蔡 雪 于莉華 劉曉利 閆慧文 解宇晴 楊志云△

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 (北京, 100700) 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院

2020年原發(fā)性肝癌發(fā)病率第6位,死亡率第3位,中國原發(fā)性肝癌新發(fā)病例數(shù)占全球的45.27%,死亡病例數(shù)占全球的47.12%[1],由此可見,原發(fā)性肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一,我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)。原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)率高,死亡率高,嚴重危害人類健康,大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)進入中晚期,錯失根治性手術(shù)切除機會,介入治療、放射治療以及包括分子靶向治療、免疫檢查點抑制劑治療在內(nèi)的系統(tǒng)抗腫瘤治療是中晚期肝癌的主要治療方式,其中,不斷更新的免疫治療藥物為肝癌患者帶來更多希望,盡管目前免疫治療取得重大進展,但是仍存在許多局限,更深入地了解肝癌免疫特征及機制具有重要意義?！对l(fā)性肝癌診療指南(2022年版)》中推薦在肝癌的不同時期運用中醫(yī)方藥配合西醫(yī)治療可控制癥狀、預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及延長患者生存[2],臨床及基礎(chǔ)實驗研究證明中醫(yī)藥能夠調(diào)控肝癌免疫,改善肝癌免疫抑制微環(huán)境[3,4]。本文從肝癌免疫的角度,探討?zhàn)B陰扶正解毒法在肝癌免疫微環(huán)境中的治療作用,為中醫(yī)藥抗腫瘤治療提供理論依據(jù)。

1 肝癌免疫微環(huán)境

肝癌免疫微環(huán)境由免疫細胞、基質(zhì)細胞等細胞成分以及細胞外基質(zhì)(ECM)、細胞因子、趨化因子等非細胞成分共同組成[5]。免疫細胞中的CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)主要發(fā)揮免疫殺傷作用,腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)、髓源性抑制細胞(MDSC)、調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)等主要發(fā)揮免疫抑制作用[6]。肝癌免疫微環(huán)境具有以下特征:①炎性:肝癌多在病毒性或酒精性肝炎基礎(chǔ)上進展而來,是典型的炎性腫瘤;②酸性:肝癌細胞通過糖酵解途徑代謝,腫瘤組織局部形成酸性微環(huán)境,肝癌在酸性條件下具有更強的侵襲性和轉(zhuǎn)移性[7];③缺氧:肝癌細胞生長過快導(dǎo)致耗氧量增加,形成缺氧微環(huán)境[8];④腫瘤血管生成:缺氧微環(huán)境下缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)刺激血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等血管生成因子的表達,促進血管新生[8];⑤免疫抑制:肝癌細胞通過“免疫編輯”對機體免疫系統(tǒng)進行重塑,將腫瘤微環(huán)境“改造”成免疫抑制微環(huán)境,肝癌細胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)通過間充質(zhì)干細胞(MSC)和腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAF)誘導(dǎo)MDSC、TAM和Tregs分化,免疫抑制因子如白細胞介素(IL)-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β及CD8+T細胞表面的程序性死亡受體1(PD-1)和DC上的細胞程序性死亡-配體1(PD-L1)表達增加[9],T細胞免疫殺傷功能減弱,腫瘤細胞因此發(fā)生免疫逃逸。由此可見,腫瘤細胞將免疫微環(huán)境“改造”為適宜其生長、增殖和轉(zhuǎn)移的環(huán)境,如何改善肝癌免疫微環(huán)境、增強免疫細胞殺傷功能進而抑制肝癌進展是肝癌免疫治療的關(guān)鍵。

2 基于免疫微環(huán)境認識肝癌中醫(yī)病機

肝癌屬中醫(yī)“肝積”“癥瘕”“積聚”等范疇,肝癌發(fā)生的本質(zhì)在于正氣虧虛,癌毒內(nèi)蘊。所謂“積之成者,正氣不足,而后邪氣踞之”,正氣虧虛,脾失健運,濕熱內(nèi)停,土壅木郁,肝氣失于條達,或氣血乏源,肝血虧虛,久而久之在肝內(nèi)形成瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物,外來毒邪與內(nèi)生病理產(chǎn)物互相結(jié)聚,形成肝癌。腫瘤局部微環(huán)境是肝癌發(fā)生發(fā)展的場所,有不少學(xué)者基于免疫微環(huán)境論述肝癌病機,有學(xué)者將肝癌局部免疫微環(huán)境劃分為“正氣”與“邪氣”,具有腫瘤殺傷功能的免疫細胞屬于“正氣”;具有促進腫瘤細胞生長作用的屬于“邪氣”[10];何偉等[11]認為正氣虛弱,免疫功能低下是形成免疫抑制微環(huán)境的核心病機;程海波等[12]認為炎性微環(huán)境是熱毒的表現(xiàn),高凝、腫瘤血管增生與血瘀相符合,而大量的黏附因子導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移與痰濕黏滯重濁、隨氣流竄的特點相符。因此,腫瘤微環(huán)境的動態(tài)變化體現(xiàn)了正邪斗爭過程,機體正虛無力抗邪,則形成免疫抑制,表現(xiàn)為T細胞功能耗竭;瘀血、痰濁、癌毒等邪實凝聚,則形成炎性、酸性、缺氧的微環(huán)境特征。

2.1 脾失健運 《金匱要略》言“四季脾旺不受邪”,《素問·五癃津液別篇》言“脾為之衛(wèi)”。脾是機體重要的免疫防御系統(tǒng),脾虛與肝癌的發(fā)生密切相關(guān),肝癌患者往往脾胃虧虛,正氣不足,衛(wèi)外失固,進而免疫防御功能和監(jiān)視功能下降,腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的識別和殺傷力降低,研究表明脾虛導(dǎo)致免疫功能低下,肝郁脾虛的肝癌小鼠T、B淋巴細胞增殖能力顯著降低,細胞因子IL-2、γ-干擾素(IFN-γ)顯著降低, IL-10、IL-4顯著升高,小鼠免疫抑制顯著[13]。脾為氣血生化之源,脾胃運化和輸布水谷精微,濡養(yǎng)五臟六腑,脾胃虛弱則運化無力,出現(xiàn)乏力、納差、惡心嘔吐、腹脹痛、形體消瘦等癥狀。肝癌患者脾虛存在物質(zhì)的能量的代謝紊亂[14],脾虛與腫瘤細胞的能量代謝異常有關(guān),脾虛造成腫瘤細胞的能量代謝重組,形成缺氧微環(huán)境[11]。于爾辛教授[15]提出“肝癌的本是脾虛”,采用健脾理氣法能夠調(diào)節(jié)小鼠T細胞和NK細胞, 抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達和腫瘤血管形成,改善免疫功能。因此,脾失健運是肝癌發(fā)生的重要病機,脾虛導(dǎo)致機體免疫功能降低,有利于肝癌免疫抑制微環(huán)境形成,促進肝癌細胞生長、轉(zhuǎn)移。

2.2 肝失疏泄 《格致余論》言“司疏泄者肝也”,腫瘤的發(fā)生與精神狀態(tài)有十分密切的聯(lián)系,肝癌患者常常情志抑郁,氣機不得暢達,造成肝氣郁結(jié),血液瘀滯,形成實邪,正如《難經(jīng)本義》言“積蓄也,言血脈不行,蓄積而成病也”,瘀血又進一步阻滯氣血運行,導(dǎo)致肝臟失于濡養(yǎng),造成肝血虧虛,表現(xiàn)為肌膚甲錯、肝區(qū)疼痛、舌質(zhì)紫黯、脈細澀或結(jié)代等,肝失疏泄與肝之陰血虧虛互為因果,抑制機體免疫功能,腫瘤局部微環(huán)境中免疫細胞功能失常,免疫殺傷功能減弱,肝癌進一步進展,研究表明肝腎陰虛小鼠CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD3+NK1.1+NK細胞比例均顯著降低,腫瘤細胞呈浸潤性生長,小鼠生存期顯著縮短[16]。小柴胡湯和解少陽,方中柴胡升舉陽氣、疏肝解郁,其聯(lián)合常規(guī)療法治療原發(fā)性肝癌TACE術(shù)后,可有效保護患者免疫功能,維持T細胞數(shù)量,提高患者生活質(zhì)量[17];芍藥軟肝合劑中白芍養(yǎng)血柔肝,加之清熱解毒、行氣散結(jié)之藥物,能提高荷瘤小鼠機體免疫功能,其能抑制荷瘤小鼠中VEGF的表達,從而抑制腫瘤生長[18]。因此,肝失疏泄、肝血虧虛是肝癌發(fā)生的重要病機,肝失疏泄導(dǎo)致免疫抑制,而養(yǎng)血柔肝、疏肝解郁之品能調(diào)節(jié)其免疫,增強機體免疫功能,延緩肝癌惡化。

2.3 癌毒內(nèi)蘊 肝癌的致病因素包括飲酒、肝炎病毒、黃曲霉素等,這些在中醫(yī)上均屬于外來毒邪,正虛不能抵抗邪氣,邪氣久踞,形成腫塊,腫塊耗血傷津,加重肝臟陰血虧虛。另外,瘀血、痰濁等內(nèi)生病理產(chǎn)物與外來毒邪互相凝結(jié),阻滯氣機,促進腫塊生長,本虛與標實互根互用,形成惡性循環(huán),使病情加重,這一過程與腫瘤細胞在免疫微環(huán)境中作用過程相似,機體免疫功能下降無法清除腫瘤細胞,腫瘤細胞在免疫微環(huán)境中誘導(dǎo)免疫抑制細胞分化,促進免疫抑制分子表達,進而抑制免疫細胞殺傷功能,腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸得以繼續(xù)增殖,使得癌毒內(nèi)蘊加強,正氣進一步虧損,形成“因虛致實,因?qū)嵵绿摗钡膼盒匝h(huán)。肝癌是典型的炎癥相關(guān)腫瘤,腫瘤微環(huán)境中存在腫瘤相關(guān)成纖維細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性物質(zhì)[19],加之缺營養(yǎng)、酸化的特點,對周圍免疫細胞具有顯著抑制[20],這與癌毒耗損正氣、纏綿深痼的致病特點類似。另外,腫瘤外泌體是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,腫瘤外泌體可抑制免疫應(yīng)答,增加腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力,體現(xiàn)了癌毒走注流竄的特點[21]。因此,癌毒內(nèi)蘊是肝癌發(fā)生的重要病機,解毒散結(jié)等祛邪法以改善腫瘤酸性、炎性、缺氧、免疫抑制微環(huán)境,從而恢復(fù)T細胞功能,抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。

3 養(yǎng)陰扶正解毒法調(diào)控肝癌免疫

扶正祛邪是中醫(yī)治療肝癌的根本法則,應(yīng)貫穿肝癌治療的始終。扶正應(yīng)以益氣養(yǎng)陰為主,振奮臟腑功能活動,旨在恢復(fù)脾之運化,肝之疏泄、藏血功能,提高機體免疫防御和免疫監(jiān)視能力,改善CTL、NK等免疫細胞耗竭,恢復(fù)其殺傷作用;祛邪即削弱或清除病邪,以減輕其對機體的損害,應(yīng)以化瘀解毒,軟堅散結(jié)為主,佐以行氣化痰,防止毒邪留戀,免疫學(xué)的角度即打擊TAM、MDSC、Tregs等免疫抑制細胞,降低PD-1、細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)等免疫抑制分子表達,阻斷腫瘤細胞免疫抑制通路,多靶點、多途徑介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,發(fā)揮中醫(yī)藥殺傷腫瘤細胞并抑制其增殖和轉(zhuǎn)移的作用。

3.1 養(yǎng)陰扶正 “見肝之病,知肝傳脾,當先實脾”,益氣扶正是治療肝癌的基本法則。肝脾功能聯(lián)系密切,脾氣健運,則肝氣疏泄條達;氣血生化充足,則肝血得藏。健脾養(yǎng)胃能夠抑制腫瘤異常糖代謝, 清除其副產(chǎn)物,重塑腫瘤微環(huán)境[22],許多近現(xiàn)代醫(yī)家認為益氣扶正是抗癌的重要舉措[23-25]。另外,腫瘤易耗血傷陰,肝陰是肝臟功能的基礎(chǔ),《臨證指南醫(yī)案》言“肝為剛臟,非柔潤不能調(diào)和”,養(yǎng)陰柔肝對恢復(fù)肝之疏泄、藏血功能,重塑肝癌免疫微環(huán)境具有重要意義。《醫(yī)宗必讀·乙癸同源論》言“東方之木,無虛不可補,補腎即所以補肝”,因此,應(yīng)運用滋水涵木法,同補肝腎之陰,使肝之疏泄條達。

養(yǎng)陰扶正法通過改善免疫功能對肝癌發(fā)揮治療作用已經(jīng)在許多研究中得到證實。如研究發(fā)現(xiàn)健脾益氣方能夠下調(diào)NLRP3炎癥小體的表達、抑制細胞程序性壞死,改善肝癌免疫功能[26];益氣養(yǎng)陰類中藥可以顯著提高CD4/CD8比值,增強巨噬細胞功能,改善免疫抑制狀態(tài),提高患者的免疫力[27]。本團隊經(jīng)驗方養(yǎng)陰扶正解毒方(沙參、麥冬各15 g, 白花蛇舌草、生黃芪各20 g ,徐長卿12 g,柴胡、苦參、白術(shù)各9 g )用于肝癌的輔助治療,本方具有養(yǎng)陰扶正、解毒散結(jié)之功效,能有效改善肝癌患者癥狀,延長患者生存,小鼠實驗表明養(yǎng)陰扶正解毒方有效抑制腫瘤生長,增加脾臟和外周血及腫瘤組織的CD8+和CD3+T細胞的水平,降低CD8+T細胞表面共抑制分子PD-1、TIGIT和T細胞免疫球蛋白-3(TIM-3)的表達,恢復(fù)腫瘤浸潤性T細胞的細胞毒性,延緩其凋亡。此外,治療顯著降低了外周血和腫瘤組織中炎癥和免疫抑制細胞因子(包括IL-1β、IL-6和IL-10)的表達,增加了效應(yīng)細胞因子TNF-α和IFN-γ的表達,改善T細胞耗竭和免疫抑制微環(huán)境[28,29]。因此,養(yǎng)陰扶正法可以改善炎性微環(huán)境,降低PD-1、TIM-3等免疫抑制分子表達,恢復(fù)T細胞毒性,減輕免疫抑制,進而加強免疫監(jiān)控和免疫殺傷,從而抑制肝癌進展。

3.2 解毒散結(jié) 金元四大家之一張從正主張“先論攻邪,邪去而元氣自復(fù)”、“邪氣留則正氣傷,邪氣去則正氣安”,祛邪應(yīng)貫穿肝癌治療始終。肝癌腫瘤局部“痰、郁、瘀、毒”結(jié)聚膠著,應(yīng)治以活血化瘀,解毒散結(jié)為主,佐以行氣化痰?；钛鲆造畛龆?改善腫瘤患者缺氧微環(huán)境,抑制腫瘤血管及癌栓形成;解毒散結(jié)以抑制炎性反應(yīng),降低炎癥因子水平,介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡;行氣化痰以抑制腫瘤細胞糖酵解,減少乳酸堆積,改善酸性微環(huán)境,從而改善免疫抑制,抑制腫瘤生長。

研究表明解毒散結(jié)能夠抑制腫瘤生長,改善腫瘤微環(huán)境免疫抑制。國醫(yī)大師周仲瑛教授的經(jīng)驗方“消癌解毒方(白花蛇舌草、蜈蚣、僵蠶、麥冬等)”由清熱解毒藥、化痰祛瘀藥和益氣養(yǎng)陰藥等組成,能夠在腫瘤細胞凋亡和腫瘤血管生成方面發(fā)揮良好作用[12];復(fù)方斑蝥膠囊具有破血消瘀,攻毒蝕瘡的功效,患者治療后血清中VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)含量均明顯降低,有效抑制腫瘤血管生成,改善缺氧免疫微環(huán)境[30];白花香蓮解毒顆粒聯(lián)合經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)治療HBV相關(guān)性肝癌,治療4周后發(fā)現(xiàn)治療組患者CD4+、CD4+/CD8上升水平以及CD8+下降水平均優(yōu)于對照組[31];扶正解毒消積方增強初次TACE治療的氣陰兩虛、毒瘀蘊積證肝癌患者的免疫功能,增強機體抗腫瘤能力,延長無進展生存期[32]。因此,解毒散結(jié)法能抑制腫瘤血管生成,降低缺氧誘導(dǎo)因子水平,維持T細胞水平,發(fā)揮抗腫瘤作用。

4 現(xiàn)代藥理學(xué)研究

4.1 養(yǎng)陰扶正類中藥 目前對中藥單體調(diào)節(jié)腫瘤免疫的機制研究日益增多,黃芪多糖在體外以劑量和時間依賴的方式抑制CD4+CD25+Treg細胞的生長和增殖,其機制可能是通過降低肝癌局部微環(huán)境中FOXP3的表達并恢復(fù)細胞因子平衡,另外,黃芪多糖介導(dǎo)CXCR4/CXCL12通路來阻斷SDF-1或其受體,從而抑制Treg細胞遷移[33],也有研究表明黃芪多糖能夠通過miR-133a-3p/MSN軸減弱PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制,產(chǎn)生抗腫瘤作用[4];人參皂苷Rg3抑制肝細胞癌Hep1-6、HepG2和SMMC 7721細胞活性并誘導(dǎo)細胞凋亡,另外,它可以增強淋巴細胞增殖以及IL-2和IFN-γ的分泌,從而抑制腫瘤生長[34];甘草多糖減少肝癌小鼠腫瘤微環(huán)境和脾臟淋巴結(jié)中的Treg細胞比例,降低Foxp3在Treg細胞中的表達,上調(diào)血清Th1/Th2細胞因子比率,抑制腫瘤生長[35];芍藥苷通過抑制TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的表達強度抑制肝癌Hep G2細胞的侵襲和遷移[36]。因此,養(yǎng)陰扶正類中藥能夠調(diào)節(jié)不同分子及通路打擊免疫抑制細胞Treg細胞的生長和增殖及遷移,增強T細胞增殖及殺傷力,或抑制PD-L1的表達,或通過阻斷相關(guān)信號通路抑制肝癌細胞侵襲和遷移,從而達到治療肝癌目的。

4.2 解毒散結(jié)類中藥 解毒散結(jié)類中藥經(jīng)研究證實能夠改善肝癌免疫微環(huán)境,介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。黃芩苷是黃芩的主要成分之一,其可以促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化為M1樣噬菌體,從而增強癌癥細胞的自噬,另外,黃芩苷能夠通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)信號傳導(dǎo)促進HepG2肝癌細胞凋亡[37],Ke等[38]研究證明黃芩苷降低STAT3活性,進一步下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達,從而恢復(fù)T細胞對腫瘤細胞的敏感性;大黃能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡抑制肝癌進展[39];穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制肝癌細胞中的VEGF,而VEGF是肝癌治療的有效靶點[40];百花蛇舌草抑制肝癌細胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,且可誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比值上調(diào),下調(diào)IL-6/STAT3信號通路活性[41,42]。因此,解毒散結(jié)類中藥能夠抑制肝癌細胞增殖,增強其自噬,誘導(dǎo)其凋亡,或下調(diào)PD-L1的表達,減輕T細胞耗竭,或抑制腫瘤血管生成,發(fā)揮抗腫瘤作用。

5 結(jié)語

目前,免疫療法在腫瘤治療中展現(xiàn)出良好前景,通過干預(yù)免疫微環(huán)境、改善免疫細胞耗竭功能是免疫治療的主要機制,越來越多的研究證明,中醫(yī)藥能夠多層次、多途徑、多靶點改善免疫微環(huán)境,恢復(fù)腫瘤患者免疫功能,延長患者生存。本文從免疫微環(huán)境的角度探討中醫(yī)藥對肝癌的免疫治療作用,認為養(yǎng)陰扶正解毒法能較好地改善肝癌免疫功能,養(yǎng)陰扶正解毒法是本團隊多年來治療肝癌的基本治則,臨床及實驗研究證明能有效延長患者生存,改善肝癌免疫抑制微環(huán)境。中藥復(fù)方作用機制復(fù)雜,未來還有許多未知需要我們探索。