吳昕怡 田浩 朱志妍 王瀚墨 李雪瑞 劉秀嶶

摘要：腌制芥菜發(fā)酵周期長，發(fā)酵過程中易受微生物污染。因此，該研究以8個復(fù)配精油組合分別處理腌制芥菜，考察不同精油組合對腌制芥菜發(fā)酵過程中理化指標(biāo)（pH、總酸和還原糖）與微生物指標(biāo)（菌落總數(shù)、乳酸菌和酵母菌）的影響，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析，以期找到一個既不影響腌制芥菜正常發(fā)酵，又能抑制有害菌生長的最佳精油組合。研究結(jié)果表明，精油對腌制芥菜中乳酸菌繁殖的影響較小，且能夠顯著抑制酵母菌和其他微生物的生長（P＜0.05），保證腌制芥菜的品質(zhì)，最優(yōu)精油組合為B組：檸檬+香茅+肉豆蔻。該研究可為腌制芥菜的綠色加工提供數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞：腌制芥菜；復(fù)配精油組合；發(fā)酵過程；灰色關(guān)聯(lián)度；抑菌

中圖分類號：TS205.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0102-06

Effect of Essential Oil on Quality Indexes of Pickled Mustard

in Fermentation Process

WU Xin-yi， TIAN Hao， ZHU Zhi-yan， WANG Han-mo， LI Xue-rui， LIU Xiu-wei^*

（Institute of Agro-products Processing， Yunnan Academy of Agricultural Sciences，

Kunming 650221， China）

Abstract： The fermentation period of pickled mustard is long and it is susceptible to microbial contamination in the fermentation process. Therefore， eight combinations of compound essential oils are used to treat pickled mustard respectively， and the effects of different essential oil combinations on physicochemical indexes （pH， total acid and reducing sugar） and microbial indexes （total bacterial count， lactic acid bacteria and yeast） in the fermentation process of pickled mustard are investigated， and then grey correlation analysis is combined to find the optimal combination of essential oils which not only does not affect the normal fermentation of pickled mustard， but also inhibits the growth of harmful bacteria. The results show that essential oil has little effect on the propagation of lactic acid bacteria in pickled mustard， could significantly inhibit the growth of yeast and other microorganisms （P<0.05）， and could ensure the quality of pickled mustard. The optimal combination of essential oils is group B： lemon+citronella+nutmeg. This study can provide data support for the green processing of pickled mustard.

Key words： pickled mustard; compound essential oil combination; fermentation process; grey correlation;

anti-basteria

收稿日期：2023-12-07

基金項(xiàng)目：云南省科技廳重大科技專項(xiàng)（202202AE090017）

作者簡介：吳昕怡（1992—），女，助理研究員，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工。

*通信作者：劉秀嶶（1982—），女，副研究員，博士，研究方向：生物資源挖掘與利用。

芥菜（Brassica juncea）是十字花科蕓苔屬一年生草本植物，在全國各地均有栽培，年產(chǎn)量可達(dá)4 800萬噸^[1]，同時芥菜具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，我國通過大力推廣芥菜種植，有力地促進(jìn)了農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，助力農(nóng)戶增收^[2]。芥菜作為食用蔬菜的歷史悠久，在中國、美國、印度、日本和大多數(shù)歐洲國家都很受消費(fèi)者歡迎^[3]。芥菜因有辛辣味，作為新鮮蔬菜的消耗量很小，通常需要腌制加工后食用^[4]。我國蔬菜的腌制加工已經(jīng)擁有幾千年的歷史^[5]，腌制是常見的發(fā)酵加工方式之一，通過發(fā)酵可以去除食品中令人不愉快的感官物質(zhì)，并賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味^[6]。

發(fā)酵蔬菜一般由乳酸菌發(fā)酵獲得，是中國的傳統(tǒng)菜肴^[7]。傳統(tǒng)的腌制芥菜工藝發(fā)酵周期長^[8]，一般在發(fā)酵過程中會添加山梨酸鉀、焦亞硫酸鈉等食品添加劑或其他合成防腐劑來抑制微生物的生長繁殖^[4]。近年來，消費(fèi)者對食品安全的重視程度日益增加，越來越擔(dān)心合成防腐劑的安全問題和對健康的負(fù)面影響，使用天然防腐劑在食品加工產(chǎn)業(yè)變得越來越受歡迎^[9]。

植物精油具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗菌和抗病毒等^[10]，在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。許多植物精油可以替代合成防腐劑，用作肉類、肉制品、蔬菜、水果、乳制品的防腐劑，更加天然、環(huán)保且安全^[11-12]。已有研究顯示，在發(fā)酵蔬菜中加入紫蘇精油可以抑制有害菌的生長，有效改善發(fā)酵蔬菜的“生花”腐敗現(xiàn)象^[13]。而植物精油之間存在加性或協(xié)同作用，多種植物精油復(fù)配可顯著增加抗菌作用^[14]，但目前尚沒有關(guān)于復(fù)配精油在發(fā)酵蔬菜中的應(yīng)用研究。

本研究針對泡菜中“生花”腐敗問題，篩選GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中24種植物精油，隨機(jī)復(fù)配，制備了8個精油組合，研究精油在腌制芥菜發(fā)酵過程中對微生物的影響，同時通過測定pH、總酸、還原糖等品質(zhì)指標(biāo)，進(jìn)一步評價精油處理對腌制芥菜質(zhì)量的影響，使用灰色關(guān)聯(lián)度分析篩選最適精油組合，為篩選優(yōu)質(zhì)天然防腐抑菌材料、優(yōu)化腌制芥菜發(fā)酵工藝、研發(fā)腌制芥菜綠色加工技術(shù)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮芥菜、食鹽：市售；鼠尾草、薰衣草、茶樹、香櫞、肉豆蔻、檸檬香茅、姜、芫荽籽、香茅、百里香、佛手柑、山蒼子、冬青、胡蘿卜籽、白千層、紅桔、葡萄柚、肉桂、蒔蘿、牛至、丁香葉、丁香花苞、薄荷、芹菜籽精油：法國Florihana公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、MRS瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、四水合酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、硼砂、磷酸二氫鉀、苯酚（均為分析純）：廣東光華科技股份有限公司；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、3，5-二硝基水楊酸（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.100 0 mol/L）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY220型分析天平 日本島津公司；KQ5200E 型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XMT-DA型電熱恒溫水浴鍋 余姚市亞星儀器儀表有限公司；Spectrophotometer 1510酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腌芥菜制作

對照組芥菜：參照NY/T 3340—2018中的方法腌制，將新鮮芥菜洗凈后放入泡菜壇中，用水煮沸后放涼，加入食鹽，配制成含鹽量為8%的鹽水，向泡菜壇中加入鹽水，鹽水與芥菜的質(zhì)量比為2∶1，自然發(fā)酵90 d。處理組芥菜：在對照組芥菜腌制方法的基礎(chǔ)上，添加不同組合精油，每種精油的添加量均為0.01%（以鹽水質(zhì)量計(jì)），添加精油的組合見表1。每隔15 d取樣一次，90 d內(nèi)共取樣6次，獲得樣本162份，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 微生物指標(biāo)測定

菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》中的方法測定；乳酸菌：參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》中的方法測定；酵母菌：參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中的方法測定。

1.3.3 理化指標(biāo)測定

pH值：采用pH計(jì)直接測定；總酸含量：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的直接滴定法測定；亞硝酸鹽含量：參照GB 5009.33—2010《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法測定；還原糖含量：參照GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的3，5-二硝基水楊酸法測定。

1.4 灰色關(guān)聯(lián)度分析

為消除原始數(shù)據(jù)的量綱差異影響，需要對數(shù)據(jù)做歸一化處理。數(shù)據(jù)歸一化處理使用均值法，按公式（1）計(jì)算：

分別確定比較序列（精油處理組A～H）和參考序列（對照組CK），并分別計(jì)算各評價對象比較序列與參考序列的絕對差值，按公式（2）計(jì)算：

分別確定兩級最小差值和兩級最大差值，按公式（3）、公式（4）計(jì)算：

Δmax=maximaxkx₀（k）－x_i（k）。（4）

然后計(jì)算每個特征序列與參考序列對應(yīng)元素的相關(guān)系數(shù)，系數(shù)越小，相關(guān)系數(shù)差異越大，區(qū)分能力越強(qiáng)，ρ通常為0.5，按公式（5）計(jì)算：

將關(guān)聯(lián)系數(shù)集中為一個值，即求其平均值，得到關(guān)聯(lián)度，按公式（6）計(jì)算：

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別采用Prism 5、OriginPro 2021對6個指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油對腌制芥菜發(fā)酵過程中微生物指標(biāo)的影響

2.1.1 菌落總數(shù)

圖1 菌落總數(shù)的變化

Fig.1 Change of total bacterial count

由圖1可知，腌制芥菜發(fā)酵過程中，菌落總數(shù)的變化以15 d為一個周期，先升高后降低之后又升高，在第15天時菌落總數(shù)達(dá)到峰值，該結(jié)果與Rao等^[15]在四川泡菜發(fā)酵過程中所獲得的結(jié)果相似，發(fā)酵第16天時，泡菜中菌落總數(shù)達(dá)到峰值后下降，從第32天開始，泡菜水中的微生物總數(shù)又再次升高；其中精油處理組A、D、F、H在發(fā)酵全過程中的菌落總數(shù)均低于對照組（CK）；在第90天發(fā)酵結(jié)束時，CK的菌落總數(shù)為（5.43±0.005 7） lg CFU/mL，精油處理組A～H的菌落總數(shù)均顯著低于CK（P＜0.05），菌落總數(shù)從高到低為G>C>E>A>H>F>D>B，其中最高的是G組，菌落總數(shù)為（5.31±0.035） lg CFU/mL，最低的是B組，菌落總數(shù)為（3.93±0.036） lg CFU/mL，這可能是由于精油具有抑菌性，添加精油能夠抑制發(fā)酵過程中細(xì)菌的生長^[16]，其中B組在腌制芥菜發(fā)酵過程中抑菌效果最優(yōu)。

2.1.2 乳酸菌

由圖2可知，發(fā)酵初期，添加精油會顯著抑制乳酸菌的生長；發(fā)酵第30天時，精油處理組A～H與對照組（CK）相比，乳酸菌數(shù)較少，但此時處理組與對照組之間乳酸菌數(shù)差異已經(jīng)不顯著（P>0.05）；發(fā)酵后期，至第75天時，精油處理組A、B、C、E、G的乳酸菌數(shù)均顯著高于對照組（CK），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在第90天發(fā)酵結(jié)束時，精油處理組A～H的乳酸菌數(shù)在（5.33±0.051）～（5.73±0.023） lg CFU/mL，除C組外，均高于對照組（CK），這可能是由于精油對乳酸菌有亞致死作用^[17]，添加精油會顯著抑制發(fā)酵初期微生物的生長，但隨著發(fā)酵時間的延長，精油造成的影響減弱，腌制芥菜發(fā)酵體系中的乳酸菌進(jìn)入細(xì)胞繁殖階段，整個發(fā)酵過程中逐漸趨于穩(wěn)定，至發(fā)酵結(jié)束時，添加精油的處理組中乳酸菌數(shù)更高，因此，適當(dāng)添加精油對產(chǎn)品發(fā)酵過程中乳酸菌的影響較小。

2.1.3 酵母菌

酵母菌是引起發(fā)酵蔬菜變質(zhì)的主要微生物之一^[18]，酵母菌的過度生長會降低消費(fèi)者對發(fā)酵產(chǎn)品的感官滿足感^[19]。由圖3可知，發(fā)酵初期，添加精油可以極顯著抑制酵母菌的生長，在第15天時，對照組（CK）的酵母菌數(shù)為（4.78±0.016） lg CFU/mL，而精油處理組B、C、D、H中均未檢出酵母菌，A、E、F、G組中檢出酵母菌，但均極顯著低于CK（P＜0.01）；隨著發(fā)酵時間的延長，酵母菌出現(xiàn)變化，精油處理組A、B、D、F在發(fā)酵全過程中的酵母菌數(shù)均低于CK，尤其是B組與D組，在90 d的發(fā)酵周期中，酵母菌數(shù)均極顯著低于CK（P＜0.01）；在第90天發(fā)酵結(jié)束時，除C組外，所有精油處理組的酵母菌數(shù)均低于對照組（CK），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，添加精油可以顯著抑制腌制芥菜發(fā)酵過程中酵母菌的生長，防止微生物腐敗，具有開發(fā)為酵母菌抑制劑的可能性。

2.2 精油對腌制芥菜發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的影響

2.2.1 pH值

pH值是判斷泡菜質(zhì)量的指標(biāo)之一，由圖4可知，CK與精油處理組A～H相比，pH值變化趨勢基本一致。從發(fā)酵開始到第15天，pH值顯著降低，在3.43～3.31之間，此時CK與精油處理組相比，pH值差異不顯著（P>0.05）；發(fā)酵第30天時，pH值略微增加，30 d后相對穩(wěn)定。在第75～90天時，pH值又緩慢下降，最終CK與精油處理組A～H的pH值均在4.00以下，且差異不顯著（P>0.05）。在東北酸菜和四川泡菜等發(fā)酵蔬菜的研究中，也存在與本研究相同的變化趨勢，Zhou等^[20]研究發(fā)現(xiàn)東北酸菜在發(fā)酵初期pH值快速下降，之后出現(xiàn)小幅回升；Rao等^[15]在四川泡菜發(fā)酵過程中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，在發(fā)酵60 d后，泡菜的pH值略微增加。綜合上述pH值結(jié)果，推測腌制芥菜的發(fā)酵分為兩個階段：第一階段為酸化期，可能是乳酸和其他有機(jī)酸的產(chǎn)量增加導(dǎo)致pH值顯著下降；第二階段為穩(wěn)定期，pH值基本保持平穩(wěn)，至發(fā)酵結(jié)束時，pH值在4.00以下，這與Palani等^[21]在酸菜發(fā)酵過程中的研究結(jié)果相近。

2.2.2 總酸

酸味是腌制芥菜的主要風(fēng)味，也是其重要的特色之一^[22]?？偹岵粌H是發(fā)酵蔬菜的重要生產(chǎn)指標(biāo)，也是判斷其成熟度的重要參數(shù)^[23]。由圖5可知，精油處理組A～H與對照組變化趨勢基本一致，且在整個發(fā)酵周期內(nèi)，精油處理組A、B、E的總酸含量始終高于對照組（CK）。以上研究結(jié)果表明，添加精油不會對腌制芥菜的pH值造成影響，也不會影響腌制芥菜的正常發(fā)酵。由于精油組合不同，所含有的生物活性物質(zhì)不同，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸及其含量不同，因此導(dǎo)致總酸含量不同?？偹岷康纳唢@著加速了發(fā)酵過程，表明添加精油處理組A、B、E發(fā)酵的芥菜可能具有更高的酸化性能，而更短的酸化過程可以加速發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)，減少商業(yè)損失，降低生產(chǎn)成本^[24]。

2.2.3 還原糖

還原糖含量可作為發(fā)酵蔬菜成熟、微生物生長和風(fēng)味變化的指標(biāo)^[25]，微生物利用還原糖作為營養(yǎng)物質(zhì)，將其分解成乳酸、酒精和二氧化碳，產(chǎn)生多種成分^[26]。由圖6可知，精油處理組A在腌制芥菜發(fā)酵全過程中還原糖含量始終高于對照組（CK）；發(fā)酵第90天時，精油處理組A～H的還原糖含量均高于CK，其中還原糖含量最高的是B組，達(dá)到0.134 6 mg/g，顯著高于CK（P＜0.05）。這可能是由于微生物的生長繁殖需要利用還原糖作為碳源^[27]，而精油具有抗菌活性，添加精油抑制了腌制芥菜發(fā)酵過程中微生物的生長，有效保留了還原糖含量。范龍泉等^[28-29]使用黃芪提取液、山楂提取液分別處理發(fā)酵蔬菜時也發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中添加具有抑菌功能的物質(zhì)可以有效保留發(fā)酵蔬菜中的還原糖。

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析

灰色關(guān)聯(lián)度分析中，關(guān)聯(lián)系數(shù)越接近于1，表明參考組和處理組越傾向于一致；相反，關(guān)聯(lián)系數(shù)越接近于0，表明參考組和處理組趨向不同^[30]。本研究中以對照組（CK）作為參考組，計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)，結(jié)果見圖7。

pH與總酸通常作為判斷發(fā)酵蔬菜質(zhì)量的標(biāo)志^[31]，由圖7中a可知，pH關(guān)聯(lián)系數(shù)排名前三的分別是F（0.753）、B（0.746）與G（0.722），總酸關(guān)聯(lián)系數(shù)排名前三的分別是H（0.842）、D（0.753）與B（0.733），關(guān)聯(lián)系數(shù)越大，說明精油處理組與對照組（CK）變化趨勢越一致，精油處理對pH與總酸的影響越小，對腌制芥菜質(zhì)量的影響也越??；還原糖的關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.6，表明精油處理組A～H與對照組（CK）相比，還原糖含量變化趨勢基本一致，精油處理不會影響腌制芥菜發(fā)酵過程中還原糖的變化。

大多數(shù)發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品的生產(chǎn)都高度依賴天然乳酸菌^[22]，因此為了保證腌制芥菜的正常發(fā)酵，不能影響乳酸菌的正常生長繁殖，由圖7中b可知，與對照組（CK）相比，精油處理組A～H的關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.7，說明乳酸菌的動態(tài)變化基本一致，表明添加精油處理不會影響腌制芥菜中乳酸菌的生長，也不會影響芥菜的正常發(fā)酵；菌落總數(shù)檢測的是細(xì)菌總數(shù)，包含可能影響芥菜正常發(fā)酵的某些細(xì)菌；酵母菌數(shù)量的增加會對發(fā)酵蔬菜的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響^[32]，尤其是在發(fā)酵后期。因此，與對照組（CK）相比，菌落總數(shù)和酵母菌的關(guān)聯(lián)系數(shù)越低，表明精油處理組與CK的變化趨勢越不同，對兩種指標(biāo)的抑制性越好，越有益于腌制芥菜的正常發(fā)酵，由圖7中b可知，菌落總數(shù)的關(guān)聯(lián)系數(shù)排名前三的分別是B（0.548）、H（0.565）與F（0.581），酵母菌的關(guān)聯(lián)系數(shù)排名前三的分別是B（0.429）、D（0.450）與A（0.655），因此精油處理組B效果最優(yōu)。

3 結(jié)論

本研究隨機(jī)制備了8個復(fù)配精油組合，考察了精油處理對腌制芥菜發(fā)酵過程中菌落總數(shù)、乳酸菌、酵母菌、pH、總酸和還原糖的影響，并使用灰色關(guān)聯(lián)度法進(jìn)一步進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：8個精油組合中，發(fā)酵結(jié)束時pH值均在4.00以下，其中精油處理組F、B、G對pH值的影響最??；在整個發(fā)酵周期內(nèi)，精油處理組A、B、E的總酸含量始終高于對照組（CK），精油處理組H、D、B總酸積累的趨勢最接近CK；發(fā)酵結(jié)束時，精油處理組A～H的還原糖含量均高于CK，且關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.6，表明精油處理不會影響腌制芥菜發(fā)酵過程中還原糖的變化；微生物指標(biāo)中，除C組外，精油處理組A～H的乳酸菌數(shù)均高于對照組（CK），且所有處理組的關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.7，表明精油處理不會影響腌制芥菜中乳酸菌的生長，也不會影響腌制芥菜的正常發(fā)酵；8個精油組合處理中，菌落總數(shù)均顯著低于CK（P＜0.05），其中B組最低，表明精油處理可以顯著抑制腌制芥菜發(fā)酵過程中細(xì)菌的生長；酵母菌會影響發(fā)酵蔬菜的風(fēng)味，發(fā)酵過程中需要抑制其生長，而精油處理可以顯著抑制酵母菌生長，在整個發(fā)酵周期中，抑制效果最優(yōu)的是B組。上述研究結(jié)果證明，精油處理不會影響腌制芥菜的正常發(fā)酵，B組（檸檬+香茅+肉豆蔻）精油組合效果最優(yōu)，可以考慮作為合成防腐劑的替代品，在腌制芥菜加工中推廣應(yīng)用。

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