李佳華 曹晨曦 陳振偉

結直腸癌（CRC）是導致全球癌癥患者死亡的第二大癌癥［1］。針對于結直腸癌患者的治療主要包括內(nèi)鏡和手術切除、化學治療、靶向治療、放療和免疫治療等。30%～50%的患者對結直腸癌進行根治性治療后出現(xiàn)復發(fā)［2］。結直腸癌的診斷主要依靠影像學檢查、腫瘤標志物和組織活檢。但影像學檢查昂貴費時且發(fā)現(xiàn)時較晚，傳統(tǒng)腫瘤標志物則具有滯后性且靈敏度和特異度均較低。病理活檢是診斷結直腸癌的“金標準”，但具有侵入性、組織取樣受病灶位置所限的特點，單次活檢通常不能反映結直腸癌的異質性，尤其是對于伴有遠處轉移的患者。近年來，液體活檢逐漸興起，與組織活檢相比，液體活檢技術能更好反映腫瘤異質性，便于重復檢測，還可以在分子水平上進行全面的實時監(jiān)測，了解患者在疾病全過程中的腫瘤負荷和基因變化，也有利于后續(xù)治療方案的選擇和調(diào)整，具有廣泛的臨床應用價值及應用前景。

1 液體活檢的概念

“液體活檢”一詞是由PANTEL和ALIX-PANABIERES最先提出的，用以定義血液中反映腫瘤特定信息的標志物［3］。液體活檢主要通過無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式對患者的血液、糞便、尿液和腦脊液等體液進行取樣，其檢測對象主要是循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體等。液體活檢克服了腫瘤異質性，可以實時監(jiān)測腫瘤進展、復發(fā)或治療反應［4］。隨著檢測技術的逐漸成熟，液體活檢有望進入一個新時代。

2 檢測對象及技術

2.1 循環(huán)腫瘤細胞（CTC） CTC是指在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，從腫瘤原發(fā)灶或轉移灶脫落并進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞，能在DNA、RNA和蛋白質水平上提供腫瘤相關信息［5］。然而，當CTC脫離病灶后易發(fā)生表型變化，易受到機械因素、藥物因素和免疫系統(tǒng)的影響而被損傷破壞，僅有少數(shù)細胞可以存活，且大小、形態(tài)不一，難以被檢測和計數(shù)［6］。

目前CellSearch儀器是當今用于富集和分析CTC的主要方法，已獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的授權，可用于結直腸癌中的CTC檢測［7］。隨著技術的進步，納米技術提高了檢測CTC的靈敏度和特異性。在此基礎上，有研究者構建了一種具有特異性捕獲和非破壞性釋放癌細胞雙重功能的生物芯片，該芯片可以高效捕獲的CTC，且對細胞活力損傷?。?］。此外，一種可以快速檢測CTC的微流控系統(tǒng)應運而生。與CellSearch系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有血量、時間和成本的優(yōu)勢，且對細胞活性無影響［9］。LEE等［10］回顧了基于納米技術的液體活檢的應用，進一步證明在腫瘤監(jiān)測和治療的臨床實踐方面具有可行性。

2.2 循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA） 細胞游離DNA（cfDNA）是細胞壞死和凋亡釋放到外周血中并游離于細胞外的高度片段化的DNA片段，可存在于人體的各種體液中，如血液、糞便、尿液、腦脊液和胸腔積液［11］。ctDNA是主要來源于腫瘤細胞死亡過程中釋放到人體血液循環(huán)中，且具有腫瘤特異性的分子特征、編碼腫瘤細胞的DNA片段，屬于cfDNA的一種類型，約占0.01%～5.00%［12］。雖然ctDNA具有2 h的半衰期，但其在進入血液循環(huán)后會迅速被清除。

目前檢測ctDNA的技術包括聚合酶鏈式反應（PCR）技術和二代測序（NGS）技術。PCR技術包括等位基因特異性突變擴增系統(tǒng)PCR（ARMS）、肽核酸鉗制PCR、數(shù)字PCR（dPCR）和微珠乳化擴增技術等［13］。NGS與PCR技術不同，NGS可以檢測大量突變基因，其能同時對上百萬個DNA模板的序列進行測序，并且能夠快速分析多個基因組靶點和突變［14］。在最近的一項薈萃分析中，比較dPCR、ARMS和NGS對結直腸癌患者cfDNA中KRAS突變的診斷準確性，二代測序總體上有更高的準確性［15］。

2.3 外泌體 外泌體是一種超微膜性囊泡，具有脂質雙膜，可由淋巴細胞、肥大細胞以及腫瘤細胞分泌，廣泛存在于各種體液中，如血液、尿液、唾液、腹腔積液等［16］。外泌體可攜帶多種生物活性物質，包括蛋白質、核酸和脂質等物質，這些物質參與外泌體的抗原提呈、膜轉運和融合，同時也參與較多生理、病理過程［17］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細胞來源的外泌體可促進腫瘤微環(huán)境形成，同時增強腫瘤的侵襲與轉移能力［18］。

目前外泌體的提取方法主要基于物理學（密度和大?。┖蜕飳W特性等，常用的有離心法（差速離心法、超速離心法、密度梯度離心法）、尺寸排阻色譜法、免疫親和捕獲法和沉淀法等［16］。除分離方法外，外泌體檢測方法還包括掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白質印跡法（WB）、表面等離子體共振法（SPR）、動態(tài)光散射法（DLS）、納米顆粒跟蹤分析法（NTA）等［17-18］。

3 臨床應用

3.1 早期診斷 早期診斷結直腸癌可指導臨床及時改變治療策略，延長生存周期。目前結直腸癌的診斷方法主要依靠影像學檢查、傳統(tǒng)腫瘤標志物和組織活檢，但上述方法具有各自的局限性，需要一種能夠早期診斷結直腸癌并實時監(jiān)測腫瘤復發(fā)、轉移或治療效應的方法。有研究者通過CellMax仿生平臺檢測循環(huán)腫瘤細胞（CTC）對結直腸癌進行早期篩查，與結腸鏡檢查相比，在檢測結直腸癌方面表現(xiàn)出高靈敏度和特異性，進一步表明CTC對結直腸癌早期診斷具有重要價值［19］。此外，特定基因的異常甲基化對結直腸癌的早期診斷有重大意義。cfDNA中的甲基化Septin9基因位于染色體17q25.3，廣泛存在于人體細胞中，與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。有研究者通過回顧性分析結腸癌、癌前病變患者及健康對照者Septin9基因甲基化、糞便隱血試驗（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)Septin9甲基化、FOBT、CEA以及聯(lián)合三者檢測的AUC為 0.8129，0.7381，0.7744，0.9127，Septin9甲基化對于CRC患者的診斷效能相對于FOBT和CEA較高，且Septin9聯(lián)合FOBT、CEA的診斷效能最高［20］。在外泌體方面，ZHENG等［21］通過比較不同臨床分期的結直腸癌患者的miRNA水平發(fā)現(xiàn)miRNA－19a－3p可用于早期檢測結直腸癌。此外，結直腸癌患者血液循環(huán)中miR-27a，miR-130a，miR-23a和miR-301a的表達明顯增加，miR-23b，miR-99b-5p和miR-150-5p水平則顯著下調(diào)，可作為結直腸癌早期檢測和預后的無創(chuàng)指標［22］。

3.2 指導治療 與組織活檢相比，液體活檢技術是一種非侵入性實時活檢方法，可在分子水平上進行全面的實時監(jiān)測，了解患者在疾病全過程中的腫瘤負荷和基因變化，也有利于治療方案的及時調(diào)整，避免無效治療和過度治療。有研究共納入455例Ⅱ期結腸癌患者，隨機分組，302例為ctDNA指導的管理組，153例為標準管理組，中位隨訪時間為37個月。ctDNA指導組中接受輔助化療的患者百分比低于標準管理組（15%：28%；RR：1.82；95%CI：1.25～2.65）。ctDNA指導管理組的2年無復發(fā)生存率（recurrence-free survival，RFS）不低于標準管理組（93.5%VS.92.4%；絕對差異1.1%；95%CI：-4.1～-6.2）。接受輔助化療的ctDNA陽性患者的3年RFS為86.4%，而未接受輔助化療的ctDNA陰性患者為92.5%（HR：1.83；95%CI：0.79～4.27）。ctDNA對于Ⅱ期結腸癌的輔助化療有一定的指導作用，在不影響患者RFS的前提下，減少輔助化療的使用，使治療更精準和個體化。此外，CTC的表型特征可用于評估腫瘤治療相關標志物，如PD-L1。RAIMOND等［23］在治療前和治療開始后4周和8周對結直腸癌患者縱向采集血樣，應用多參數(shù)流式細胞術測定CTC水平，結果顯示CTC的PD-L1的表達情況可作為一種非侵入性實時活檢方法用以預測瑞戈非尼對轉移性結直腸癌患者的療效。

3.3 判斷預后 液體活檢可預測腫瘤患者的預后。一項薈萃分析納入3,129例結直腸癌患者，結果顯示CTC陽性預示疾病的快速進展和較高的不良存活率。進一步亞組分析表明，CTC陽性患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）也較短［24］。國內(nèi)一項前瞻性隊列研究納入149例結直腸癌患者，通過比較患者的CTC計數(shù)和臨床病理特征后發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分期的增加，CTC的數(shù)量也增加，CTC計數(shù)與T分期、N分期和M分期均具有顯著相關性。亞組分析的結果表明，CTC陽性組隨著T分期的遞增，生存曲線和風險評估曲線的變化加快，進一步表明CTC可能與腫瘤的組織胚胎學位置、淋巴結轉移和浸潤深度有關。監(jiān)測CTC對評估臨床分期和預后具有重要價值。此外，ctDNA在結直腸癌預后方面也有一定的預測作用。KOBAYASH等對因孤立性可切除的結直腸癌肝轉移患者完成首次肝切除前，進行ctDNA分析，其中80%患者體液中ctDNA陽性。ctDNA陰性患者中，在39.0個月的中位隨訪期內(nèi)，僅1例復發(fā)，無一例死亡。ctDNA陽性患者的RFS明顯短于ctDNA陰性患者（HR：7.6；P=0.02）。ctDNA陽性患者的OS也短于ctDNA陰性患者，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.14）［25］。除CTC、ctDNA外，外泌體也可以反映預后情況。外泌體CPNE3蛋白，是一種鈣依賴性的膜結合蛋白，參與細胞信號傳導及膜泡運輸。通過研究發(fā)現(xiàn)CRC患者外泌體CPNE3水平高于健康對照組（P＜0.001），晚期CRC患者血漿外泌體CPNE3水平升高更為顯著（P＜0.001），有遠處轉移的CRC患者血漿外泌體CPNE3水平明顯高于無遠處轉移的CRC患者（P＜0.001），水平較低的結直腸癌患者無病生存期（DFS）和總生存期（OS）明顯優(yōu)于外泌體CPNE3水平較高的患者（P=0.033）。這些結果表明，CRC患者外泌體CPNE3水平升高，尤其在TNM分期較晚或遠處轉移的患者中更加突出。除此之外，外泌體長非編碼RNA（LncRNA）在結直腸癌預后方面的研究也越來越多。LncRNA是長度＞200個核苷酸的不編碼蛋白質的RNA，在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可以用作不同類型腫瘤中的潛在生物標志物。國內(nèi)有研究者通過構建基于鐵死亡相關lncRNA的結直腸癌預后風險評分公式和綜合預后模型，結果顯示構建的風險評分公式優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤分期，風險評分高的CRC患者預后更差，免疫細胞浸潤、基質評分、PD-L2表達水平較高，對氟尿嘧啶的耐藥性較低［26］。因此，通過液體活檢有利于CRC患者的預后評估及治療決策。

3.4 復發(fā)監(jiān)測 對于術后或輔助治療后的結直腸癌患者，ctDNA能否取代傳統(tǒng)檢查方法（如結腸鏡檢查、CT檢查等）進行復發(fā)監(jiān)測，已經(jīng)引起越來越多的注意。有研究者利用多標記DNA甲基化液體活檢技術對結直腸癌患者進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)70%的結直腸癌患者在復發(fā)前可檢測到ctDNA，且比CT檢查提前8個月［27］。HENRIKSEN等［28］對168例Ⅲ期結直腸癌患者進行多中心隊列研究，結果表明結直腸癌治療后每3個月進行一次ctDNA分析，與CT檢查相比，發(fā)現(xiàn)CRC復發(fā)的中位提前時間為9.8個月。此外，在一項前瞻性多中心隊列研究中，研究者對Ⅰ～Ⅲ期結直腸癌患者血漿ctDNA進行分析，在術后30 d，ctDNA陽性患者復發(fā)的可能性是ctDNA陰性患者的7倍。同樣，ctDNA陽性患者在輔助化療（assessing adjuvant chemotherapy，ACT）后可能復發(fā)。常規(guī)治療后，ctDNA陽性患者在監(jiān)測期間復發(fā)的可能性是ctDNA陰性患者的＞40倍（HR：43.5；95%CI：9.8～193.5；P＜0.001）。因此，ctDNA可用于結直腸癌的危險度分級、指導輔助化療和早期復發(fā)的監(jiān)測。

4 小結與展望

目前結直腸癌診斷的金標準仍是組織活檢，但組織活檢具有侵入性，且有組織取樣受病灶部位限制、單次活檢不能反映出所有病灶的異質性等不足之處。液體活檢為結直腸癌臨床診療開辟了一條新途徑。與傳統(tǒng)檢測方法相比，液體活檢從患者血液和其他體液提取生物標志物，具有微創(chuàng)或無創(chuàng)、可重復、可動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢。通過液體活檢，可以在分子水平上進行全面的實時監(jiān)測，了解患者在疾病全過程中的腫瘤負荷和基因變化，也有利于后續(xù)治療方案的調(diào)整，具有廣闊的應用前景。

雖然液體活檢對于結直腸癌診療方面表現(xiàn)一定的優(yōu)越性，但液體活檢的普及仍面臨不少挑戰(zhàn)：（1）液體活檢的檢測技術尚不成熟，從結直腸癌患者收集的CTC和ctDNA水平通常較低。同時存在信息不完整、基因錯配等現(xiàn)象以及檢測成本較高，因此需要對檢測技術進一步優(yōu)化。（2）缺乏臨床驗證和統(tǒng)一標志，需要大量多中心、更具前瞻性的長期臨床研究進一步明確。（3）腫瘤誘導血小板（TEP）和細胞微粒等其他腫瘤標志物尚待進一步研究。相信隨著技術的進步，液體活檢將在臨床診療中廣泛應用。