許光亞 周森林 周文月 楊明龍 胡鐘姣 時政

收稿日期：2023-04-18

基金項目：成都大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/附屬醫(yī)院創(chuàng)新團隊項目（CDFYCX202208）；四川省科技廳農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2022NZZJ0015）；2020年龍泉驛英才計劃C類創(chuàng)新人才計劃項目（90）；成都大學(xué)附屬醫(yī)院院級課題項目（Y202232、Y202234）

作者簡介：許光亞（1982—），男，博士，副教授，從事病理學(xué)與病理生理學(xué)研究.Email：guangyaxu@foxmail.com

通信作者：時政（1983—），男，博士，教授，從事天然產(chǎn)物活性研究.Email：drshiz1002@hotmail.com

摘要：研究梔子豉湯顆粒對失眠癥的作用并探索相關(guān)機制.通過建立大鼠失眠模型，以地西泮為陽性對照，研究梔子豉湯顆粒對大鼠神經(jīng)遞質(zhì)（5HT、DA和NE）與炎性因子（IL1β、IL6和TNFα）含量的影響.將SPF級SD雄性大鼠36只，隨機分成6組，分別為對照組、模型組、地西泮組、梔子豉湯顆粒低劑量組、梔子豉湯顆粒中劑量組和梔子豉湯高劑量組，每組6只.造模完成后，分別給予相應(yīng)濃度藥物，對照組和模型組給予同體積的生理鹽水，觀察各組大鼠的行為學(xué)變化及DA、5HT、NE、IL1β、IL6和TNFα水平.曠場實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠的移動距離顯著增加（P<0.05），站立次數(shù)及糞便顆粒數(shù)增加不明顯（P>0.05）；與模型組比較，地西泮組和梔子豉湯顆粒高劑量組移動距離和站立次數(shù)極顯著減少（P<0.01）；各組大鼠的糞便顆粒數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）.與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中的NE、DA、IL6、IL1β和TNFα含量均極顯著升高（P<0.01），5HT含量極顯著降低（P<0.01）；與模型組對比，地西泮組和梔子豉湯顆粒高劑量組均能極顯著降低大鼠海馬組織中NE、DA和TNFα含量（P<0.01），顯著升高5HT含量（P<0.05）.結(jié)果表明，梔子豉湯顆粒可明顯改善模型大鼠的失眠病癥，其對大鼠腦內(nèi)5HT、NE、DA、IL6、IL1β和TNFα的調(diào)節(jié)作用可能是其治療失眠的作用機制.

關(guān)鍵詞：梔子豉湯；失眠；神經(jīng)遞質(zhì)；炎性因子

中圖分類號：R256.23

文獻標(biāo)志碼：A

0引言

失眠是指個體對睡眠時間和（或）質(zhì)量不滿意導(dǎo)致非睡眠時間的社會功能受到影響的主觀體驗.失眠受到不規(guī)律的睡眠周期和疾病等多種因素的影響［1］.近年來，科研人員從神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、下丘腦—垂體—腎上腺（HPA）軸功能障礙及褪黑素系統(tǒng)功能下降等方面探討了失眠發(fā)生的機制［2-3］.目前，口服安眠藥和心理療法是臨床實踐中的主要治療方法，盡管失眠的癥狀有了明顯改善，但停藥后很容易出現(xiàn)耐藥性和復(fù)發(fā)等問題.因此，急需尋求一種安全、有效與不良反應(yīng)少的治療方法［4］.

中醫(yī)認(rèn)為，人體肝失疏泄且氣機郁滯就會出現(xiàn)氣機升降，從而很容易受氣血生化不足因素的影響而心失所養(yǎng)，導(dǎo)致失眠.故中醫(yī)以整體視野為指導(dǎo)，進行辨證施治，也是治療失眠有效的替代療法之一.中藥治療失眠的作用機制，主要是通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)、影響睡眠相關(guān)細胞因子及改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮作用［5-8］.梔子豉湯最早記載于張仲景所著《傷寒雜病論》，由梔子和淡豆豉2味中藥組成，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用其治療熱擾胸膈之不寐［9］.方中梔子清熱以除煩，淡豆豉宣散表邪，二藥配伍，共奏清宣郁熱之功［10］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證實，梔子豉湯治療各種類型的失眠療效確切［11］，然而其治療失眠的機制不明確.基于此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，將梔子豉湯湯劑制備成顆粒，探討其治療失眠的作用機制，并進行初步的藥效學(xué)評價，為梔子豉湯顆粒治療失眠的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為探索中藥治療失眠的藥理機制和治療方法的改造提供參考.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器

JD20002型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；XRXZ301型大鼠曠場實驗分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）；Pico17型高速冷凍離心機、MK3型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；DZBS50型制冰機（江蘇白雪電器股份有限公司）；DH4000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）.

1.1.2試劑與試藥

對氯苯丙氨酸（PCPA），購自Sigma公司；大鼠腫瘤壞死因子α（TNFα）試劑盒、大鼠白細胞介素1β（IL1β）試劑盒、大鼠白細胞介素6（IL6）試劑盒、大鼠5羥色胺（5HT）試劑盒、大鼠多巴胺（DA）試劑盒、大鼠去甲腎上腺素（NE）試劑盒，均購自上海江萊生物科技有限公司；地西泮片，購自山東信誼制藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液，購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；梔子豉湯顆粒為實驗室自制.

1.1.3動物

SPF 級SD雄性大鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量為（200±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（湘）20190004.在（25±2）℃的環(huán)境溫度、相對濕度50%±5%和12/12 h的明暗循環(huán)中適應(yīng)1周，期間可自由飲食與攝水.

1.2方法

1.2.1制藥

按照3∶2的比例稱取梔子和淡豆豉，溶劑用量為8～11倍量水，提取時間為30～84 min，提取次數(shù)為2次；濃縮工藝為減壓濃縮（溫度80 ℃，真空度0.08～0.09 MPa）；干燥工藝為減壓干燥（溫度80 ℃，真空度0.08～0.09 MPa）；成型工藝為浸膏粉與乳糖質(zhì)量比為1∶2，85%乙醇為潤濕劑，用量為30%，制粒、干燥、整粒，即得［12］.

1.2.2造模與分組

大鼠適應(yīng)7 d后，隨機分成６組，分別為對照組、模型組、地西泮組、梔子豉湯顆粒低劑量組、梔子豉湯顆粒中劑量組和梔子豉湯顆粒高劑量組，每組6只.除對照組外，其余各組大鼠每日上午 8：00～9：00腹腔注射PCPA 450 mg/kg，連續(xù)注射3 d.對照組在同等時間下，腹腔注射與PCPA同體積的0.9%氯化鈉注射液.當(dāng)大鼠出現(xiàn)自主活動的站立次數(shù)明顯增多，晝夜節(jié)律失調(diào)，睡眠時間顯著減少直至完全消失，同時興奮性和攻擊性也明顯增強時，表明模型已經(jīng)成功建立.

1.2.3給藥

造模完成后，予以灌胃治療7 d，大鼠按照與人的等效劑量比6.3進行給藥（正常人體質(zhì)量按60 kg計）［13］.其中，對照組和模型組連續(xù)7 d各給予0.9%氯化鈉注射液，陽性組給予地西泮1 mg/kg，梔子豉湯顆粒低劑量組給藥量為0.93 g/kg，梔子豉湯顆粒中劑量組給藥量為1.86 g/kg，梔子豉湯顆粒高劑量組給藥量為3.72 g/kg.

1.2.4曠場實驗

實驗?zāi)┐谓o藥結(jié)束后60 min，將大鼠放置于曠場實驗箱正中央適應(yīng)1 min，并記錄每只大鼠在接下來的5 min內(nèi)的移動距離、站立次數(shù)及糞便顆粒數(shù).在2次實驗之間，需使用75％乙醇清洗曠場實驗箱內(nèi)壁及底面，以避免上一只大鼠留下的氣味對下一次實驗造成影響.待實驗箱完全晾干后，再進行下一次實驗.

1.2.5標(biāo)本采集及檢測

曠場實驗結(jié)束后，麻醉并斷頭處死大鼠，取出大鼠大腦，分離得到海馬組織.取大鼠海馬組織，稱重，加入9倍生理鹽水勻漿，勻漿液于4 ℃，10 000×g 離心20 min，取上清液，采用相應(yīng)試劑盒檢測海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)5HT、DA和NE，以及炎性因子IL1β、IL6和TNFα含量.

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

各組計量資料的表現(xiàn)將以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進行表示.采用GraphPad Prism６軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對多組間樣本均數(shù)進行比較時，采用單因素方差分析.在此過程中，P<0.05的結(jié)果將被視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1顆粒制備成功

根據(jù)“1.2.1”項下方法制得梔子豉湯顆粒，符合2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）四部通則0104顆粒劑項下的要求，包括性狀、粒度、水分和溶解性等方面的要求；根據(jù)2020年版《中國藥典》一部中各藥味項下的薄層色譜鑒別方法及相關(guān)參考文獻，對梔子豉湯顆粒中的各藥材進行定性鑒別，主要包括梔子中的梔子苷和豆豉中的大豆苷元的鑒定，最終成品均檢測出對應(yīng)的指標(biāo)性物質(zhì).

2.2一般狀態(tài)

在實驗過程中，大鼠均未出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象.正常大鼠在持續(xù)3 d注射PCPA后，明顯出現(xiàn)興奮狀態(tài)，對聲音的活動性和敏感性增加，晝夜節(jié)律消失，白天躁動不安，而對照組大鼠晝夜節(jié)律正常.經(jīng)過地西泮和梔子豉湯顆粒干預(yù)后，與模型組比較，失眠模型大鼠的睡眠—覺醒節(jié)律開始恢復(fù)，攻擊性逐漸下降，精神狀態(tài)得到明顯改善.表明梔子豉湯顆粒在一定程度上改善了失眠模型大鼠的一般精神狀態(tài).

2.3行為學(xué)變化

曠場實驗的整體數(shù)據(jù)見表1，具體的數(shù)據(jù)比較柱狀圖如圖1～圖3所示.與對照組比較，模型組的移動距離顯著增加（P<0.05），站立次數(shù)與糞便顆粒數(shù)增加不明顯（P>0.05）；與模型組比較，地西泮組和梔子豉湯顆粒高劑量組的移動距離和站立次數(shù)均極顯著減少（P<0.01）；各組大鼠的糞便顆粒數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）.

2.4神經(jīng)遞質(zhì)含量的比較

不同組別失眠大鼠模型海馬區(qū)組織中DA、5HT和NE的含量數(shù)據(jù)見表2，具體的數(shù)據(jù)比較柱狀圖如圖4～圖6所示.與對照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)組織中DA和NE含量極顯著升高（P<0.01），而5HT的含量則極顯著降低（P<001）；相較于模型組，地西泮組和梔子豉湯顆粒高劑量組大鼠海馬區(qū)組織內(nèi)的DA含量極顯著降低（P<0.01），梔子豉湯顆粒中劑量組大鼠海馬區(qū)組織內(nèi)的DA含量顯著降低（P<0.05）；地西泮組和梔子豉湯顆粒高劑量組大鼠海馬區(qū)組織內(nèi)的5HT含量顯著升高（P<005）；地西泮組、梔子豉湯顆粒中劑量組和梔子豉湯顆粒高劑量組大鼠海馬區(qū)組織內(nèi)的NE含量極顯著降低（P<0.01）.

2.5炎性因子含量的比較

不同組別失眠大鼠模型海馬組織中IL6、IL1β和TNFα含量數(shù)據(jù)見表3，具體的數(shù)據(jù)比較柱狀圖如圖7～圖9所示.與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中IL6、IL1β和TNFα含量均極顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，地西泮組大鼠海馬組織內(nèi)的IL6和TNFα含量極顯著降低（P<0.01），IL1β含量顯著降低（P<0.05）；梔子豉湯顆粒中劑量組IL6和TNFα含量均顯著降低（P<0.05）；梔子豉湯顆粒高劑量組IL6含量顯著降低（P<0.05），TNFα含量極顯著降低（P<0.01）.

3討論

梔子豉湯在臨床使用過程中存在服用劑量大、周期長、不易攜帶和儲存不適應(yīng)現(xiàn)代化生活需要等缺點.以上述問題為出發(fā)點，本課題組借助現(xiàn)代制藥工藝和手段來篩選和優(yōu)化制備工藝，制備了梔子豉湯顆粒劑，并建立科學(xué)的質(zhì)量控制方法.目前，動物失眠模型建立的方法主要有物理法和化學(xué)制劑刺激法等.其中，物理造模法包括強迫運動法、旋轉(zhuǎn)圓筒睡眠剝奪法、水平臺環(huán)境法和水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法等，而化學(xué)制劑刺激法是采用腹腔或皮下注射藥物，如PCPA和N甲基D天冬氨酸（NMDA）等進行睡眠剝奪［14-15］.PCPA是一種色氨酸羥化酶抑制劑，能夠選擇性地作用于色氨酸羥化酶，阻礙和耗竭腦內(nèi)5HT的合成，導(dǎo)致睡眠晝夜節(jié)律消失，進而導(dǎo)致失眠［16］.與其他建模方法相比，采用PCPA誘導(dǎo)建模的方法周期短，目標(biāo)明確，失眠特征顯著，適用于失眠癥藥物的早期篩選，因而被廣泛用于建立失眠模型.因此，本研究使用PCPA誘導(dǎo)的失眠癥大鼠模型來評估梔子豉湯顆粒對失眠的影響和可能的作用機制.

在失眠模型研究中，公認(rèn)的觀察指標(biāo)是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，如DA、5HT和NE等，在一定程度上能夠反映失眠癥狀是否得到改善.研究顯示，失眠模型大鼠處于應(yīng)激狀態(tài)，興奮性遞質(zhì)DA的水平會明顯升高［17］.5HT是存在于哺乳動物組織中的一種神經(jīng)遞質(zhì)，特別是在大腦皮層和突觸中，增加腦內(nèi)5HT的含量可以促進睡眠的發(fā)生［18-19］.NE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要負責(zé)興奮和覺醒功能的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其與快波睡眠有關(guān)，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活性來影響睡眠—覺醒周期，從而對人體的睡眠狀態(tài)產(chǎn)生影響［20］.在實驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠注射PCPA后，海馬組織中DA和NE含量明顯升高，5HT含量明顯下降，給予藥物治療后能逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo).

IL1β、IL6和TNFα是與睡眠調(diào)節(jié)相關(guān)的關(guān)鍵炎性因子，能夠參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理睡眠的調(diào)節(jié)［21-22］.有研究者對梔子豉湯治療失眠的成分使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法進行了預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明，梔子苷和染料木素等活性成分是梔子豉湯發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵，這些活性成分作用于IL6、TNF、IL1β和ESR1等核心靶標(biāo)，然后通過神經(jīng)活性配體和受體相互作用、MAPK信號通路及TNF因子信號通路等多條通路對失眠進行治療［23］，故將這些炎性因子作為梔子豉湯顆粒治療失眠模型大鼠的評價指標(biāo).可以看出，高劑量和中劑量的梔子豉湯顆粒均能降低失眠模型大鼠海馬組織中IL1β、IL6和TNFα的水平，驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分結(jié)果.

梔子豉湯顆?？擅黠@改善失眠模型大鼠的一般狀態(tài)，本研究結(jié)果也表明梔子豉湯顆粒對大鼠腦內(nèi)5HT、NE、DA、IL6、IL1β和TNFα的調(diào)節(jié)作用可能是其治療失眠的作用機制，同時通過對比地西泮組和梔子豉湯顆粒組大鼠的神經(jīng)遞質(zhì)和炎性因子的變化，發(fā)現(xiàn)梔子豉湯顆粒對各類神經(jīng)遞質(zhì)和炎性因子的影響與地西泮的作用相當(dāng)甚至更強，這也表明梔子豉湯顆粒擁有足夠的利用價值，也為梔子豉湯顆粒的進一步開發(fā)研究提供理論依據(jù).

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（責(zé)任編輯：伍利華）