錢澄倩 杜宇輝 紀(jì)耀勇 黃艷蒙 李賢信

摘要：科氏葡萄球菌是一種皮膚共生菌，但在一定條件下也可引起炎癥和疾病，常分布于人類、畜牧動(dòng)物、食品等環(huán)境中。該研究從市售即食肉制品中分離得到一株科氏葡萄球菌HT-26，經(jīng)分析鑒定該菌株屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。由于SCC與其近源菌種的基因組序列相似度高，因此SCC的快速特異性檢測(cè)存在一定困難。該研究基于比較基因組學(xué)分析找到4段SCC特異性序列，并篩選和驗(yàn)證得到一對(duì)高效特異性檢測(cè)引物，可實(shí)現(xiàn)最低27 CFU/mL濃度的SCC檢測(cè)，且可有效應(yīng)用于即食肉制品中，最低檢測(cè)限可達(dá)115 CFU/g。對(duì)即食肉制品或其他食品實(shí)行SCC的快速特異性檢測(cè)可加強(qiáng)調(diào)味品中微生物污染防治監(jiān)控，進(jìn)一步加強(qiáng)食品安全保障。

關(guān)鍵詞：科氏葡萄球菌；科氏葡萄球菌科氏亞種；SCC；qRT-PCR；即食肉制品

中圖分類號(hào)：TS251.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-9973（2024）06-0157-05

Staphylococcus cohnii subsp. cohnii HT-26 Isolated from Instant Meat

Products and Screening of Its Rapid Detection Molecular Marker

QIAN Cheng-qian^1，2，3， DU Yu-hui¹， JI Yao-yong³，

HUANG Yan-meng³， LI Xian-xin^{2，3，4*}

（1.School of Biological Science and Engineering， South China University of Technology，

Guangzhou 511400， China; 2.Foshan Haitian Flavoring & Food Co.， Ltd.， Foshan 528000，

China; 3.Branch Office of Tianyan （Tianjin） High-Tech Co.， Ltd.， Foshan 528000，

China; 4.Foshan Haitian （Gaoming） Flavoring & Food Co.， Ltd.，

Foshan 528500， China）

Abstract： Staphylococcus cohnii is a kind of skin symbiotic bacterium， but it can also cause inflammation and diseases under certain conditions. It is commonly distributed in the environments such as humans， livestock and food. In this study， a strain of Staphylococcus cohnii HT-26 is isolated from commercially available instant meat products. After analysis， it is identified that the strain belongs to Staphylococcus cohnii subsp. cohnii （SCC）. Due to the high similarity of genomic sequences between SCC and its close-related species， there are certain difficulties in the rapid and spectific detection of SCC. In this study， based on comparative genomics analysis， four SCC specific sequences are found， and a pair of efficient specific detection primers is screened and verified， which can achieve SCC detection at the minimum concentration of 27 CFU/mL and can be effectively applied in instant meat products， with the minimum detection limit of 115 CFU/g. Implementing rapid and specific SCC detection on instant meat products or other foods can strengthen the prevention and monitoring of microbial contamination in seasonings and further enhance food safety assurance.

Key words： Staphylococcus cohnii； Staphylococcus cohnii subsp. cohnii； SCC； qRT-PCR； instant meat products

收稿日期：2023-12-30

基金項(xiàng)目：廣東省調(diào)味食品生物發(fā)酵先進(jìn)技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（2017B030302002）

作者簡(jiǎn)介：錢澄倩（1992—），女，博士，研究方向：微生物檢測(cè)技術(shù)和分子機(jī)制。

*通信作者：李賢信（1984—），男，工程師，碩士，研究方向：食品安全檢測(cè)技術(shù)。

科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）是凝固酶陰性葡萄球菌中的一種革蘭氏陽(yáng)性菌，于1975年被正式劃分并命名^[1]，廣泛分布于多種食品樣本，如豬肉、雞肉、魚(yú)類制品、芝士等^[2-4]中，在一定條件下可引起人體感染并引發(fā)腦膜炎、菌血癥等疾病^[5-6]，且具有多種耐藥性^[7-8]，已逐漸引起世界衛(wèi)生組織的關(guān)注。

科氏葡萄球菌根據(jù)表型特征差異又細(xì)分為兩個(gè)亞種：科氏亞種（Staphylococcus cohnii subsp.cohnii，SCC）和解脲亞種（Staphylococcus cohnii subsp.urealyticum，SCU）^[9]。隨著比較基因組學(xué)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析的發(fā)展，SCU被獨(dú)立劃分為解脲葡萄球菌（Staphylococcus urealyticus，SU），而科氏葡萄球菌重新細(xì)分為兩個(gè)亞種：科氏亞種（SCC）和巴氏亞種（Staphylococcus cohnii subsp. barensis，SCB）^[10]?？剖掀咸亚蚓鸀槲锓N復(fù)合群，其近源菌種SU和亞種SCC、SCB的全基因組序列具有高度相似性，為SCC的特異性快速檢測(cè)帶來(lái)較大困難。

隨著食品和調(diào)味品行業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的即食型肉制品進(jìn)入消費(fèi)者市場(chǎng)。生產(chǎn)過(guò)程中除常規(guī)優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)菌株的參與之外，往往也會(huì)引入一些污染菌種。從市售的火腿、中式臘腸中曾分離出多種葡萄球菌^[11-13]，經(jīng)生化反應(yīng)鑒定為表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌等條件致病菌。本研究從市售即食肉制品中分離得到一株科氏葡萄球菌HT-26，經(jīng)分析鑒定該菌株屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。

目前，食品和調(diào)味品生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)局等單位通常按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法進(jìn)行菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌（包括志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌）的通用型檢測(cè)^[14]，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且缺少對(duì)特定品類中特定微生物的檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。本研究基于比較基因組學(xué)篩選得到了科氏葡萄球菌科氏亞種SCC的特異性分子標(biāo)識(shí)，并開(kāi)發(fā)了針對(duì)SCC的快速檢測(cè)方法，可在4 h內(nèi)完成即食肉制品中SCC的快速檢測(cè)，有助于加強(qiáng)肉制品及相關(guān)調(diào)味品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物安全監(jiān)控。

1 材料和方法

1.1 材料

即食肉制品樣本：購(gòu)自佛山各大商超。

菌株：HT-26、HT-17、HT-23、HT-11、HT-13、HT-15、HT-24為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；Staphylococcus urealyticus DSM 6718購(gòu)自DSM菌種保藏中心。

1.2 試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；SYBR Green Mix：Bio-Rad Laboratories；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：西安天隆科技有限公司；無(wú)酶水：上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；引物：安升達(dá)（南京）生命科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；全自動(dòng)核酸提取儀 西安天隆科技有限公司；熒光定量PCR儀 Bio-Rad Laboratories。

1.4 方法

1.4.1 樣本收集和菌株分離純化

從佛山各大商超購(gòu)買不同品牌及類型的即食肉制品共計(jì)65個(gè)，根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的方法對(duì)各樣本進(jìn)行菌落培養(yǎng)。逐一挑取培養(yǎng)皿上所有可見(jiàn)菌落并進(jìn)行平板劃線，將劃線后的平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，待形成可見(jiàn)菌落后繼續(xù)挑取1～2個(gè)單菌落進(jìn)行平板劃線。共重復(fù)3次平板劃線操作，在第3次劃線平板上各挑取1個(gè)單菌落進(jìn)行菌種鑒定、培養(yǎng)和保藏。

1.4.2 菌種測(cè)序和鑒定

分別取待鑒定菌株純培養(yǎng)液各10 mL，于12 000 r/min離心5 min，棄上清液后保留菌體沉淀，并將菌體沉淀樣本寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行細(xì)菌框架圖測(cè)序和分析。利用本地化BLAST對(duì)各分離株框架序列進(jìn)行比對(duì)分析，完成各分離株的初步菌種鑒定。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析和特異序列片段篩選

下載NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中科氏葡萄球菌和解脲葡萄球菌類別下的所有基因組，共計(jì)95個(gè)，與HT-26基因組序列一起進(jìn)行單拷貝直系同源核心基因分析。利用OrthoFinder 2軟件尋找96個(gè)基因組中的同源蛋白組，并提取出核心基因群、輔助基因群和菌株特異基因群序列。根據(jù)單拷貝核心基因中的單核苷酸多態(tài)性，利用MEGA 7軟件構(gòu)建最大似然樹(shù)。

對(duì)96個(gè)基因組中的蛋白編碼序列進(jìn)行TBLASTn比對(duì)檢索，篩選科氏葡萄球菌科氏亞種特異的編碼蛋白序列，一致性≥60%，E值＜1e-10。隨后將篩選得到的蛋白序列結(jié)果進(jìn)行TBLASTn在線比對(duì)驗(yàn)證，剔除出現(xiàn)在其他菌種中的同源結(jié)果序列后得到科氏葡萄球菌科氏亞種的特異序列片段。

1.4.4 熒光定量PCR檢測(cè)

利用全自動(dòng)核酸提取儀（GeneRotex 96）及其配套細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（西安天隆科技有限公司，貨號(hào)T031（XZHC））提取待檢樣本DNA，具體操作步驟和程序設(shè)置按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后將提取的DNA轉(zhuǎn)移至無(wú)菌無(wú)酶離心管中備用。將提取的DNA與對(duì)應(yīng)檢測(cè)引物按比例混合后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)設(shè)置3個(gè)平行，體系配比：SYBR Green Mix：5μL；上游引物F：0.5μL；下游引物R：0.5μL；無(wú)酶水：1μL；DNA模板：3μL。

以96孔板為檢測(cè)載體，待體系加裝完畢后進(jìn)行封膜，并通過(guò)瞬時(shí)離心使孔壁上的溶液流至底部。隨后將待檢測(cè)的96孔板放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)程序：95 ℃ 3 min

95 ℃ 10 s

65 ℃ 30 s循環(huán)40次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HT-26菌株的分離鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

從65個(gè)即食肉制品樣本中共分離純化得到40株菌株?；蚪M框架圖測(cè)序和比對(duì)結(jié)果表明31株（75%）屬于芽孢桿菌屬，4株（10%）屬于葡萄球菌屬，其中HT-26初步比對(duì)鑒定結(jié)果為科氏葡萄球菌。

對(duì)NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的50個(gè)包含HT-26在內(nèi)的科氏葡萄球菌（SC）基因組和46個(gè)解脲葡萄球菌（SU）基因組進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中形成了3個(gè)主要進(jìn)化簇：SU、SCC、SCB?？蚓€標(biāo)注的為本研究分離純化得到的科氏葡萄球菌HT-26，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上位于SCC進(jìn)化簇中，表明HT-26屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。

2.2 SCC的特異性分子標(biāo)識(shí)篩選

通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)分析找到了SCC亞種的特異性基因序列，這些特異性序列保守存在于所有SCC基因組中，但不存在于其他菌種（亞種）基因組中。共篩選得到4段SCC特異性序列（見(jiàn)表1），可作為SCC特異性快速檢測(cè)分子標(biāo)識(shí)的候選基因片段。基于Q1～Q4 4段序列，設(shè)計(jì)并合成了5對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物序列見(jiàn)表2。

利用上述5對(duì)引物對(duì)HT-26的DNA及陰性對(duì)照樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。

由表3和圖2可知，引物對(duì)P2和P4在HT-26 DNA樣本中的檢測(cè)靈敏度低，雖然P5在HT-26 DNA樣本中的檢測(cè)靈敏度高，但是其在陰性對(duì)照中存在非特異性擴(kuò)增，因此以上3對(duì)引物不可用于SCC的快速檢測(cè)。P1和P3均可實(shí)現(xiàn)陽(yáng)性樣本的靈敏檢測(cè)，且不存在非特異性擴(kuò)增，所以這兩對(duì)引物均可作為SCC快速檢測(cè)的候選引物。本研究選取檢測(cè)靈敏度更高的P3進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)驗(yàn)證。

2.4 SCC快速檢測(cè)引物的特異性驗(yàn)證

用2.3中篩選得到的P3分別檢測(cè)HT-26、SU DSM 6718、HT-17、HT-23、HT-11、HT-13、HT-15、HT-24和陰性對(duì)照的過(guò)夜純培養(yǎng)液核酸提取物，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4和圖3，僅HT-26出現(xiàn)擴(kuò)增曲線和Ct值，其他非SCC菌均無(wú)檢出，表明P3具有良好的SCC特異性，可用于SCC的快速檢測(cè)。

2.5 SCC快速檢測(cè)引物的檢測(cè)限

對(duì)HT-26純培養(yǎng)菌液進(jìn)行十倍梯度稀釋并提取DNA作為檢測(cè)模板，利用P3進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。各樣本菌液濃度和檢測(cè)Ct值見(jiàn)表5和圖4中A，檢測(cè)結(jié)果表明P3可有效檢測(cè)到27 CFU/mL及以上菌液濃度樣本，且Ct值與菌液濃度間存在較好的線性關(guān)系，R²＞0.99（見(jiàn)圖4中B），表明P3在SCC快速檢測(cè)中效果穩(wěn)定，最低檢測(cè)限可達(dá)27 CFU/mL。

2.6 即食肉制品中SCC的快速檢測(cè)

為驗(yàn)證P3是否能夠在即食肉制品這類具有復(fù)雜背景干擾的樣本中實(shí)現(xiàn)SCC的準(zhǔn)確檢測(cè)，本研究將HT-26純培養(yǎng)稀釋液反添加于無(wú)菌即食肉制品均質(zhì)中并進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)和qRT-PCR檢測(cè)，以無(wú)菌即食肉制品為陰性對(duì)照。平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示即食肉制品中HT-26反添加后菌液濃度為115 CFU/g，對(duì)該陽(yáng)性樣本進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)取樣和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，3次檢測(cè)均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線（見(jiàn)圖5），平均Ct值為33.70，SD=0.198，C.V.=0.59%，同時(shí)陰性對(duì)照樣本中無(wú)擴(kuò)增。以上結(jié)果表明，特異性引物P3可實(shí)現(xiàn)即食肉制品樣本中SCC的快速穩(wěn)定檢測(cè)，最低檢測(cè)限為115 CFU/g。

3 結(jié)論

本研究從65個(gè)市售即食肉制品樣本中分離得到一株科氏葡萄球菌并命名為HT-26，經(jīng)基因組測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析確定HT-26屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)分析找到了4個(gè)SCC特異性序列片段，并設(shè)計(jì)和篩選出了一對(duì)可用于SCC特異性快速檢測(cè)的qRT-PCR引物（F：5′-GATGCTCC-AGGGGAAGAGTT-3′；R：5′-ACTTCTTCTGCGTCG-TTTTTGT-3′）。該對(duì)引物在SCC純菌培養(yǎng)液中最低可檢測(cè)到27 CFU/mL菌液濃度樣本，在即食肉制品中最低檢測(cè)限為115 CFU/g，且可在4 h內(nèi)完成檢測(cè)，所需時(shí)間僅為傳統(tǒng)培養(yǎng)法（48 h）的8%，有助于高效監(jiān)控肉制品生產(chǎn)過(guò)程中各環(huán)節(jié)、物料、環(huán)境、人員等的SCC污染風(fēng)險(xiǎn)，加強(qiáng)食品安全檢測(cè)和監(jiān)督，保障產(chǎn)品安全。

除即食肉制品外，本研究開(kāi)發(fā)的SCC快速特異性qRT-PCR檢測(cè)引物也可應(yīng)用于其他食品相關(guān)產(chǎn)品和場(chǎng)景。近幾年，國(guó)內(nèi)學(xué)者從豬、鴨、雞、貂等不同畜禽源中均分離得到科氏葡萄球菌^[15-20]，除貂以外，豬、鴨和雞均為日常肉源，源頭污染可能會(huì)引發(fā)科氏葡萄球菌的食源性感染。因此，本研究成果可應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)，在幫助確認(rèn)病體禽畜微生物感染源的同時(shí)也可有效監(jiān)控食用肉源的微生物安全風(fēng)險(xiǎn)，從源頭上降低科氏葡萄球菌的食品污染風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，隨著健康消費(fèi)需求的升級(jí)，調(diào)味品行業(yè)也在不斷推陳出新。畜產(chǎn)動(dòng)物風(fēng)味天然濃縮提取物在逐漸替代化學(xué)合成物，多類復(fù)合調(diào)味醬中直接添加肉顆粒以增加風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，魚(yú)肉熬制的魚(yú)露、魚(yú)醬等調(diào)味品也為消費(fèi)者提供了更多選擇。此外，日漸火熱的預(yù)制菜行業(yè)也離不開(kāi)禽畜類肉制品。因此，當(dāng)今與禽畜漁業(yè)聯(lián)系更為緊密的調(diào)味品行業(yè)和新興預(yù)制菜行業(yè)也可將本研究成果應(yīng)用于相關(guān)原料、生產(chǎn)環(huán)境及產(chǎn)品中的科氏葡萄球菌風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控。

不同品類待測(cè)樣本的組分背景差異可能會(huì)對(duì)擴(kuò)增引物產(chǎn)生干擾，因此當(dāng)本研究所述的檢測(cè)引物不適用于某些待檢樣本時(shí)，亦可通過(guò)本研究所述的4個(gè)科氏葡萄球菌科氏亞種特異性片段篩選其他引物序列。

綜上所述，本研究通過(guò)比較基因組學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選得到了科氏葡萄球菌科氏亞種的特異性檢測(cè)分子標(biāo)識(shí)，為食品和調(diào)味品行業(yè)中該風(fēng)險(xiǎn)菌種的快速特異性檢測(cè)提供了可選方法和參考，有助于進(jìn)一步加強(qiáng)微生物風(fēng)險(xiǎn)把控，保障食品安全。

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