郭全海,許夕雅,石蒙蒙,楊 寒,高冬生,王永生,陳 陸*

(1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院牧醫(yī)學(xué)院,河南商丘 476100;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450046)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是細(xì)小病毒科一類單鏈無囊膜的DNA病毒,其基因組大小約為4～6.3 kb[1],兩端有回文序列。PPV最早于1965年在德國首次發(fā)現(xiàn),并于1967年從豬流產(chǎn)胎兒的器官中成功分離[2]。該病毒可引起初產(chǎn)母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎、延遲發(fā)情等[3]。近些年,不斷發(fā)現(xiàn)新型豬細(xì)小病毒,經(jīng)典PPV被定義為PPV1,PPV則被定義為PPV1～PPV7的統(tǒng)稱。2001年,Hijikata M等[4]在緬甸首次在豬血清中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒2型(Porcine parvovirus 2,PPV2);2008年,香港學(xué)者在豬樣品中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒3型(Porcine parvovirus 3,PPV3);2009年,美國科研人員首次報(bào)道在北卡羅來納州檢測(cè)到豬細(xì)小病毒4型(Porcine parvovirus 4,PPV4);2013年,Xiao C T等[5]首次于美國育肥豬肺中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒5型(Porcine parvovirus 5,PPV5);2014年,Ni J等[6]在中國豬流產(chǎn)胎兒的組織樣品中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒6型(Porcine parvovirus 6,PPV6);同年,Xing X等[7]在中國首次從血清中檢測(cè)到豬細(xì)小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV7);2016年,Palinski R M等[8]首次報(bào)道在健康成年豬的肛拭子中發(fā)現(xiàn)了PPV7。之后全球多個(gè)國家相繼報(bào)道了涵蓋上述7種PPV的流行情況,它們大多以引種方式傳入[9]。PPV2～PPV7在國內(nèi)外豬群中廣泛流行,PPV2是世界公認(rèn)的感染率最高的型,約為20%～40%[10-12],肺部組織的檢出率為48.8%[13],扁桃體中PPV1～PPV4的檢出率為44%～83%[14]。我國的PPV3感染率為43.23%～51.30%,分布在江蘇、上海、浙江、安徽等11個(gè)省市,在血清、肝臟、肺臟等組織器官中均可檢測(cè)到[15-16]。 PPV5多發(fā)現(xiàn)于臨床表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉、全身性疾病或生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病豬[5]。我國的PPV6感染分布在北京、江蘇、天津和四川,流產(chǎn)胎兒(50%)和仔豬(75%)的患病率明顯高于育肥豬(15.6%)和母豬(3.8%)。PPV7具有相對(duì)廣泛的組織趨向性,病豬的血清、肝、肺、腹股溝淋巴結(jié)、脾和腎均可檢測(cè)到PPV7[8]。根據(jù)NS1蛋白序列同源性,PPV分為4個(gè)不同的細(xì)小病毒屬,即Protoparvovirus(PPV1)[17]、Tetraparvoviru(PPV2～PPV3)、Copiparvovirus(PPV4～PPV6)和Chapparvovirus(PPV7)[18]。PPV1～PPV7有相似的病毒結(jié)構(gòu),PPV4具有獨(dú)特的ORF3,其編碼1個(gè)功能未知的蛋白(類似“Y”或“T”形狀),但PPV1～PPV7基因組同源性較低[19](31.1%～37.0%)。這些PPV是否可引起豬群發(fā)病仍在探索中,基于此,需要引起人們的重視,對(duì)PPV1～PPV7持續(xù)監(jiān)測(cè)。

為了解河南省PPV1～PPV7流行現(xiàn)狀,本研究通過對(duì)河南省不同地區(qū)2021-2022年P(guān)PV1～PPV7進(jìn)行PCR檢測(cè),分析不同地區(qū)、季節(jié)、生長階段、樣品類型的流行情況及其與豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)混合感染的情況,以期為臨床診斷和疫病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病防控實(shí)驗(yàn)室從河南省豬場(chǎng)于2021-2022年送檢樣品中選取748份(有合樣),包括275份血樣、78份口腔液、406份肺脾淋巴結(jié),為臨床上有呼吸困難、厭食、高熱、咳嗽癥狀或檢出PCV2、PRRSV或無癥狀的豬樣品;PRRSV(cDNA)、PCV2核酸,由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病防控實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 2×TaqMaster Mix、DNA Marker,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品;T100TMPCR儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;全自動(dòng)樣品快速研磨儀Tissuelyser-48L,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品;天隆GeneRotex96核酸提取儀,西安天隆科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 通過對(duì)比分析NCBI數(shù)據(jù)庫中多條PPV1～PPV7的全基因組序列,找到各自保守區(qū)利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1),其中PCV2引物為本實(shí)驗(yàn)室保存設(shè)計(jì)序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物信息

1.2.2 樣品處理及核酸提取 將肺脾淋巴結(jié)剪碎,加入1 mL ddH2O用自動(dòng)研磨儀研磨3 min成勻漿后凍融3次;向口腔液中加入1 mL ddH2O置于渦旋儀混勻,然后肺脾淋巴結(jié)勻漿、口腔液、血樣均8 000 r/min離心3 min后取上清,利用GeneRotex96核酸提取儀及配套試劑盒自動(dòng)化程序完成核酸提取。

1.2.3 樣品檢測(cè) 以1.2.2中提取的核酸為模板,分別利用表1中相應(yīng)引物對(duì)748份樣品核酸進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL:2×TaqMaster Mix 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s(退火溫度參考表1),72 ℃ 30 s(擴(kuò)增片段>1 000 bp 時(shí),延伸時(shí)間為45 s),共29個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。電泳鑒定,將有目的條帶的確定為陽性。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 將樣品檢測(cè)結(jié)果輸入Excel軟件,分析6種PPV感染的情況,包括其在不同地區(qū)、季節(jié)、生長階段、樣品類型中的感染情況及6種PPV之間、其與PCV2、PRRSV混合感染的情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PPV1～PPV7經(jīng)特異性引物擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物電泳后,除PPV4未檢到陽性外,分別在約1 600、1 000、900、600、800、400 bp處觀察到目的條帶(圖1),與預(yù)期片段大小相符。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～6.依次為PPV1、PPV2、PPV3、PPV5、PPV6、PPV7 PC擴(kuò)增結(jié)果

2.2 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 PPV1～PPV7的檢測(cè)結(jié)果 對(duì)748份樣品檢測(cè)結(jié)果顯示,PPV2和PPV7的感染率較高,分別是16.04%(120/748)、15.11%(113/748),其次是PPV6為6.55%(49/748),PPV1、PPV3、PPV5的感染率均不到5%,分別為2.41%(18/748)、2.94%(22/748)、3.07%(23/748),其中365份樣品中未檢出PPV4。

2.2.2 不同地區(qū)6種PPV的感染情況 如圖2所示,PPV各型在河南省有廣泛的地理分布,總體上,豫南的感染率較高。各地區(qū)PPV2和PPV7的感染率均高于其他PPV,且除豫北外,PPV2的感染率均高于PPV7,豫南較明顯,豫西未檢出PPV3。豫北的樣品最多,但只有PPV3的感染率高于其他地區(qū),為5.29%(11/208),其他5種PPV的感染率均較低。

圖2 2021-2022年河南省不同地區(qū)PPV1/2/3/5/6/7感染情況

2.2.3 不同季節(jié)6種PPV的感染情況 按照春(3～5月)、夏(6～8月)、秋(9～11月)和冬(12月～次年2月)四季劃分,不同季節(jié)檢出結(jié)果見圖3。PPV各型一年四季均流行,PPV7秋季感染率最高,為23.96%(52/217),在春、夏、冬季PPV2的感染率相較于其他PPV高,夏季未檢出PPV5。

圖3 2021-2022年河南省不同季節(jié)PPV1/2/3/5/6/7感染情況

2.2.4 不同生長階段6種PPV的感染情況 不同生長階段檢測(cè)結(jié)果見圖4。不同生長階段豬群中PPV各型的感染率相差較大,從仔豬到育肥后期PPV各型整體呈現(xiàn)遞增態(tài)勢(shì)。在胎兒中,PPV2和PPV7的感染率較高,分別為8.79%(8/91)、7.69%(7/91),PPV3/5/6感染率較低,未檢測(cè)到PPV1;在仔豬中也發(fā)現(xiàn)了類似情況,PPV2的感染率最高,增加到15.69%,此階段未發(fā)現(xiàn)PPV1/3/5感染;PPV1/2/3/5/6/7的感染率逐漸上升,直到育肥后期,保育豬中PPV2感染率最高(19.84%,45/231),PPV7 次之(16.45%,38/231),育肥豬中PPV2 和PPV7感染均達(dá)到峰值,分別為20.34%(48/236)、24.58%(58/236);在母豬中,同樣均發(fā)現(xiàn)6種PPV感染,但整體較低,其中PPV2的感染率最高,為7.53%(11/146),其他PPV檢出率都不超過6%。

圖4 2021-2022年河南省各生長階段豬PPV1/2/3/5/6/7的感染情況

2.2.5 不同類型樣品6種PPV的感染情況 不同類型樣品檢測(cè)結(jié)果見圖5。PPV1/2/3/5/6/7在口腔液、血樣、肺脾淋巴結(jié)中均可檢出,口腔液和肺脾淋巴結(jié)檢出率較高?？谇灰褐袡z出率最高的是PPV2(23.08%,18/78),其次是PPV7(19.23%,15/78)。血樣中檢出率最高的是PPV2(9.45%,26/275),其次是PPV6(8.00%,22/275)。肺脾淋巴結(jié)中檢出率最高的是PPV7(20.94%,85/406),其次是PPV2(19.46%,79/406)。其他PPV檢出率都不超過8%。

圖5 2021-2022年河南省不同類型樣品PPV1/2/3/5/6/7的感染情況

2.2.6 混合感染情況 本研究分別統(tǒng)計(jì)了2021-2022年P(guān)PV1/2/3/5/6/7之間(表2,圖6)及與PCV2、PRRSV的混合感染情況。在PPV1/2/3/5/6/7之間混合感染情況研究中,未發(fā)現(xiàn)PPV單一感染,混合感染現(xiàn)象嚴(yán)重,多見于保育和育肥豬。相比于無癥狀豬樣品,PPV2更易在PPV7陽性樣品中檢出,共在32份樣品中發(fā)現(xiàn),除保育和育肥豬的組織樣品外,還在1份母豬口拭子、3份死胎、1份仔豬口拭子中檢出。PPV2、PPV7均可以與其他PPV混合感染,存在多重感染,雙重感染樣品數(shù)遠(yuǎn)高于三重、四重、五重感染。PPV2和PPV6的混合感染中,僅有1份在母豬血中檢出,其余均在保育和育肥豬的血或肺脾淋巴結(jié)中檢出。

圖6 PPV1/2/3/5/6/7之間混合感染情況

表2 PPV1/2/3/5/6/7之間混合感染情況

PPV1/2/3/5/6/7與PCV2混合感染率依次為4.17%(4/96)、26.04%(25/96)、6.25%(6/96)、6.25%(6/96)、8.33%(8/96)、37.50%(36/96)。其中PCV2陽性樣品中PPV的感染率高于陰性樣品,PPV7與PCV2混合感染最常見。PPV2、PPV7與PCV2的混合感染集中在保育和育肥豬,且多數(shù)豬只出現(xiàn)呼吸困難、發(fā)熱、咳嗽、厭食等癥狀,PPV2與PCV2的混合感染中育肥豬占比高出保育豬1倍。另外,此種感染偶見于拉稀仔豬,可從腸道和內(nèi)臟器官檢出。PPV1/3/5/6與PCV2混合感染及PPV3/5/6與PRRSV混合感染的豬只未見臨床癥狀,且未在仔豬中發(fā)現(xiàn)。PPV2、PPV7與PRRSV、PCV2的混合感染癥狀類似,PPV2與PRRSV的混合感染率(32.9 7%,30/91)高于PPV7與PRRSV(28.57%,26/91)。PPV1/3/5/6在PRRSV陽性樣品中的感染率低于PRRSV陰性樣品,其混合感染率依次為2.20%(2/91)、4.40%(4/91)、1.10%(1/91)、6.59%(6/91)。

3 討論

在病原核酸檢測(cè)中,PCR方法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”,本研究利用該方法檢測(cè)了748份樣品,從不同地區(qū)、季節(jié)、生長階段、樣品類型4個(gè)方面對(duì)7種PPV感染情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明,PPV1/2/3/5/6/7在河南省豬群中廣泛流行,PPV2(16.04%)的感染率最高,這與PPV2是全世界最普遍的PPV[12,22-25]的研究是一致的;PPV7(15.11%)感染率次之;未檢測(cè)出PPV4,可能在2021-2022年河南省未發(fā)生該病毒的廣泛傳播,也可能是所選檢測(cè)樣本中不含該型病毒。何玉[26]研究也發(fā)現(xiàn)在2013-2014年中國多個(gè)省市均未檢PPV4。Li J等[23]、Lagan Tregaskis P等[27]、Huang L等[28]及Afolabi K O等[10]也發(fā)現(xiàn)PPV4感染率極低的特點(diǎn)。樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)豫南PPV的檢出率高,豫北相對(duì)較低,秋、冬季的保育和育肥豬中較常見,這可能與地理位置及自然條件差別有關(guān)。趙潤澤等[30]研究湖北地區(qū)豬細(xì)小病毒流行情況,發(fā)現(xiàn)恩施地區(qū)感染率尤為高,同樣有同省不同地區(qū)檢出率差別大的現(xiàn)象。研究表明,PPV1主要危害初產(chǎn)母豬和血清學(xué)陰性的經(jīng)產(chǎn)母豬[22],PPV2～PPV7未成功分離培養(yǎng),其致病性暫不清楚。PPV1在保育、育肥豬中樣品中檢出,而在胎兒及仔豬中未檢出,這可能與母豬使用疫苗對(duì)該病毒阻斷及仔豬出生后獲得的母源抗體隨豬齡的增高而衰減有關(guān)。資料顯示,母豬抗體水平高是可以預(yù)防PPV1感染,而低的抗體水平可以減少感染豬的PPV1傳播[30],這說明了疫苗在很大程度上削弱了河南省PPV1的流行。

在患病保育和育肥豬的肺脾淋巴結(jié)中,PPV2/7檢出率較高,PPV6在血樣中檢出率較高,這一結(jié)果可能與不同型的PPV組織親嗜性不同有關(guān)。李厚偉等[31]研究發(fā)現(xiàn)PPV對(duì)豬腎臟、脾臟、淋巴結(jié)、妊娠母豬子宮的嗜性最強(qiáng),對(duì)肝臟的嗜性較弱。PPV2感染始于胎兒,并且隨著日齡增加感染率逐漸升高,育肥后期開始回落,與Kim S C等[12]、Milek D等[32]的研究結(jié)果一致。這一現(xiàn)象表明PPV2感染具有慢性特征,可以感染各個(gè)年齡段的豬,這可能是該型PPV檢出率高的重要原因。檢測(cè)結(jié)果表明,PPV7的感染與PPV2類似,同樣可以感染胎兒、哺乳仔豬保育豬育肥豬和成年豬,這與嚴(yán)美君等[33]研究結(jié)果一致。有資料表明,PPV7病毒具有相對(duì)廣泛的組織趨向性,在病豬的血清、肝臟、肺、腹股溝淋巴結(jié)、脾和腎臟中都能夠檢測(cè)到PPV7的存在[8],這可能是它檢出率高的因素。人們對(duì)PPV2及PPV7的致病性了解少、在引種和防控方面容易忽視它們也可能是傳播的另一原因。在本研究中檢出PPV2與PPV7的混合感染樣本比例大與之前研究的結(jié)果吻合。

本研究在樣本檢測(cè)PPV陽性樣品中,未發(fā)現(xiàn)單一感染,均是混合感染。有資料顯示,多數(shù)情況下,單獨(dú)感染PPV并不能引起未懷孕成年豬或仔豬產(chǎn)生臨床癥狀[34]。可能正是這個(gè)原因,養(yǎng)殖人員不能及時(shí)的進(jìn)行病原檢測(cè)與凈化,導(dǎo)致該病毒在豬群中廣泛傳播,待混合其他病毒感染才出現(xiàn)臨床癥狀。本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)PPV與PCV2或PRRSV混合感染率高,可能與PPV對(duì)有絲分裂活性組織的趨向性有關(guān)。PPV可能通過刺激宿主細(xì)胞分裂和酶的產(chǎn)生來増強(qiáng)PCV2與PRRSV的復(fù)制,也可能通過減少宿主免疫保護(hù)和刺激病毒感染同一宿主細(xì)胞來促進(jìn)PVC2或其他病原體的感染[35]。有報(bào)道稱PPV2和PRRSV感染有明顯的正相關(guān)趨勢(shì),PPV1～PPV7可作為PCV2復(fù)制的刺激因子,并加重PCV2相關(guān)疾病[12]。研究證實(shí),豬細(xì)小病毒本身能引起繁殖障礙,還可以與PCV2及PRRSV混合感染,與繁殖障礙性疾病有協(xié)同作用[36],與本研究結(jié)果一致。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果推測(cè)PPV2、PPV7并不直接導(dǎo)致母豬繁殖障礙而是與呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。這與Li J等[23]、Kim S C等[12]的研究結(jié)果吻合。

目前市場(chǎng)上暫未流通PPV2～PPV7疫苗,PPV2/3/5/6/7感染率較PPV1高且它們之間的同源性較低,這說明PPV1疫苗很難對(duì)PPV2～PPV7產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[1]。PPV1對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng),豬場(chǎng)一旦感染很難消除,最好的防控措施是接種疫苗。鑒于PPV1的防控經(jīng)驗(yàn),在PPV2～PPV7沒有疫苗的情況下,飼養(yǎng)人員應(yīng)當(dāng)切實(shí)做好豬舍通風(fēng)和定期消毒工作,阻斷病原微生物的感染與傳播,堅(jiān)持自繁自養(yǎng),確需引種的要做好監(jiān)測(cè)、消毒和隔離工作[37-38]。PPV與多種病原混合感染已是常態(tài),今后豬病的防控與凈化應(yīng)以多病原治理為思路。制定優(yōu)良的免疫程序,搭配科學(xué)的管理制度,強(qiáng)化疫病凈化,建立生物安全體系。就目前所知,本研究為首次對(duì)河南省PPV1～PPV7的檢測(cè)分析,可為河南省PPV防控提供新的參考。