能達到理想的治療效果，反而更易引起動物體內正常菌群失調，導致耐藥性的產(chǎn)生［10］。該試驗結果表明，與大腸桿菌10389標準株和金黃色葡萄球菌10384標準株相比，導致多病因氣囊炎的大腸桿菌SH-E株和金黃色葡萄球菌SH-S株對常用的抗生素均產(chǎn)生了較強的耐藥性。因此，在臨床上，要了解地區(qū)流行野毒株的種類和藥物敏感性，合理使用抗菌藥物，從而減緩細菌耐藥性的發(fā)生。

目前，藥物預防仍是國內控制雞毒支原體感染的常用方法，其中應用最廣泛的藥物是延胡索酸泰妙菌素［11］。隋兆峰等［12］2013—2015年的雞毒支原體臨床分離株體外敏感性試驗表明，其耐藥性變化不大且敏感性高［12］，該研究也證實了這一點。在臨床治療過程中難以依靠藥敏試驗結果選擇藥物的種類及用量，基本依據(jù)經(jīng)驗治療，從而導致很多臨床常用藥對病原逐漸產(chǎn)生耐藥性。因此，對病原進行分離、鑒定及耐藥性監(jiān)測有重要的意義，應根據(jù)檢測結果選擇對該病敏感的藥物進行治療。根據(jù)該研究結果，估測延胡索酸泰妙菌素未來幾年仍是防治雞毒支原體的首選藥物。

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