李嘉鑫,魏詩音,姚澤龍,邢曉鈺,孔燕明,劉 聰,曹中贊,欒新紅

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院,遼寧沈陽 110161)

從形態(tài)學(xué)、分子學(xué)、功能及行為等角度來看,大腦是動物所擁有的最有趣、最具有吸引力的器官之一[1]。病原微生物等因素可以誘發(fā)動物的腦損傷,進(jìn)而對動物的健康和生產(chǎn)活動造成諸多負(fù)面影響[2]。因此,提高對動物腦部疾病的關(guān)注,以及尋求有效的治療方法是急需的。脂聯(lián)素(adiponectin,APN)是一種由脂肪組織分泌的細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)代謝過程、提高抗氧化水平。脂聯(lián)素及其受體介導(dǎo)的信號通路在多種系統(tǒng)疾病中已被廣泛研究[3]。此外,脂聯(lián)素受體在腦組織的許多區(qū)域高表達(dá),在小鼠的下丘腦、腦干、皮質(zhì)神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞以及全腦和垂體提取物中均檢測到它們的表達(dá)。關(guān)于脂聯(lián)素的腦保護(hù)作用受到了越來越多的重視,尤其是脂聯(lián)素的生物學(xué)作用在動物腦損傷發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用。可以期待,脂聯(lián)素可能在動物腦損傷的治療中發(fā)揮重要作用。

1 脂聯(lián)素及其受體

1.1 脂聯(lián)素的結(jié)構(gòu)

脂聯(lián)素是一種分子質(zhì)量約為30 ku的多肽蛋白,屬于可溶性膠原超家族。編碼脂聯(lián)素的基因主要在脂肪細(xì)胞中表達(dá),受到CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins,C/EBPs)、激活蛋白-1(activator protein1,AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。不同動物體內(nèi)組成脂聯(lián)素的氨基酸數(shù)量存在一定差異,小鼠脂聯(lián)素含有247個(gè)氨基酸,雞和鵝脂聯(lián)素則含有245個(gè)氨基酸。脂聯(lián)素由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,包括靶向細(xì)胞外分泌激素的N端信號肽、短可變區(qū)、膠原結(jié)構(gòu)域和C端球狀結(jié)構(gòu)域[4]。脂聯(lián)素N端區(qū)域含有1個(gè)半胱氨酸殘基,通過這個(gè)殘基形成分子間的二硫鍵對脂聯(lián)素的多聚和分泌至關(guān)重要。其次,N端區(qū)域與任何其他蛋白質(zhì)沒有結(jié)構(gòu)同源性,并且在不同物種之間存在結(jié)構(gòu)差異[5]。相反,球狀結(jié)構(gòu)域與包括補(bǔ)體因子C1q、α腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在內(nèi)的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上相似,具有高度同源性。

脂聯(lián)素主要在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生,其單體蛋白通過糖基化和羥基化進(jìn)行翻譯后被修飾成3種主要亞型分泌進(jìn)入血液中,包括三聚體(分子質(zhì)量約為90 ku)、六聚體(分子質(zhì)量約為180 ku)及多聚體(分子質(zhì)量約為360～540 ku)[6]。在血液循環(huán)中,脂聯(lián)素主要以這些全長形式存在,此外,循環(huán)中也發(fā)現(xiàn)了一種由全長脂聯(lián)素蛋白水解產(chǎn)生的球狀脂聯(lián)素形式[7]。脂聯(lián)素的每種分子形式都被證明具有不同的生物學(xué)功能。有研究指出,全長脂聯(lián)素能夠促進(jìn)葡萄糖攝取和脂肪酸氧化及增加胰島素敏感性,球狀脂聯(lián)素則能夠激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)途徑等[8]。

1.2 脂聯(lián)素受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

既往研究表明,脂聯(lián)素的多效性作用是其通過與3種受體結(jié)合介導(dǎo)的,即脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)、脂聯(lián)素受體2(adiponectin receptor 1,AdipoR2)及T-鈣黏蛋白。AdipoR1和AdipoR2于2003年首次被克隆出來,分別位于染色體1p36.13-q41、1 E4及染色體12p13.31、6 F1上,二者都是完整的膜蛋白,包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,由細(xì)胞內(nèi)NH2末端結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外COOH末端結(jié)構(gòu)域組成[9]。AdipoR1和AdipoR2在結(jié)構(gòu)上具有顯著的同源性,并顯示出67%的氨基酸一致性,但這2種受體對不同脂聯(lián)素異構(gòu)體的親和力有所差異。小干擾RNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)抑制AdipoR1和AdipoR2顯示,AdipoR1對球狀脂聯(lián)素具有高親和力,而AdipoR2對全長脂聯(lián)素和球狀脂聯(lián)素的親和力均處于中等水平[10]。脂聯(lián)素受體的表達(dá)是獨(dú)特而廣泛的,并且具有組織特異性,動物體內(nèi)的肌肉、大腦及心臟等多種組織中都有脂聯(lián)素受體的表達(dá)與分布。據(jù)其組織表達(dá)譜顯示,AdipoR1主要在骨骼肌和肝臟中廣泛表達(dá),而AdipoR2在肝臟中表達(dá)最豐富。脂聯(lián)素功能的另一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子是2004年發(fā)現(xiàn)的T-鈣黏蛋白受體,其是一種非典型的糖基磷脂酰肌醇錨定的鈣黏蛋白。盡管T-鈣黏蛋白受體沒有膜或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,但它在平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元中結(jié)合脂聯(lián)素和促進(jìn)脂聯(lián)素信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[8]。

AdipoR1及AdipoR2都與一種核內(nèi)體相關(guān)的磷酸酪氨酸銜接蛋白1(leucine zipper motif 1,APPL1)相互作用。APPL1已被證明是脂聯(lián)素受體鏈接下游信號通路的關(guān)鍵中介,包含磷酸化酪氨酸結(jié)構(gòu)域(phosphoty rosine binding domain,PTB)、pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology do main,PH)和亮氨酸拉鏈基序,其通過PTB結(jié)構(gòu)域直接與脂聯(lián)素受體細(xì)胞內(nèi)NH2末端區(qū)域結(jié)合[11]。脂聯(lián)素通過其受體與APPL1結(jié)合誘導(dǎo)了多個(gè)靶組織中p38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,P38MAPK)、AMPK、過氧化物酶體增殖活化受體α(peroxisome proliferators-activated receptor-α, PPARα)及胰島素受體底物蛋白1(insulin receptor substrate-1,IRS1)等下游信號分子的激活。APPL1與脂聯(lián)素受體的結(jié)合增加了AMPK、p38MAPK的磷酸化,并增強(qiáng)了PPARα配體的活性,誘導(dǎo)了脂肪酸氧化和葡萄糖消耗增加。在過表達(dá)APPL1的小鼠肝細(xì)胞中,p38 MAPK被激活,這表明APPL1在脂聯(lián)素信號通路中發(fā)揮了作用。另一方面,APPL1可調(diào)節(jié)脂聯(lián)素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞脂肪酸氧化,脂聯(lián)素增加了APPL1與AMPK的體外結(jié)合,也增加了心肌細(xì)胞的耗氧量。此外,脂聯(lián)素還可以激活I(lǐng)RS1磷酸化和下游的磷脂酰肌3激酶/蛋白激酶B軸(phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt),PI3K/Akt),以促進(jìn)應(yīng)激后肌肉和肝細(xì)胞的細(xì)胞存活。

2 脂聯(lián)素對動物腦損傷的影響及機(jī)制

關(guān)于脂聯(lián)素在外周系統(tǒng)疾病中的有益作用已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道,與之形成鮮明對比的是脂聯(lián)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用仍然知之甚少。雖然脂聯(lián)素在大腦中的作用尚未得到很好的闡述,但不可否認(rèn)的是,人們對脂聯(lián)素及其腦保護(hù)作用的理解一直在大大增加。越來越多的證據(jù)表明,脂聯(lián)素可以在動物腦損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的治療保護(hù)作用[12-13]。

2.1 脂聯(lián)素與腦組織炎癥反應(yīng)

過度的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷發(fā)展的主要病理原因之一,其特征不僅是小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)激活、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和TNF-α、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等炎癥介質(zhì)的持續(xù)釋放,還包括氧化和硝化應(yīng)激的增加[19]。一系列的病理變化損壞了血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的完整性,導(dǎo)致了外周單核細(xì)胞滲入腦組織,維持甚至放大炎癥,加重腦損傷[14]。因此,抑制炎癥反應(yīng)對于緩解腦損傷具有重要意義。大量的體內(nèi)和體外研究表明,脂聯(lián)素具有抗炎活性,廣泛參與炎癥過程。在外周,脂聯(lián)素的主要細(xì)胞靶點(diǎn)是肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞等,但在中央層面上,可用的數(shù)據(jù)要少得多。盡管這一點(diǎn)一直存在爭議,但現(xiàn)在研究者們已證實(shí)脂聯(lián)素受體在腦組織(如:皮層、下丘腦、腦下垂體、腦干和海馬)中廣泛存在并且脂聯(lián)素可以穿過BBB到達(dá)腦實(shí)質(zhì),在那里發(fā)揮抗炎作用[15-16]。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞,它的激活及其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)在多種刺激誘發(fā)的腦損傷病程中具有促進(jìn)作用[17]。在感知來自外源性刺激的信號后,靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,與病原體或外源性配體相互作用,誘導(dǎo)TNF-α、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)等炎癥細(xì)胞因子和各種信號傳遞,進(jìn)一步加重局部免疫細(xì)胞浸潤及神經(jīng)元損傷[18]。脂聯(lián)素能通過與AdipoR1及AdipoR2相結(jié)合抑制TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá),緩解小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Nicolas S等[19]發(fā)現(xiàn),與野生小鼠相比,脂聯(lián)素缺失小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞對促炎刺激的反應(yīng)性更強(qiáng),表現(xiàn)出了對神經(jīng)炎癥更高的敏感性。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究結(jié)果表明,腦室內(nèi)注射球狀脂聯(lián)素(gAPN)可以通過AdipoR1/ AMPK/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介導(dǎo)的IL-1β、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和TNF-α合成、活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基的產(chǎn)生,進(jìn)而對小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮直接的體內(nèi)抗炎作用[25]。在淀粉樣蛋白β低聚物處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中,脂聯(lián)素可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的釋放、NF-κB的核易位及 AMPK磷酸化,這種對小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎作用是通過AdipoR1-AMPK-NF-κB信號通路調(diào)控的。其次,球狀脂聯(lián)素(Acrp30)亦可通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)信號途徑減少暴露于淀粉樣蛋白β低聚物中的小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎反應(yīng)并促進(jìn)抗炎反應(yīng)。此外,脂聯(lián)素還可以通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化來發(fā)揮抗炎作用。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后通常發(fā)展為2種表型,包括促進(jìn)炎癥反應(yīng)的經(jīng)典激活表型(M1極化)及分泌抗炎細(xì)胞因子和生長因子的替代激活表型(M2極化)。在特定的微環(huán)境中,已經(jīng)完全極化的M1或M2亞群可以逆轉(zhuǎn)其表型和功能,因此,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1向M2表型轉(zhuǎn)化的策略給脂聯(lián)素在腦損傷中的防治提供了新的思路。在腦缺血模型中,脂聯(lián)素通過增強(qiáng)AdipoR1/APPL1/肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/AMPK/PPARγ信號通路促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞表型由M1向M2的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而減輕了炎癥反應(yīng)[20]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是脂聯(lián)素在腦組織中啟動抗炎效應(yīng)的另一個(gè)靶點(diǎn)。Wu X等[21]通過mRNA測序和轉(zhuǎn)錄組分析表明,脂聯(lián)素肽可顯著減輕腦出血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和線粒體呼吸功能障礙,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素肽增加了AMPK激活,從而抑制了線粒體裂變關(guān)鍵蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)向線粒體膜的易位,減少了線粒體碎片化和線粒體超氧化物的產(chǎn)生,從而減輕了星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的炎癥反應(yīng)。總的來說,脂聯(lián)素似乎通過多種機(jī)制在動物腦組織內(nèi)發(fā)揮抗炎作用,但其可能的機(jī)制尚未完全闡明。

2.2 脂聯(lián)素與腦組織氧化應(yīng)激

眾所周知,大腦具有高于其他器官的耗氧量和代謝活動,抗氧化水平較弱且脂質(zhì)含量高度豐富,極易受到氧化應(yīng)激的影響。氧化應(yīng)激是ROS自由基[如羥基自由基(OH·)、過氧亞硝酸鹽(ONOO-)]產(chǎn)生和抗氧化劑降解之間的一種不平衡狀態(tài)。這種氧化還原失衡是由于ROS生成增加和抗氧化防御系統(tǒng)減少而發(fā)生的[22]。雖然ROS通過不同的代謝過程正常產(chǎn)生,但過量的ROS會引起炎癥并對生物分子產(chǎn)生有害影響,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷和突變,進(jìn)而引起細(xì)胞死亡及機(jī)體組織的氧化損傷[23-24]。在目前的情況下,通過加入一些抗氧化物質(zhì)提高機(jī)體組織內(nèi)的抗氧化物酶水平是清除ROS及對抗氧化損傷的主要策略。

越來越多的證據(jù)表明,脂聯(lián)素是一種有效抗氧化物質(zhì)。它對產(chǎn)生ROS的信號通路有負(fù)調(diào)控作用,可以促進(jìn)機(jī)體組織內(nèi)過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化物酶表達(dá),抵消細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物的過度積累,從而阻止氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[25-26]。在脂聯(lián)素處理的衰老H9c2心肌細(xì)胞中,ROS、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量及高遷移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1,HMGB1)的蛋白表達(dá)下降,血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的蛋白表達(dá)增加,表明脂聯(lián)素可通過抑制HO-1/HMGB1信號通路減輕衰老H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激[27]。高脂飲食會導(dǎo)致豁眼鵝肝組織中MDA的含量升高、SOD、CAT 的含量降低,而適當(dāng)劑量的外源脂聯(lián)素受體激動劑處理可以逆轉(zhuǎn)這些變化,提高肝臟的抗氧化能力,減輕氧化應(yīng)激引起的肝損傷[28]。磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH)氧化酶是ROS的酶促來源之一,球狀脂聯(lián)素可以通過抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化損傷信號級聯(lián)來減輕腦再灌注損傷,球狀脂聯(lián)素處理后可以增加腦組織內(nèi)抗氧化能力、上調(diào)下游信號分子SOD、CAT的含量及降低MDA的生成。另一項(xiàng)研究表明,脂聯(lián)素多肽的保護(hù)作用在很大程度上是通過抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的,給予脂聯(lián)素多肽后羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE),8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平及ROS含量顯著下降,線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷得到緩解。此外,氧化損傷是腦外傷后繼發(fā)性腦損傷的重要標(biāo)志,脂聯(lián)素/脂聯(lián)素受體信號通路通過激活A(yù)dipoR1發(fā)揮作用,進(jìn)而增加去乙?；?(silent information regulator 3,SIRT3)的蛋白表達(dá),促進(jìn)線粒體抗氧化能力的恢復(fù),發(fā)揮其在抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和預(yù)防創(chuàng)傷性腦損傷中的作用[29]。

2.3 脂聯(lián)素與腦組織細(xì)胞凋亡

神經(jīng)元是動物腦組織的基礎(chǔ),不可再生,一旦凋亡難以恢復(fù),因此出現(xiàn)在外傷性腦損傷、腦缺血等多種腦組織病理情況下的細(xì)胞凋亡是極其有害的[30]。細(xì)胞凋亡過程受到B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(B-cell cymphoma/euke-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)(Bcl-2 associated X,Bax)和半胱天冬酶 (caspase)等基因精確調(diào)控。Bax和Bcl-2相互作用致使線粒體通透性增加和凋亡相關(guān)酶釋放增多,從而促進(jìn)了凋亡反應(yīng)[31]。此外,腦組織細(xì)胞凋亡也受到caspase的外源性途徑的調(diào)控。這兩種途徑最終激活凋亡的最終執(zhí)行者半胱天冬酶-3 (caspase-3),活化的caspase-3破壞了廣泛的穩(wěn)態(tài)、修復(fù)性和細(xì)胞骨架蛋白,并導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[32]。神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制給腦損傷防治提供了新的思路,如何找到抑制非生理性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子也成為了研究熱點(diǎn)。

近年來,脂聯(lián)素對于細(xì)胞凋亡的影響受到了很多的關(guān)注,多項(xiàng)研究表明,脂聯(lián)素與其受體相結(jié)合可通過多種信號通路調(diào)控細(xì)胞凋亡,發(fā)揮其保護(hù)作用。在LPS處理的心肌細(xì)胞中,脂聯(lián)素可通過激活PI3K/AKT信號通路下調(diào)caspase-3與Bax的活性來保護(hù)膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[33]。其次,脂聯(lián)素還可作用于AMPK/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路,減輕膿毒血癥誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,緩解肝損傷[34]。此外,脂聯(lián)素介導(dǎo)的APPL1/AMPK信號通路也能減弱缺氧缺血誘導(dǎo)的大鼠的神經(jīng)元凋亡。在該研究中,脂聯(lián)素處理組大鼠腦萎縮區(qū)域減小,神經(jīng)元凋亡減少,同時(shí)AdipoR1、APPL1和p-AMPK的蛋白表達(dá)增加。與脂聯(lián)素的抗凋亡活性一致,在膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型中,重組脂聯(lián)素肽可顯著緩解腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從機(jī)制層面來說,重組脂聯(lián)素肽通過降低激活轉(zhuǎn)錄因子4及環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白的表達(dá),緩解了神經(jīng)元凋亡[35]。

3 總結(jié)與展望

近年來,對脂聯(lián)素及其受體的表達(dá)和功能的研究已經(jīng)從外周組織器官延伸到了中樞神經(jīng)系統(tǒng)。盡管腦組織中脂聯(lián)素及其受體信號傳導(dǎo)級聯(lián)以及作用腦損傷的特異性機(jī)制仍需要更加深入的調(diào)查,但越來越多的證據(jù)表明,脂聯(lián)素可能是治療保護(hù)腦組織的重要因子?；谥?lián)素以及脂聯(lián)素受體的分子結(jié)構(gòu)及其在脂類代謝、抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡方面的生物學(xué)功能,將來可以開發(fā)脂聯(lián)素及其類似物相關(guān)的臨床藥物,用于防治動物腦損傷方面的疾病。